通过免疫印迹优化非洲 爪蟾 卵母细胞和胚胎中的蛋白质分析

了解细胞机制需要监测特定的蛋白质种类。常见的问题包括它们在空间和时间上的表达如何变化，它们与哪些蛋白质相互作用，以及它们是否根据不同的条件进行修饰。免疫印迹，俗称“蛋白质印迹”，是应对这些挑战的关键方法。免疫印迹实验从复杂样品（例如全细胞裂解物）中分离蛋白质，并使用抗体进行鉴定。具体来说，蛋白质变性，然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）按大小分离。将大小分离的蛋白质转移到固体载体（例如硝酸纤维素膜）上，并使用抗体试剂鉴定目标蛋白质。免疫印迹已成为分子生物学家工具包的标准组成部分。它通常用于监测不同情况下的蛋白质表达或作为免疫沉淀测定等实验的终点。尽管有这些优点，但事实证明，使用免疫印迹分析稳态蛋白质水平具有挑战性，因为必须针对每个步骤和实验环境优化测定（图 1）。

一个具有挑战性的背景是分析非洲爪蛙非洲爪蟾的材料。X. laevis 是研究 RNA-蛋白质相互作用的重要生物体。该系统具有许多优点，其中最主要的是 X. laevis 一次产生数百个卵母细胞，随后同步发育胚胎。每个卵母细胞含有~25μg非卵黄蛋白¹，为生化实验提供了丰富的材料。卵母细胞和胚胎的大尺寸（~1250μm）¹也有助于mRNA显微注射以^2尺度外源表达标记或突变的蛋白质。这些品质使强大的实验能够测定 X. laevis 的翻译控制，例如系留功能测定，其中可以测定翻译调节蛋白对 mRNA 的影响，而不管该蛋白的 RNA 结合能力如何 3,4,5,6。然而，非洲爪蟾卵母细胞和胚胎中的免疫印迹存在困难，包括这些早期细胞中大量卵黄血小板的干扰⁷，如果不去除，这将掩盖结果。

在这里，我们提出了一种优化的方案，用于在 X. laevis 中进行有效的免疫印迹，重点是检测翻译调节蛋白。我们提供有关如何收集和处理卵母细胞和胚胎以对最终免疫印迹进行成像的说明。还包括最佳蛋白质加载和成像以及防止样品蛋黄污染的详细说明。此外，我们还讨论了可能的方案修改和策略，以寻找与 非洲爪蟾 蛋白相容的抗体。我们打算为研究人员提供指导，以毫不费力地进行免疫印迹，作为他们自己在这种未充分利用的模式生物中实验的一部分。

图 1：非洲爪蟾样品制备和后续免疫印迹分析的工作流程。请点击此处查看此图的大图。

本协议中代表的所有动物 （X. laevis） 的工作均符合威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理和使用委员会的规定并已获得其批准。材料表列出了设备、使用的试剂和使用的抗体浓度的 详细信息。可以在下面的 图 2 中查看一系列设备。

图2：处理后的胚胎提取物和免疫印迹设备。 （A）离心的X . laevisVI 期卵母细胞提取物。脂质和脂溶性蛋白质上升到顶部，而卵黄原蛋白（蛋黄）和色素碎片形成颗粒。（B）SDS-PAGE按分子量分离蛋白质的设备。（i）电源，（ii）立式电泳槽，（iii）电泳槽盖，（iv）电极组件，（v）缓冲坝，（vi）预制电泳凝胶;请注意绿色梳子（顶部）和蓝色贴纸（底部），它们都必须去除。（C） 膜转移设备。垂直电泳槽和盖子在彻底冲洗后重复用于转移。（i）去除气泡的滚筒，（ii）转印夹，（iii）小搅拌棒，（iv）两张蓝色保护纸之间的硝酸纤维素膜，（v）纤维素色谱滤纸，（vi）转印海绵垫，（vii）用于转印组装的玻璃烤盘，（viii）冰袋，（ix）转印芯。（D） 其他设备。（i）凝胶释放器（用于修剪预转移凝胶孔），（ii）凝胶盒打开杆，（iii）镊子（用于处理膜），（iv）容器（用于保持膜），（v）容器盖。 请点击此处查看此图的大图。

1. 非洲爪蟾 卵母细胞和胚胎的收集

1. 卵母细胞制备
   1. 从商业供应商（Ecocyte Bio Science，德克萨斯州奥斯汀）获得去泡的 X. laevis 卵母细胞，或如所述⁸ 分离和去泡。
   2. 在改性巴特溶液（MBS;88 mM NaCl，1 mM KCl，0.4 mM CaCl 2,0.33 mM Ca（_{NO 3}）_2,0.8 mM MgSO_4,5 mM Tris-HCl，2.4 mM NaHCO_3，pH 7.4）中培养分离的卵母细胞，直至使用。
2. 胚胎准备
   1. 分离 X. laevis 卵并按所述 ^9,10 受精。
   2. 在0.25x Marc改良林格氏溶液¹¹ （MMR）（1x MMR：0.1 M NaCl，2.0 mM KCl，1 mM MgSO_4,2 mM CaCl_2,5 mM HEPES）中培养受精胚胎。
   3. 制备 0.1x MMR 中的 2% 半胱氨酸溶液，使用 NaOH 将 pH 值调节至 8.2。
   4. 从用于受精的培养皿中取出0.25x MMR，并用半胱氨酸溶液覆盖胚胎以去除果冻涂层¹²。轻轻混合溶液，使胚胎均匀暴露。
   5. 使用体视显微镜密切监测 2 倍至 25 倍放大倍率的胚胎。果冻涂层溶解后（通常为 3-5 分钟），胚胎将紧密地挤在一起。避免长时间接触半胱氨酸。
   6. 除去半胱氨酸溶液并用0.25x MMR冲洗胚胎多次。
   7. 在 0.25x MMR 中培养直至所需的生长阶段。
3. 在 1.5 mL 试管中收集所需数量的胚胎或卵母细胞（建议每个样品至少 5 个）。
4. 用移液器去除多余的培养基，避免损坏细胞。
5. 立即使用样品或储存在 -80 °C 直至使用。卵母细胞和胚胎可以储存数年。

2. 非洲爪蟾 提取物的制备

1. 如果冷冻，请在冰上解冻样品。
2. 每个胚胎/卵母细胞加入10μL冷冻的10倍细胞裂解缓冲液，用双倍去离子水稀释至1倍（ 参见 材料表），并在冰上用微粒均质化样品。
3. 在台式离心机中以 5000 g 的 4 °C 旋转样品 10 分钟，以沉淀碎屑，包括蛋黄和不溶性色素。
4. 将上清液取出到单独的 1.5 mL 管中，注意避开沉淀（图 2A）。
5. 向上清液中加入等体积的补充有 5% w/v 2-巯基乙醇的 2x Laemmli 样品缓冲液，并在 95-100 °C 下煮沸 10 分钟以使样品蛋白质变性。
6. 立即使用样品或在 -20 °C 下储存数月至数年。

3. SDS-页面

1. 制备SDS运行缓冲液：1x Tris-MOPS-SDS缓冲液（6.06 g Tris碱，10.46 g 3-（N-吗啉）丙磺酸[MOPS]，1.0 g SDS，0.3 g乙二胺四乙酸[EDTA]，双去离子水至1000 mL）。
2. 从包装中取出 4-12% bis-tris SDS 预制凝胶。撕下凝胶底部的贴纸。
3. 将凝胶插入缓冲坝对面的电极组件中。将电极组件放入垂直电泳槽中（图2B）。
4. 用 1x Tris-MOPS-SDS 运行缓冲液填充电极组件和电泳槽底部。
5. 轻轻地从凝胶中取出凝胶梳，并将运行缓冲液移液到孔中，以去除气泡并平衡缓冲液。
6. 小心地将 5 μL 预染色的蛋白质标准品加载到第一个孔中，将每个样品的 10 μL 加载到附加孔中。
7. （可选）用 10 μL 1x Laemmli 样品缓冲液加载剩余孔，以使凝胶运行更均匀。
8. 将盖子放在电泳槽上并将其连接到电源。施加 200 V。
9. 当样品缓冲染料正面离开凝胶时停止电泳。

4. 将蛋白质湿转移到膜上

1. 样品电泳时，准备 1 L 转印缓冲液（3.0 g Tris 碱、4.08 g bicine、900 mL 双去离子水、100 mL 甲醇）。将转印缓冲液在 4 °C 下预冷。
   注意：在通风橱中处理浓缩甲醇库存，避免接触皮肤。甲醇可以用乙醇代替。
2. 在电泳完成之前，开始在转印夹中组装转印“三明治”（图2C）。
   1. 用冷冻的转印缓冲液填充玻璃烤盘。在随后的夹层组装步骤中，确保材料浸没在此缓冲区中。
   2. 将转印夹放入盘中，黑色的一半靠在盘子底部，白色的一半打开并指向上方，转印夹向左打开。
   3. 将一两块纤维海绵平放在转印夹的黑色一半上。
   4. 将两张 0.35 毫米纤维素色谱纸（滤纸）切割成一定尺寸，并将一张放在海绵上。
3. 电泳完成后，从电泳槽中取出凝胶。
4. 用凝胶盒打开杆小心地撬开凝胶板，确保凝胶保持附着在其中一个板上（图2D）。用凝胶释放剂从凝胶顶部修剪孔。
5. 将仍附着在塑料盒的一半上的凝胶放在滤纸上。取出半盒，使凝胶留在滤纸上。
6. 切割一个正方形的0.45μm硝酸纤维素膜以适合凝胶的尺寸。从保护纸上取下膜，在转印缓冲液中短暂润湿，然后将其放在凝胶上。
   注意：用手套或镊子小心地处理膜的角落，以避免不必要的蛋白质污染膜。
7. 将第二张滤纸放在硝酸纤维素膜的顶部。使用滤纸顶部的滚筒轻轻但牢固地去除任何气泡。
8. 在滤纸顶部再叠一到两块纤维海绵。
9. 关闭传输盒并将其紧紧关闭，完成“三明治”。
10. 将转印夹层插入转印芯中，转印夹朝上，转印夹的黑色面朝向芯的黑色面。
11. 将转印芯放入电泳槽中。在罐中加入冰袋和搅拌棒，使搅拌棒可以自由旋转。
    注意：除了冰袋或代替冰袋外，还可以在步骤4.13中在4°C的冷藏室中进行转移。
12. 用冷冻的转印缓冲液填充罐。将盖子牢固地固定在顶部。
13. 将传输装置连接到电源，确保电极颜色对齐。在 4 °C 下运行 1 小时，100 V，搅拌棒旋转。

5、转印膜后处理

1. 制备 10x Tris 缓冲盐水（100 mM Tris 碱;1.5 M NaCl）。将 pH 值调节至 8 并过滤灭菌。
2. 通过在 500 mL 双去离子水中以 1：10 的比例稀释 10x TBS 溶液并加入 500 μL 吐温-20，制备 1x Tris 缓冲盐水和吐温-20 （TBSTw）。
3. 制备封闭缓冲液（500 mL TBSTw，25 g 脱脂奶粉）。
   注意：脱脂牛奶可以用封闭缓冲液中的2-5%牛血清白蛋白（BSA）代替。如果实验应用涉及可视化生物素化蛋白质，则应使用 BSA，因为牛奶含有生物素。
4. 转移完成后，小心地取出并拆卸三明治，并取下硝酸纤维素膜。标记膜的哪一侧与凝胶接触，并在后续步骤中保持这一侧朝上。
5. 制备 50 mL 丽春红染色剂（0.5% 丽春红 S，1% 乙酸），这是一种用于蛋白质可视化的可逆染色剂。
   注意：丽春红污渍具有腐蚀性。避免接触皮肤。
6. 将膜放入一个小容器中（如 图2D所示），使其与容器底部齐平。用丽春红染色剂覆盖膜，浸入水中，然后在摇杆上轻轻摇晃 5-10 分钟。
7. 倒掉丽春红污渍。
   注意：丽春红染色剂可以多次重复使用。
8. 用双去离子水反复洗涤膜，直到去除多余的丽春红并且泳道中的蛋白质条带开始分离。
9. 通过存在具有清晰解析波段的笔直、均匀的通道来确认传输效率。
10. 倒掉任何剩余的液体，将印迹浸入封闭缓冲液中，以防止非特异性抗体在下游步骤中与膜结合。
11. 在室温下在摇杆上轻轻摇晃 30-60 分钟。

6.抗体孵育

1. 将一抗在 10 mL 新鲜封闭缓冲液中稀释至所需浓度。
   注意：必须根据经验确定每种新抗体的最佳浓度。典型的起点是 1：1000，否则请遵循制造商的建议。
2. 取出封闭缓冲液并用抗体混合物代替。在4°C下孵育，轻轻摇动过夜（~16小时）。
3. 倒出一抗溶液，用TBSTw冲洗膜，将其浸入溶液中并快速倒出。
   注意：大多数抗体混合物可以保存并重复使用两到三次。这必须根据每种抗体的经验确定。
4. 将膜浸入TBSTw中并在室温下轻轻摇晃5分钟来洗涤膜。总共进行 3 次 5 分钟洗涤。
5. 将二抗在 30 mL TBSTw 中稀释至所需浓度。
   注意：必须根据经验确定每种抗体的浓度。我们通常使用 1：30,000。
6. 倒出TBSTw洗涤液，用二抗混合物代替。在室温下孵育，轻轻摇动 45 分钟。
7. 用 TBSTw 快速冲洗膜一次，然后进行 3 次 5 分钟的 TBSTw 洗涤。

7. 在胶片显影剂上对膜进行成像

1. 在暗室中，打开胶片显影剂并让其预热。
2. 剪下两个足够大的正方形保鲜膜以包围膜。使用镊子，将硝化纤维素膜“面朝上”放在保鲜膜的第一个正方形上。
3. 在 1.5 mL 试管中，混合等量的增强化学发光 （ECL） 鲁米诺和增强剂试剂。使用 1 mL 混合溶液应覆盖大多数膜。
4. 将 ECL 试剂移液到膜上，并使用保鲜膜轻轻纵膜，以确保完全覆盖。孵育1分钟。
5. 用镊子抓住膜并轻轻抖掉液体或通过将膜的一角接触纸巾吸走液体来去除多余的 ECL 试剂。
6. 将膜面朝上放在保鲜膜的第二个正方形上，然后将保鲜膜折叠在膜上，直到其松散密封。将包裹的膜牢固地粘在放射自显影盒中。
7. 在暗室中，在盒内放置一层薄膜，覆盖胶带膜。牢固地关闭盒并将薄膜暴露在膜上 1 分钟。
8. 小心地取下薄膜，小心不要将暴露的薄膜沿着膜拖动。将其送入胶片显影剂。
9. 评估显影胶片后，调整后续胶片的曝光时间，直到达到所需的蛋白质可视化。如果蛋白质可视化提供微弱信号，则使用更灵敏的 ECL 试剂重复 ECL 试剂孵育步骤并重新成像。
10. 将显影膜与夜光标记对齐，并使用此参考标记膜上预染色的蛋白质标准品的位置标记到膜上。
11. 成像完成后，小心地从保鲜膜上取下膜并将其浸入 TBSTw 中以洗掉剩余的 ECL 试剂。

8.（可选）额外的抗体孵育

注意：剥离免疫印迹是指用变性溶液（剥离缓冲液）去除初始一抗和二抗，以便可以用不同的抗体重新探测印迹。重新探测允许分析相同的免疫印迹以检测不同蛋白质靶标的表达，并将未知蛋白质与用作标准品的充分表征的蛋白质进行比较。首先使用产生相对最弱信号的抗体进行探测。这样做可以防止在后续暴露中因抗体不完全剥离而引起的伪影，并最大限度地减少因重复剥离印迹而导致蛋白质损失的影响。

1. 通过将膜浸入剥离缓冲液中并轻轻摇晃 5-10 分钟来剥离结合的抗体。
2. 从剥离缓冲液中取出膜，并在TBSTw中短暂冲洗以去除任何残留的剥离溶液。
3. 将膜浸入封闭缓冲液中并轻轻摇晃 30 分钟。
4. 在封闭缓冲液中制备所需浓度的新一抗溶液。
5. 将新的一抗稀释液加入膜中，并在 4 °C 下轻轻摇晃孵育过夜。
6. 从步骤 6.3 开始。膜可以剥离并重新探测最多三次。

为了证明我们的免疫印迹方案的有效性，我们分析了三种类型的 X. laevis 样本中的亲和标记和内源性翻译对照蛋白：VI 期卵母细胞、7 期胚胎（囊胚）和 10.5 期胚胎（原肠胚）。选择这些阶段是因为它们跨越囊胚中部转变（阶段 8.5），这标志着稳健的合子转录的开始13,14。由于囊胚中转化之前的发育发生在没有转录的情况下，因此合子前（即母体控制）胚胎严重依赖翻译控制机制以正确的时间和空间分辨率表达细胞命运蛋白15。因此，囊胚中转化是研究 RNA-蛋白质相互作用的重要背景。

为了通过免疫印迹分析蛋白质表达，将 X. laevis 卵母细胞和胚胎注射 500 pg mRNA，该 mRNA 编码 X. laevis Bicaudal-C （Bicc1） 的 C 端一半融合到 3x 血凝素 （HA） 亲和标签。我们选择分析 Bicc1 是因为它与非洲爪蟾生物学和蛋白质-RNA 相互作用相关。Bicc1 是一种 mRNA 结合蛋白和翻译阻遏物，可指导早期胚胎的细胞命运决定 16,17,18。在发育后期，它会影响左右模式 19,20,21 和器官的功能，包括肾脏 22,23,24,25。Bicc1 包含一个指导翻译抑制5 和介导与特定 mRNA 结合的 hnRNP K 同源 （KH） 结构域的区域 5,26,27,28。

从五个注射的 HA-Bicc1 卵母细胞或胚胎中制备提取物，以及相应的未注射样品作为阴性对照。将每种提取物的十分之一电泳在4-12%梯度的双三聚糖凝胶上，并湿转移到硝酸纤维素膜上。对膜进行丽春红染色以检测总蛋白，确认成功转移（图3A）。作为我们研究的一部分，我们在兔子中产生了一种抗体，该抗体可以识别人类 Bicc1 蛋白的 C 端一半。该抗体用于检测内源性和外源性 Xl-Bicc1 蛋白（图 3B）。先前的研究表明，Bicc1 蛋白在 X. laevis 卵母细胞中不存在，但在合子基因组活跃之前在 MBT 前胚胎中表达16。这表明，虽然 Bicc1 mRNA 在卵子发生过程中积累，但它被翻译抑制。与之前的工作一致，在卵母细胞中未检测到内源性 Bicc1。相比之下，该抗体在 7 期和 10.5 期胚胎中识别内源性 Bicc1 （~MW 107 kDa）。综上所述，这些结果验证了抗体识别内源性Bicc1蛋白（图3B，上图，红色箭头）。Bicc1 抗体在从 mRNA 注射样品制备的提取物中识别出一种较小的蛋白质，约为 70 kDa（图 3B，上图，黑色箭头，将泳道 2、4 和 6 与泳道 1、3 和 5 进行比较）。作为Bicc1抗体特异性的对照，剥离膜并用针对HA亲和标签的抗体重新探测。HA抗体鉴定了注射样品中的70 kDa蛋白，但未识别内源性Bicc1（图3B，第二幅，黑色箭头）。由于不同细胞类型中注射的 mRNA 的蛋白质表达存在差异，HA-Bicc1 C 项的检测强度在不同阶段有所不同。

接下来，我们通过测试与 Bicc1 相互作用的内源性翻译调节蛋白的表达来扩展结果。首先，我们分析了 Ccr4-Not 转录复合物亚基 1 （Cnot1） 的表达，这是一种大型支架蛋白和 Ccr4-Not 去烯酰化酶 （CNOT） 复合物的一部分。多亚基 CNOT 复合物是主要的真核致丹化酶之一，主要以修剪信使 mRNA 末端的 poly（A） 尾部而闻名，作为其降解的前奏。然而，这种复合物在翻译控制中具有多种作用，超出了去烯化29。由于 CNOT 复合物对 mRNA 调节的重要性以及之前观察到 Cnot1 与 Bicc1 相互作用，我们对测定 Cnot1 表达感兴趣20,30。为了分析 Cnot1 表达，我们使用了一种识别内源性 Cnot1 蛋白的抗体。它在每个样品中鉴定出两种 250 kDa 和 270 kDa 的蛋白质，即 Cnot1 的预测大小（图 3B，第三张图）。因此，该协议使我们能够轻松识别监管复合体的关键组成部分。此外，这些数据支持该协议成功识别高分子量蛋白质的能力。

为了进一步测试这些结果的普遍性，我们接下来分析了样品中是否存在参与翻译抑制的突出 DEAD-box 解旋酶 DEAD-box 解旋酶 6（Ddx6，以前在非洲爪蟾中称为 xp54，在果蝇中称为 me31b）。Ddx6是核糖核蛋白颗粒的重要组成部分，参与mRNA储存，并与Bicc1和Cnot1相互作用6,31,32。识别内源性 Ddx6 的抗体在每个样品中鉴定出约 54 kDa 的蛋白质（图 3B，第四个面板）。如前所述，合子胚胎中的表达减少（图3B，将泳道5和6与1-4进行比较）33。

最后，为了确保我们在样品之间观察到的差异是由于表达差异造成的，我们剥离并使用识别甘油醛 3-磷酸脱氢酶 （Gapdh） 酶的抗体重新探测免疫印迹。Gapdh 充当无处不在的“加载控制”。等效水平的Gapdh表达证实了丽春红染色：正在分析样品中等量的总蛋白（图3B，第五个面板）。

总之，这些结果证实了这种免疫印迹方法的有效性。我们能够在与 RNA-蛋白质相互作用研究相关的多个 X. laevis 发育阶段识别出外源性和内源性 Bicc1：卵母细胞和 MBT 前胚胎，仅包含母体沉积的 mRNA，以及 MBT 后胚胎，其中还包括合子转录的 mRNA。我们能够通过分析多种翻译对照蛋白在各种分子量（Bicc1、Cnot1 和 Ddx6）和负载对照（Gapdh）下的表达来推广这些结果。我们还表明，该协议可用于热 带X. 胚胎，并进行修改以增加使用的材料量，以解释其较小的尺寸（补充图1）。

图 3：通过免疫印迹鉴定 X. laevis 中的翻译调节蛋白水平。 （A） 免疫印迹的丽春红染色，以鉴定来自 X. laevis VI 期卵母细胞、7 期胚胎和 10.5 期胚胎的总蛋白。每条泳道代表从提取物（0.5 个卵母细胞或胚胎）制备的蛋白质的 10%。（B）VI期卵母细胞、7期胚胎和10.5期胚胎中选定的 X. laevis 翻译调节蛋白的免疫印迹分析。泳道 2、4 和 6 对应于分析前显微注射 HA-Bicc1 mRNA 的样品，而泳道 1、3 和 5 用作阴性（未注射）对照。α-Bicc1抗体用于检测内源性Bicc1的跨阶段表达（上图）。随后剥离印迹并用 HA 亲和标签抗体重新探测，作为 α-Bicc1 抗体特异性的对照（第二组）。使用α-Cnot1（第三组）和α-Ddx6（第四组）剥离印迹并重新探测其他调节蛋白。α-Gapdh（下图）用作相等蛋白质负载的对照。红色箭头标记内源性Bicc1的位置，而黑色箭头标记外源性表达的HA-Bicc1 C-term的位置。 请点击此处查看此图的大图。

补充图1： 非洲爪蟾 与 热带非洲爪蟾中Bicc1蛋白的免疫印迹分析。 采用α-Bicc1抗体测定不同量的 拉氏X.laevis 和 热带X.tropicalis 胚胎提取物中内源性和外源Bicc1的表达。泳道 1：0.5 个未注射的 X. laevis 胚胎。泳道 2：注射 0.5 HA-Bicc1 的 X. laevis 胚胎。泳道 3：3 个未注射的 X. tropicalis 胚胎。泳道 4：1 个未注射的 X. tropicalis 胚胎。泳道 5：0.5 未注射的 X. tropicalis 胚胎。使用了两种识别内源性 Bicc1 的抗体：一种针对人 Bicc1 升高（上图），另一种针对 X. laevis Bicc1 升高（中图）。α-Gapdh（下图）用于控制相等的蛋白质负载。 请点击此处下载此文件。

作者没有需要披露的利益冲突。