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优化的蛋白质分析方法 非洲爪蟾 通过免疫印迹法分析卵母细胞和胚胎

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DOI：

10.3791/69139

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2025年9月19日

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1Department of Biomolecular Chemistry, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过免疫印迹法分析非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞和胚胎中蛋白质的实验方案。文中描述了样品采集步骤，随后详细说明了样品处理、SDS-PAGE 电泳、转膜、抗体染色及成像等操作流程。该方案重点在于利用内源性抗体以及针对蛋白质亲和标签的抗体，研究翻译调控相关的蛋白质复合物。

摘要

通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，再进行免疫印迹（western blotting），是分子生物学家工具箱中的关键实验方法。该技术可根据分子量分离复杂的蛋白质混合物，并利用特异性抗体检测目标蛋白质的存在。免疫印迹具有多种应用，例如可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的靶向分析，或作为对照手段验证目标蛋白的表达或耗竭情况。然而，免疫印迹实验操作复杂，涉及多个步骤，其方案需针对不同生物体、目标蛋白及具体应用进行优化。因此，在许多模式生物中，包括模式蛙Xenopus laevis，免疫印迹的应用仍存在知识空白。

由于其体积较大、生化实验所需材料丰富且操作简便，X. laevis 卵母细胞和胚胎在翻译调控机制的研究中发挥了重要作用。然而，该物种一直缺乏适用于高效且常规免疫印迹的特异性实验方案。本文提供了一种针对多个Xenopus发育阶段样品优化的蛋白质印迹（western blotting）详细实验方案，并进一步分析了发育过程中翻译调控因子的表达情况。

引言

理解细胞机制需要对特定蛋白质进行监测。常见的研究问题包括：这些蛋白质在空间和时间上的表达如何变化，它们与哪些蛋白质相互作用，以及在不同条件下是否发生修饰。免疫印迹（immunoblotting），俗称“Western blotting”，是解决这些问题的关键方法。免疫印迹实验可从复杂样品（例如全细胞裂解液）中分离蛋白质，并利用抗体对其进行鉴定。具体而言，蛋白质首先被变性，然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）按分子大小进行分离。分离后的蛋白质按大小片段转移至固相载体（如硝酸纤维素膜）上，再利用抗体试剂识别目标蛋白质。免疫印迹已成为分子生物学家常用技术工具的标准组成部分，广泛用于在不同条件下监测蛋白质表达水平，或作为免疫沉淀等实验的终点检测手段。尽管具有上述优势，利用免疫印迹分析稳态蛋白质水平仍具挑战性，因为该实验的每一步骤及实验条件均需针对具体情况进行优化（图1）。

一个具有挑战性的情境是分析来自非洲爪蟾的材料 非洲爪蟾。X. laevis 是研究RNA-蛋白质相互作用的重要模式生物。该系统具有多种优势，其中最主要的是 X. laevis 一次可产生数百个卵母细胞，并随后同步发育成胚胎。每个卵母细胞含有约25 µg的非卵黄蛋白1，为生化实验提供了丰富的材料。其较大的尺寸（约1250 µm）1 卵母细胞和胚胎的操作还便于大规模进行mRNA显微注射，以实现外源性表达带标签或突变的蛋白质2这些特性使得能够开展强有力的研究，以检测翻译调控过程 X. laevis, 例如锚定功能检测，该方法可检测翻译调控蛋白对 mRNA 的影响，而无需考虑该蛋白是否具有 RNA 结合能力3,4,5,6然而，免疫印迹在 非洲爪蟾 卵母细胞和胚胎的研究存在困难，包括这些早期细胞中大量卵黄小板的干扰7如果不除去，将会遮蔽结果。

本文介绍了一种在X. laevis中进行高效免疫印迹的优化方案，重点在于检测翻译调控蛋白。我们提供了从卵母细胞和胚胎的收集与处理到最终免疫印迹成像的完整操作指南。内容还包括蛋白质上样和成像的最佳条件详细说明，以及防止样品中卵黄污染的方法。此外，我们讨论了该方案可能的修改方式，以及筛选适用于Xenopus蛋白的抗体的策略。本研究旨在为研究人员提供指导，使其能够在此尚未被充分利用的模式生物中轻松开展免疫印迹实验。

显示样品制备、SDS-PAGE 和抗体孵育过程的非洲爪蟾免疫印迹流程图。
图 1：Xenopus 样品制备及后续免疫印迹分析的工作流程。 请点击此处查看此图的放大版本。

方案

本方案中涉及的所有动物（X. laevis）实验均符合威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理与使用委员会的规定，并已获得其批准。所用仪器、试剂及抗体浓度的详细信息见下文的材料表。部分仪器可参见下方的图2。

使用色谱法进行蛋白质纯化的过程；包括电泳装置和凝胶托盘。
图 2：用于免疫印迹的处理后胚胎提取物及相关设备。（A）经离心的X. laevis VI期卵母细胞提取物。脂类和脂溶性蛋白质上浮至顶部，而卵黄蛋白原（卵黄）和带色素的碎片则形成沉淀。（B）用于SDS-PAGE的设备，以按分子量分离蛋白质。（i）电源，（ii）垂直电泳槽，（iii）电泳槽盖，（iv）电极组件，（v）缓冲液挡板，（vi）预制电泳凝胶；注意顶部的绿色梳子和底部的蓝色标签，两者均需移除。（C）用于膜转移的设备。垂直电泳槽和槽盖在彻底冲洗后可重复用于转移。（i）滚轮（用于去除气泡），（ii）转移夹，（iii）小型搅拌子，（iv）夹在两张保护性蓝色纸片之间的硝酸纤维素膜，（v）纤维素层析滤纸，（vi）转移用海绵垫，（vii）用于转移组装的玻璃烤盘，（viii）冰袋，（ix）转移核心组件。（D）其他设备。（i）凝胶释放器（用于在转移前修整凝胶加样孔），（ii）凝胶盒开启杠杆，（iii）镊子（用于操作膜），（iv）容器（用于盛放膜），（v）容器盖。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 样品采集 非洲爪蟾 卵母细胞和胚胎

  1. 卵母细胞准备
    1. 从商业供应商（Ecocyte Bio Science，美国德克萨斯州奥斯汀）获取去滤泡的 X. laevis 卵母细胞，或按照文献8所述方法进行分离和去滤泡处理。
    2. 将分离的卵母细胞在改良巴氏溶液（MBS；88 mM NaCl、1 mM KCl、0.4 mM CaCl2、0.33 mM Ca(NO3)2、0.8 mM MgSO4、5 mM Tris-HCl、2.4 mM NaHCO3，pH 7.4）中培养至使用。
  2. 胚胎准备
    1. 按照文献9,10所述方法分离 X. laevis 卵子并进行受精。
    2. 将受精后的胚胎在0.25x Marc's改良林格氏溶液11（MMR）（1x MMR：0.1 M NaCl、2.0 mM KCl、1 mM MgSO4、2 mM CaCl2、5 mM HEPES）中培养。
    3. 配制含2%半胱氨酸的0.1x MMR溶液，并用NaOH调节pH至8.2。
    4. 移除受精所用培养皿中的0.25x MMR溶液，加入半胱氨酸溶液覆盖胚胎以去除胶状包膜12。轻轻混匀溶液，使胚胎均匀接触。
    5. 使用体视显微镜在2x至25x放大倍数下密切观察胚胎。当胶状包膜溶解后（通常需3–5分钟），胚胎会紧密聚集。避免胚胎长时间暴露于半胱氨酸溶液中。
    6. 移除半胱氨酸溶液，并用0.25x MMR多次冲洗胚胎。
    7. 将胚胎继续在0.25x MMR中培养至所需发育阶段。
  3. 将所需数量的胚胎或卵母细胞（建议每样本至少五个）收集至1.5 mL离心管中。
  4. 用移液器吸除多余培养液，注意避免损伤细胞。
  5. 立即使用样本，或保存于-80 °C备用。卵母细胞和胚胎可保存数年。

2. 准备 非洲爪蟾 提取

  1. 若样品已冷冻，请将其置于冰上解冻。
  2. 每枚胚胎或卵母细胞加入 10 µL 用双蒸水稀释至 1x 的预冷 10x 细胞裂解缓冲液（参见 材料表），并在冰上用微型研磨杵充分匀浆样品。
  3. 将样品在台式离心机中于 4 °C 下以 5000 g 离心 10 分钟，使包括卵黄和不溶性色素在内的碎片沉淀。
  4. 小心吸取上清液至另一支 1.5 mL 离心管中，注意避免触及沉淀物（图 2A）。
  5. 向上清液中加入等体积的含 5% w/v 2-巯基乙醇的 2x Laemmli 样品缓冲液，于 95–100 °C 沸水浴中加热 10 分钟，以变性样品中的蛋白质。
  6. 样品可立即使用，或于 -20 °C 保存数月乃至数年。

3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

  1. 配制 SDS 电泳缓冲液：1x Tris-MOPS-SDS 缓冲液（6.06 g Tris 碱，10.46 g 3-(N-吗啉代)丙磺酸 [MOPS]，1.0 g SDS，0.3 g 乙二胺四乙酸 [EDTA]，用双蒸水定容至 1000 mL）。
  2. 从包装中取出一块 4–12% bis-tris SDS 预制胶，撕掉胶底部的贴纸。
  3. 将凝胶插入电极组件中，对面放置缓冲液挡板。将电极组件放入垂直电泳槽中（图 2B）。
  4. 向电极组件及电泳槽底部加入 1x Tris-MOPS-SDS 电泳缓冲液。
  5. 轻轻拔出凝胶的梳子，并用移液器将运行缓冲液加入加样孔中，以去除气泡并平衡缓冲液。
  6. 小心地将 5 µL 预染蛋白标准品加入第一孔，其余各孔加入 10 µL 样品。
  7. （可选）在剩余的加样孔中各加入 10 µL 1x Laemmli 样品缓冲液，以使凝胶电泳运行更均匀。
  8. 盖上电泳槽盖子，并连接电源，施加 200 V 电压。
  9. 当样品缓冲液的染料前沿迁出凝胶时，停止电泳。

4. 蛋白质湿转印至膜上

  1. 在样品电泳的同时，配制 1 L 转膜缓冲液（3.0 g Tris 碱，4.08 g Bicine，900 mL 去离子水，100 mL 甲醇）。将转膜缓冲液预先在 4 °C 冷却。
    注意：浓甲醇应在通风橱中操作，避免接触皮肤。甲醇可用乙醇替代。
  2. 在电泳结束前，开始在转膜夹中组装转膜“三明治”结构（图 2C）。
    1. 用冷却的转膜缓冲液填充一个玻璃烤盘。在后续组装三明治结构的步骤中，确保所有材料均浸没于该缓冲液中。
    2. 将转膜夹放入盘中，黑色面紧贴盘底，白色面朝上打开，转膜夹开口朝左。
    3. 在转膜夹的黑色面上平铺一至两片纤维海绵。
    4. 将两张 0.35 mm 纤维素层析纸（滤纸）裁剪至合适尺寸，并将其中一张置于海绵之上。
  3. 电泳完成后，从电泳槽中取出凝胶。
  4. 使用凝胶夹释放杆小心地将凝胶板分开，确保凝胶仍附着在其中一块板上（图 2D）。使用凝胶释放器将凝胶顶部的加样孔切除。
  5. 将仍附着在塑料夹板一半上的凝胶放置在滤纸上。取下夹板的另一半，使凝胶保留在滤纸上。
  6. 裁剪一块 0.45 µm 硝酸纤维素膜，使其尺寸与凝胶匹配。从保护纸上取下膜，短暂浸入转膜缓冲液中润湿，然后放置在凝胶上。
    注意：请戴手套或使用镊子小心地仅从膜的角落处操作，以避免膜上蛋白质的非特异性污染。
  7. 在硝酸纤维素膜上覆盖第二张滤纸。使用滚轮在滤纸上轻轻但牢固地滚压，去除所有气泡。
  8. 在滤纸上再叠加一至两片纤维海绵。
  9. 闭合转膜夹并紧密夹紧，完成“三明治”结构。
  10. 将转膜三明治插入转膜芯中，转膜夹朝上，转膜夹的黑色面与转膜芯的黑色面对齐。
  11. 将转膜芯放入电泳槽中。在槽中放入冰袋和搅拌子，确保搅拌子可自由旋转。
    注意：除使用冰袋外，或可将步骤 4.13 中的转膜过程置于 4 °C 冷室中进行。
  12. 向电泳槽中加入冷却的转膜缓冲液，并牢固盖上盖子。
  13. 将转膜装置连接至电源，确保电极颜色对齐。在 4 °C 条件下，以 100 V 恒压运行 1 小时，同时保持搅拌子旋转。

5. 转膜后膜的处理

  1. 配制 10 倍浓度 Tris 缓冲盐水（100 mM Tris 碱；1.5 M NaCl）。调节 pH 至 8，并过滤除菌。
  2. 通过将 10 倍浓度 TBS 溶液按 1:10 比例稀释于 500 mL 去离子水中，并加入 500 µL Tween-20，配制 1 倍浓度含 Tween-20 的 Tris 缓冲盐水（TBSTw）。
  3. 配制封闭缓冲液（500 mL TBSTw，25 g 脱脂奶粉）。
    注意：封闭缓冲液中的脱脂奶粉可用 2–5% 牛血清白蛋白（BSA）替代。若实验涉及生物素化蛋白的检测，应使用 BSA，因为奶粉中含有生物素。
  4. 转膜完成后，小心取出并拆开夹层装置，取出硝酸纤维素膜。标记膜上与凝胶接触的一侧，并在后续步骤中始终保持该侧朝上。
  5. 配制 50 mL 丽春红染色液（0.5% 丽春红 S，1% 乙酸），用于蛋白质的可逆染色。
    警告：丽春红染色液具有腐蚀性，避免接触皮肤。
  6. 将膜放入一个小容器中（如 图 2D 所示），使其紧贴容器底部。加入足量丽春红染色液完全浸没膜，置于摇床上轻轻摇动染色 5–10 分钟。
  7. 倒掉丽春红染色液。
    注意：丽春红染色液可多次重复使用。
  8. 用去离子水反复漂洗膜，直至多余的染料被去除，条带中的蛋白条带开始清晰显现。
  9. 通过观察条带是否整齐、均匀且清晰分辨，确认转膜效率。
  10. 倒掉残留液体，将膜浸入封闭缓冲液中，以防止后续步骤中抗体非特异性结合至膜上。
  11. 室温下置于摇床上轻轻摇动封闭 30–60 分钟。

6. 抗体孵育

  1. 将一抗用10 mL新鲜封闭缓冲液稀释至所需浓度。
    注意：每种新抗体的最佳浓度需通过实验确定。通常起始浓度为1:1000，或按照生产商的建议进行。
  2. 移除封闭缓冲液，加入抗体混合液。在4 °C下轻轻振荡孵育过夜（约16 h）。
  3. 倒掉一抗溶液，通过将膜浸入TBSTw溶液中并快速倒掉的方式冲洗膜。
    注意：大多数抗体混合液可保存并重复使用2至3次，但需针对每种抗体通过实验确定。
  4. 将膜浸入TBSTw中，在室温下轻轻振荡洗涤5 min。共进行三次，每次5 min。
  5. 将二抗用30 mL TBSTw稀释至所需浓度。
    注意：每种抗体的浓度需通过实验确定。我们通常使用1:30,000的稀释比例。
  6. 倒掉TBSTw洗涤液，加入二抗混合液。在室温下轻轻振荡孵育45 min。
  7. 用TBSTw快速冲洗膜一次，随后进行三次每次5 min的TBSTw洗涤。

7. 在显影仪上对膜进行成像

  1. 在暗室中，打开胶片显影仪并预热。
  2. 裁剪两张足够大的塑料膜，以完全覆盖膜。用镊子将硝酸纤维素膜“正面朝上”放置在第一张塑料膜上。
  3. 在1.5 mL离心管中，等量混合增强型化学发光（ECL）鲁米诺试剂和增强剂试剂。使用1 mL混合液通常可覆盖大多数膜。
  4. 用移液器将ECL试剂滴加到膜上，并借助塑料膜轻轻移动膜以确保试剂均匀覆盖。孵育1分钟。
  5. 用镊子夹住膜，轻轻抖动或用膜的一角轻触纸巾，以去除多余的ECL试剂。
  6. 将膜正面朝上置于第二张塑料膜上，将塑料膜折叠覆盖在膜上，使其松散密封。用胶带将包裹好的膜牢固固定于放射自显影暗盒中。
  7. 在暗室中，将胶片放入暗盒内，覆盖住已固定的膜。紧密闭合暗盒，使胶片曝光1分钟。
  8. 小心取出胶片，注意避免已曝光的胶片与膜发生拖拽摩擦。将胶片送入显影仪中进行显影。
  9. 观察显影后的胶片，根据结果调整后续胶片的曝光时间，直至获得理想的蛋白信号图像。若蛋白信号较弱，可更换更灵敏的ECL试剂，重复ECL试剂孵育步骤并重新成像。
  10. 将显影后的胶片与发光标记对齐，以此为参照，在胶片上标记预染蛋白标准品在膜上的位置。
  11. 成像完成后，小心地从塑料膜上取下膜，并浸入TBSTw缓冲液中，以洗去残留的ECL试剂。

8. （可选）额外的抗体孵育

注意：免疫印迹的剥离（stripping）是指使用变性溶液（剥离缓冲液）去除初始的一抗和二抗，从而使印迹膜可被重新探测以检测不同抗体。通过重新探测，可在同一张免疫印迹膜上分析不同目标蛋白的表达情况，并将未知蛋白与作为标准的已知蛋白进行比较。应优先使用产生相对较弱信号的抗体进行首次探测。这样做可避免因后续步骤中抗体剥离不完全而造成假象，并减少因多次剥离导致的蛋白损失对结果的影响。

  1. 将膜浸入洗脱缓冲液中，轻轻摇动5-10分钟，以去除结合的抗体。
  2. 从洗脱缓冲液中取出膜，并在TBSTw中短暂漂洗，以去除残留的洗脱溶液。
  3. 将膜浸入封闭缓冲液中，轻轻摇动封闭30分钟。
  4. 用封闭缓冲液配制所需浓度的新的一抗溶液。
  5. 将新的一抗稀释液加入膜中，于4 °C轻轻摇动孵育过夜。
  6. 从步骤6.3开始继续操作。该膜最多可重复洗脱和重新杂交三次。

结果

为了展示我们免疫印迹实验方案的效率，我们分析了三种类型的 X. laevis 样品中带有亲和标签及内源性的翻译调控蛋白：VI 期卵母细胞、7 期胚胎（囊胚）以及 10.5 期胚胎（原肠胚）。选择这些发育阶段是因为它们涵盖了中囊胚转换期（8.5 期），该时期标志着合子转录的显著启动13,14。由于在中囊胚转换期之前的发育过程是在无转录条件下进行的，因此合子前（即母源控制的）胚胎高度依赖翻译调控机制，以在正确的时间和空间分辨率上表达细胞命运决定蛋白15。因此，中囊胚转换期是研究 RNA-蛋白质相互作用的关键背景。

为了通过免疫印迹分析蛋白质表达，将编码 X. laevis Bicaudal-C（Bicc1）C端一半并融合了3×血凝素（HA）亲和标签的 mRNA（500 pg）注射到 X. laevis 卵母细胞和胚胎中。我们选择分析 Bicc1 是因为其在 Xenopus 生物学及蛋白质-RNA 相互作用中的重要性。Bicc1 是一种 mRNA 结合蛋白和翻译抑制因子，在早期胚胎中指导细胞命运决定16,17,18。在后续发育过程中，它影响左右体轴的形成19,20,21 以及包括肾脏在内的器官功能22,23,24,25。Bicc1 含有一个介导翻译抑制的区域5，以及 hnRNP K 同源（KH）结构域，后者介导与特定 mRNA 的结合5,26,27,28。

从5个注射了HA-Bicc1的卵母细胞或胚胎中制备提取物，并以相应的未注射样本作为阴性对照。每个提取物的十分之一被上样至4-12%的梯度bis-tris凝胶进行电泳，并通过湿转法转移至硝酸纤维素膜上。膜的Ponceau染色用于检测总蛋白，证实转膜成功（图3A）。在本研究中，我们制备了一种兔源多克隆抗体，可识别人源Bicc1蛋白的C端半段。该抗体用于检测内源性和外源性的Xl-Bicc1蛋白（图3B）。先前研究表明，Bicc1蛋白在X. laevis卵母细胞中不存在，但在合子基因组激活之前的MBT前胚胎中表达16。这提示Bicc1 mRNA在卵子发生过程中积累，但其翻译受到抑制。与前述研究一致，我们在卵母细胞中未检测到内源性Bicc1蛋白。相反，该抗体在7期和10.5期胚胎中均检测到了内源性Bicc1蛋白（分子量约107 kDa）。综上，这些结果验证了该抗体能够特异性识别内源性Bicc1蛋白（图3B，上图，红色箭头）。在mRNA注射样本的提取物中，Bicc1抗体还识别出一个较小的蛋白（分子量约70 kDa）（图3B，上图，黑色箭头；比较第2、4、6泳道与第1、3、5泳道）。为验证Bicc1抗体的特异性，将膜剥离后重新用HA亲和标签抗体进行杂交。HA抗体在注射样本中识别出70 kDa的蛋白，但未识别到内源性Bicc1蛋白（图3B，第二图，黑色箭头）。由于不同细胞类型中注射mRNA的蛋白表达水平存在差异，HA-Bicc1 C端蛋白的检测信号强度在不同发育阶段有所变化。

接下来，我们通过检测与 Bicc1 相互作用的内源性翻译调控蛋白的表达来拓展研究结果。首先，我们分析了 Ccr4-Not 转录复合体亚基 1（Cnot1）的表达，该蛋白是一种大型支架蛋白，属于 Ccr4-Not 去腺苷化酶（CNOT）复合体的一部分。多亚基组成的 CNOT 复合体是真核生物中主要的去腺苷化酶之一，其主要功能是在信使 mRNA 降解前切除其末端的多聚（A）尾。然而，该复合体在翻译调控中具有多种功能，超出了去腺苷化的作用范畴29。我们关注 Cnot1 表达的检测，是因为 CNOT 复合体在 mRNA 调控中的重要性，以及先前已有研究报道 Cnot1 可与 Bicc1 相互作用20,30。为了分析 Cnot1 的表达，我们使用了一种可识别内源性 Cnot1 蛋白的抗体。该抗体在每个样本中均检测到分子量分别为 250 kDa 和 270 kDa 的两条蛋白条带，符合 Cnot1 的预测大小（图 3B，第三面板）。因此，本方案使我们能够轻松鉴定调控复合体中的一个关键组分。此外，该数据也支持本方案在成功鉴定高分子量蛋白方面的能力。

为了进一步验证这些结果的普适性，我们接下来分析了样本中是否存在一种重要的 DEAD-box 解旋酶——DEAD-box 解旋酶 6（Ddx6，此前在Xenopus中称为 xp54，在Drosophila中称为 me31b），该蛋白参与翻译抑制过程。Ddx6 是核糖核蛋白颗粒的重要组分，参与 mRNA 的储存，并与 Bicc1 和 Cnot1 相互作用6,31,32。针对内源性 Ddx6 的抗体在各样本中均识别出一个分子量约为 54 kDa 的蛋白（图 3B，第四泳道）。与先前报道一致33，合子胚胎中的表达量有所降低（图 3B，比较泳道 5 和 6 与泳道 1–4）。

最后，为了确保我们在样品间观察到的差异确实源于表达水平的不同，我们对免疫印迹膜进行了 stripping 处理，并使用识别甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）的抗体重新孵育。Gapdh 是一种普遍表达的“上样对照”。Gapdh 表达水平的一致性证实了丽春红染色结果：各样品间所分析的总蛋白量相等（图3B，第五个泳道）。

综上所述，这些结果证实了该免疫印迹方法的有效性。我们能够在多个与RNA-蛋白质相互作用研究相关的X. laevis发育阶段中鉴定出外源性和内源性Bicc1蛋白：包括仅含有母源沉积mRNA的卵母细胞和MBT前胚胎，以及还包含合子转录mRNA的MBT后胚胎。我们通过分析多种分子量不同的翻译调控蛋白（Bicc1、Cnot1和Ddx6）以及一种上样对照（Gapdh）的表达情况，进一步推广了这些结果。此外，我们还表明，通过适当调整以增加材料用量来弥补其较小的体积，该方案也可用于X. tropicalis胚胎（补充图1）。

Ponceau 染色与免疫印迹分析；蛋白质检测；实验结果；发育阶段比较。
图 3：通过免疫印迹法检测 X. laevis 中翻译调控蛋白的表达水平。（A）免疫印迹的 Ponceau 染色结果，用于显示来自 X. laevis VI 期卵母细胞、7 期胚胎和 10.5 期胚胎的总蛋白。每条泳道上样量为提取物中蛋白质的 10%（相当于 0.5 个卵母细胞或胚胎）。（B）对 VI 期卵母细胞、7 期胚胎和 10.5 期胚胎中选定的 X. laevis 翻译调控蛋白进行的免疫印迹分析。第 2、4 和 6 泳道为分析前显微注射了 HA-Bicc1 mRNA 的样品，而第 1、3 和 5 泳道为未注射的阴性对照。使用 α-Bicc1 抗体检测内源性 Bicc1 在不同发育阶段的表达情况（最上方图）。随后将膜剥离并用 HA 亲和标签抗体重新孵育，以验证 α-Bicc1 抗体的特异性（第二张图）。膜再次剥离后，分别使用 α-Cnot1（第三张图）和 α-Ddx6（第四张图）抗体对其他调控蛋白进行检测。α-Gapdh（最下方图）用于检测各泳道蛋白上样量是否一致。红色箭头指示内源性 Bicc1 蛋白的位置，黑色箭头指示外源表达的 HA-Bicc1 C 末端蛋白的位置。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：Xenopus laevis 与 Xenopus tropicalis 中 Bicc1 蛋白的免疫印迹分析。 使用抗Bicc1抗体检测不同量的 X. laevis 和 X. tropicalis 胚胎提取物中内源性和外源性Bicc1的表达。第1道：0.5个未注射的 X. laevis 胚胎。第2道：0.5个注射了HA-Bicc1的 X. laevis 胚胎。第3道：3个未注射的 X. tropicalis 胚胎。第4道：1个未注射的 X. tropicalis 胚胎。第5道：0.5个未注射的 X. tropicalis 胚胎。使用了两种识别内源性Bicc1的抗体：一种是针对人Bicc1制备的抗体（上图），另一种是针对 X. laevis Bicc1制备的抗体（中图）。抗Gapdh抗体（下图）用于检测各泳道蛋白上样量是否一致。请点击此处下载该文件。

讨论

尽管免疫印迹在概念上简单，但由于其涉及多个步骤且耗时数天，实际操作中往往较为困难。因此，获得稳定且高质量的结果常常具有挑战性。然而，免疫印迹是现代生物学中至关重要且广泛应用的技术之一。例如，免疫印迹对于确认显微注射的 mRNA 是否成功翻译并表达具有关键作用 X. laevis 卵母细胞和胚胎，强调其重要性 X. laevis 研究。此外，免疫沉淀实验利用免疫印迹来分析 体内 蛋白质-蛋白质相互作用。对特定蛋白质的有效检测在很大程度上取决于其丰度以及抗体检测试剂的质量。在本研究中，所分析内源性蛋白质的估计浓度范围相差近500倍 非洲爪蟾 卵母细胞（Bicc1：37.22 nM，Cnot1：115.08 nM，Ddx6：980.55 nM，Gapdh：17,907.26 nM）34，但所有目标均能被轻松检测到。在此范围以下，可根据需要对免疫印迹流程的几乎所有步骤——从样品收集到成像——进行优化，以提高检测的准确性和效率。

在任何免疫印迹实验中，选择何种类型的SDS-PAGE凝胶和膜都是关键考虑因素。根据我们的经验，预制胶比自行制备的凝胶更简便且重复性更好。预制胶还有一个额外优势，即可提供梯度胶形式，其聚丙烯酰胺浓度从上到下逐渐增加。梯度胶使研究人员能够分离和分析分子量差异较大的多种蛋白质，从而避免了常规实验中必须在低丙烯酰胺浓度凝胶（<7%）与高浓度凝胶（>12%）之间做出取舍的困境：前者适用于高分子量蛋白质的分离，而后者则更擅长分离低分子量蛋白质。此外，还需考虑使用硝酸纤维素膜（nitrocellulose）还是聚偏二氟乙烯（PVDF）膜进行蛋白转膜。两种膜的转膜机制及其优势已有广泛讨论35,36。简而言之，PVDF膜的蛋白结合能力高于硝酸纤维素膜，因此具有更高的检测灵敏度，并且更耐用，适合多次重复使用。然而，PVDF膜需要额外的处理步骤，例如用甲醇孵育进行活化，且成本更高。尽管我们发现两种膜均适用于大多数实验场景，但出于成本考虑，我们常规使用硝酸纤维素膜。

成像免疫印迹是该实验方案中的关键步骤。在此步骤中，研究人员必须谨慎操作，以获取既能传达所有必要信息又能将背景噪声降至最低的免疫印迹图像。针对标准的HRP标记抗体，主要有两种成像方法：X射线胶片或数字成像系统。根据我们的经验，使用X射线胶片成像具有诸多优势。X射线胶片通常比数字成像系统更灵敏，有助于检测低丰度蛋白。此外，X射线胶片可提供实验的物理记录，便于后续注释并以高分辨率进行数字化。然而，数字成像系统在线性范围——即信号强度与图像强度之间的关系——方面显著优于胶片显影系统。由于其高灵敏度，X射线胶片容易迅速过度曝光，导致定量信息丢失。因此，若研究人员需要对结果进行精确的定量分析，应使用数字成像系统，或特别注意避免X射线胶片显影过程中免疫印迹的过度曝光。

如果按照我们所述的方案进行免疫印迹后结果不理想，例如条带过弱或 "模糊的" 成像后若出现条带不理想的情况，可进行多种调整以优化结果。例如，可调整上样量 非洲爪蟾 可调整待分析的蛋白混合物上样量。仅需五分之一个胚胎的总蛋白即可获得清晰的结果，但每条凝胶泳道最多可上样多达两个胚胎或卵母细胞的蛋白量。上样过多蛋白可能导致成像时出现假象或非特异性高背景信号。此外，以较低电压（100 V）进行较长时间的电泳通常可获得更清晰的蛋白条带。同样，将蛋白转移步骤在4°C、低电压（30 V）条件下过夜进行，而非在100 V下进行1小时，可能有助于提高蛋白检测效果，尤其是对高分子量蛋白的检测。最后，某些一抗在室温下孵育1小时比在4°C过夜孵育能更有效地识别目标蛋白。该实验条件的调整需针对每种一抗进行优化验证。

鉴定可用于检测内源性蛋白的抗体是Xenopus免疫印迹实验中的一个主要挑战，因为市面上可获得的特异性针对Xenopus的抗体相对较少。研究人员可受益于一些非商业来源的Xenopus抗体，例如Xenbase37（https://www.xenbase.org/xenbase/）， 发育研究杂交瘤库（https://dshb.biology.uiowa.edu/），以及欧洲 Xenopus资源中心（https://xenopusresource.org/）。此外，针对人或小鼠蛋白开发的抗体在某些情况下也可能用于检测同源的 Xenopus蛋白，具体取决于用于抗体生产的区域在进化上的保守性。例如，本实验方案中使用的Bicc1抗体是针对人Bicc1蛋白制备的。对于此类试剂，其与Xenopus蛋白发生交叉反应的能力必须通过实验经验性地验证。尽管抗体公司通常不会公开其用于抗体生产的精确表位信息（属于商业机密），但许多公司可根据请求提供表位所对应的氨基酸范围。随后可将该区域与同源Xenopus蛋白的相应区域进行序列比对。虽然不能保证成功，但我们通常发现，当目标物种中用于抗体生产的表位与Xenopus中对应序列区域的相似度达到至少75%或更高时，实验成功率较高。在广泛使用针对非Xenopus蛋白制备的抗体之前，应对其进行验证，因为抗体验证不当是导致研究结果不可重复的主要原因之一38,39。验证方法之一是通过mRNA显微注射在胚胎中表达带有标签的目的Xenopus蛋白40。随后使用针对亲和标签的抗体对相同样品进行分析，以确认针对内源性蛋白的抗体与针对标签蛋白的抗体是否识别同一目标分子（如图3B所示）。

RNA结合蛋白的分析，特别是像Bicc1这类具有调控功能的蛋白，由于缺乏足够的试剂且强效调控分子通常表达水平较低，可能会非常困难。这一问题在免疫印迹中尤为明显，因为每种试剂都需要单独优化，而要找到具有足够特异性和灵敏度的抗体可能十分困难。本实验方案旨在解决在Xenopus中进行免疫印迹时存在的特定局限性，并详细阐述适用于其他系统的操作步骤，以帮助研究人员克服分析RNA结合蛋白时遇到的难题。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢 Laura Vanderploeg 制作图表，感谢 Bill Bement 实验室提供 非洲爪蟾 卵母细胞。我们还要感谢Marko Horb、Kelsey Coppenrath以及位于马萨诸塞州伍兹霍尔的海洋生物实验室国家爪蟾资源中心（National Xenopus Resource）提供 Xenopus tropicalis 胚胎。我们还要感谢Emily T. Johnson对本文稿提出的深刻见解。本研究受益于Xenbase（http://www.xenbase.org/；RRID: SCR_003280）的支持。Sheets实验室的工作由NICHD（R01HD091921）和NIGMS（R01GM152615）资助。Charlotte Kanzler由美国国立卫生研究院下属国家普通医学科学研究所的生物技术培训项目（T32GM135066）资助。 

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 平方英尺重型优质保鲜膜Saran2570000130
10 倍细胞裂解缓冲液Cell Signaling Technology#9803
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM3148
2 夸脱长方形烘焙/盛放盘Pyrex71160010116
2 倍 Laemmli 样品缓冲液Bio-Rad#1610737
抗 HA 高亲和力抗体Roche11867423001按说明书配制，使用稀释比例为 1:10,000。
抗兔 IgG HRP 标记抗体Cell Signaling Technology7074S使用稀释比例为 1:30,000。
自显影胶片暗盒，5 × 7 英寸Research Products International420057若使用数字成像系统则无需此物。
Bel-Art 一次性研磨杵Millipore SigmaBAF199230001
Bicaudal-C（人源）兔抗体Envigo Bioproducts（现为 Inotiv）N/A定制订购，使用稀释比例为 1:20,000。
Bicaudal-C（非洲爪蟾）兔抗体Envigo Bioproducts（现为 Inotiv）N/A定制订购，使用稀释比例为 1:20,000。参考文献：Park 等，2016。
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA3294封闭缓冲液中脱脂奶粉的替代物。
Centrifuge 5425 离心机Eppendorf13-864-456
CL-XPosure 胶片ThermoFisher Scientific34091若使用数字成像系统则无需此物。
CNOT1（D5M1K）兔单克隆抗体Cell Signaling Technology#44613使用稀释比例为 1:2,000。
DDX6/RCK（D26C11）兔单克隆抗体Cell Signaling Technology#8988使用稀释比例为 1:5,000。
E-Z 显影液储存与倾倒装MXR Imaging103633若使用数字成像系统则无需此物。
E-Z 定影液储存与倾倒装MXR Imaging114511若使用数字成像系统则无需此物。
GAPDH 单克隆抗体ProteinTech60004-1-Ig使用稀释比例为 1:40,000。
凝胶释放器Bio-Rad#1653320
山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗，HRP 标记InvitrogenA16066按说明书配制，使用稀释比例为 1:40,000。
冰袋，8 盎司，5 × 3 × 1"UlineS-18256
L-半胱氨酸Sigma-AldrichC7352
医用胶片处理器Konica MinoltaSRX-101A若使用数字成像系统则无需此物。
Mini-PROTEAN 胶盒开启杠杆Bio-Rad#4560000
Mini-PROTEAN 四通道垂直电泳槽Bio-Rad#1658004
MSE PRO 700 ml 蛋白质印迹电泳槽MSE SuppliesBB2369
硝酸纤维素膜，0.45 µmBio-Rad#1620115
脱脂奶粉Sanalac1570000180
辣根过氧化物酶标记的抗大鼠 IgG（H+L）纯化山羊抗体Jackson Immunoresearch112-035-003按说明书配制，使用稀释比例为 1:100,000。
聚山梨酯 20（吐温 20）Fisher BioreagentsBP337-500
丽春红 SVWR Life ScienceK793-500ML可用 0.5% 丽春红 S 和 1% 乙酸溶液近似配制。
PowerPac Basic 电源供应器Bio-Rad1645050
PR1MA 可调速二维摇床MidSciR2D-30
Precision Plus Protein 双色蛋白标准品梯度条带Bio-Rad#1610374可使用任意选择的蛋白 Marker。
纯纤维素层析滤纸，0.35 mmFisher Scientific05-714-4
Restore 蛋白质印迹 stripping 缓冲液ThermoFisher Scientific#21059
氯化钠Fisher ChemicalS640-10
300 mL 储存盒Rosti MepalRST46608用于硝酸纤维素膜的封闭、抗体孵育和洗涤
SuperSignal West Femto 高灵敏度底物ThermoFisher Scientific#34094一种增强型化学发光（ECL）底物，包含两种组分：鲁米诺和增强剂。该 ECL 试剂具有飞克级低检测限。
SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物ThermoFisher Scientific#34580一种增强型化学发光（ECL）底物，包含两种组分：鲁米诺和增强剂。该 ECL 试剂具有皮克至飞克级灵敏度。
SurePAGE Bis-Tris 10 × 8，4–12%，10 孔聚丙烯酰胺凝胶GenScriptM00652
转膜缓冲液粉末GenScriptM00652
Tris 碱超纯级USBiological77-86-1
Tris-MOPS-SDS 电泳缓冲液粉末GenScriptM00138

参考文献

  1. Gurdon, J. B., Wickens, M. P. The use of Xenopus oocytes for the expression of cloned genes. Methods Enzymol. 101, 370-386 (1983).
  2. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), (2010).
  3. Coller, J., Wickens, M. Tethered function assays: an adaptable approach to study RNA regulatory proteins. Methods Enzymol. 429, 299-321 (2007).
  4. Minshall, N., Allison, R., Marnef, A., Wilczynska, A., Standart, N. Translational control assessed using the tethered function assay in Xenopus oocytes. Methods. 51 (1), 165-169 (2010).
  5. Zhang, Y., Cooke, A., Park, S., Dewey, C. N., Wickens, M., Sheets, M. D. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
  6. Waghray, S., Williams, C., Coon, J. J., Wickens, M. Xenopus CAF1 requires NOT1-mediated interaction with 4E-T to repress translation in vivo. RNA. 21 (7), 1335-1345 (2015).
  7. Neff, A. W., Wakahara, M., Jurand, A., Malacinski, G. M. Experimental analyses of cytoplasmic rearrangements which follow fertilization and accompany symmetrization of inverted Xenopus eggs. Development. 80 (1), 197-224 (1984).
  8. Newman, K., Aguero, T., King, M. L. Isolation of Xenopus oocytes. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (2), (2018).
  9. Shaidani, N. -I., McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Obtaining Xenopus laevis eggs. Cold Spring Harb Protoc. 2021 (3), (2021).
  10. Shaidani, N. -I., McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Obtaining Xenopus laevis embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2021 (3), (2021).
  11. Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. Development. 77 (1), 15-37 (1983).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dejellying Xenopus laevis embryos. CSH Protoc. 2007, (2007).
  13. Zahn, N., et al. Normal table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), dev200356(2022).
  14. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  15. Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition: reprogramming of the cytoplasm and nucleus. Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).
  16. Park, S., Blaser, S., Marchal, M. A., Houston, D. W., Sheets, M. D. A gradient of maternal Bicaudal-C controls vertebrate embryogenesis via translational repression of mRNAs encoding cell fate regulators. Development. 143 (5), 864-871 (2016).
  17. Bull, A. L. Bicaudal, a genetic factor which affects the polarity of the embryo in Drosophila melanogaster. J Exp Zool. 161 (2), 221-241 (1966).
  18. Mohler, J., Wieschaus, E. F. Dominant maternal-effect mutations of Drosophila melanogaster causing the production of double-abdomen embryos. Genetics. 112 (4), 803-822 (1986).
  19. Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
  20. Minegishi, K., et al. Fluid flow-induced left-right asymmetric decay of Dand5 mRNA in the mouse embryo requires a Bicc1-Ccr4 RNA degradation complex. Nat Commun. 12 (1), 4071(2021).
  21. Maerker, M., et al. Bicc1 and Dicer regulate left-right patterning through post-transcriptional control of the Nodal inhibitor Dand5. Nat Commun. 12 (1), 5482(2021).
  22. Piazzon, N., Maisonneuve, C., Guilleret, I., Rotman, S., Constam, D. B. Bicc1 links the regulation of cAMP signaling in polycystic kidneys to microRNA-induced gene silencing. J Mol Cell Biol. 4 (6), 398-408 (2012).
  23. Kraus, M. R. -C., et al. Two mutations in human BICC1 resulting in Wnt pathway hyperactivity associated with cystic renal dysplasia. Hum Mutat. 33 (1), 86-90 (2012).
  24. Tran, U., et al. The RNA-binding protein Bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
  25. Bouvrette, D. J., Sittaramane, V., Heidel, J. R., Chandrasekhar, A., Bryda, E. C. Knockdown of Bicaudal C in zebrafish (Danio rerio) causes cystic kidneys: a nonmammalian model of polycystic kidney disease. Comp Med. 60 (2), 96-106 (2010).
  26. Mahone, M., Saffman, E. E., Lasko, P. F. Localized Bicaudal-C RNA encodes a protein containing a KH domain, the RNA binding motif of FMR1. EMBO J. 14 (9), 2043-2055 (1995).
  27. Dowdle, M. E., Park, S., Blaser Imboden, S., Fox, C. A., Houston, D. W., Sheets, M. D. A single KH domain in Bicaudal-C links mRNA binding and translational repression functions to maternal development. Development. 146 (10), dev172486(2019).
  28. Saffman, E. E., Styhler, S., Rother, K., Li, W., Richard, S., Lasko, P. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein Bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
  29. Chalabi Hagkarim, N., Grand, R. J. The regulatory properties of the Ccr4-Not complex. Cells. 9 (11), E2379(2020).
  30. Chicoine, J., Benoit, P., Gamberi, C., Paliouras, M., Simonelig, M., Lasko, P. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
  31. Kugler, J. -M., Chicoine, J., Lasko, P. Bicaudal-C associates with a Trailer Hitch/Me31B complex and is required for efficient Gurken secretion. Dev Biol. 328 (1), 160-172 (2009).
  32. Kamenska, A., et al. The DDX6-4E-T interaction mediates translational repression and P-body assembly. Nucleic Acids Res. 44 (13), 6318-6334 (2016).
  33. Ladomery, M., Wade, E., Sommerville, J. Xp54, the Xenopus homologue of human RNA helicase p54, is an integral component of stored mRNP particles in oocytes. Nucleic Acids Res. 25 (5), 965-973 (1997).
  34. Wühr, M., et al. Deep proteomics of the Xenopus laevis egg using an mRNA-derived reference database. Curr Biol. 24 (13), 1467-1475 (2014).
  35. Kurien, B. T., Dorri, Y., Dillon, S., Dsouza, A., Scofield, R. H. An overview of western blotting for determining antibody specificities for immunohistochemistry. Methods Mol Biol. 717, 55-67 (2011).
  36. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting: an introduction. Methods Mol Biol. 1312, 17-30 (2015).
  37. Fisher, M., et al. Xenbase: key features and resources of the Xenopus model organism knowledgebase. Genetics. 224 (1), iyad018(2023).
  38. Baker, M. Antibody anarchy: a call to order. Nature. 527 (7579), 545-551 (2015).
  39. Baker, M. Reproducibility crisis: blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  40. Martin, S. A., Page, S. J., Piccinni, M. Z., Guille, M. J. Confirming antibody specificity in Xenopus. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (12), (2020).

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