一种从鼠心脏组织分离内体并与心肌细胞共培养的创新方法

摘要

内体是一类参与内吞膜运输途径的细胞内分选细胞器。我们建立了一种利用自动纳米过滤设备从心脏组织中分离内体的新方法，并通过将内体与原代心肌细胞共培养，研究了细胞对内体的摄取情况。

摘要

内体是膜结合细胞器，在细胞内运输、信号转导和膜循环中发挥关键作用。尽管其在心血管生物学中的功能正逐渐受到重视，但从心脏组织中高效分离内体仍是一项重大的技术挑战。我们开发了一种快速且高得率的小鼠心脏组织内体分离方案，该方法结合了亚细胞组分分离与超快速纳米过滤分离平台。本方法包括连续离心、纳米过滤以及基于纳米多孔膜的囊泡回收步骤。通过蛋白质印迹、动态光散射（DLS）和纳米流式细胞术（NanoFCM）分析对分离得到的内体进行表征。为评估其生物活性，将纯化的内体与原代新生心肌细胞共培养。结果显示，内体标志物EEA1和Rab7在分离的囊泡中高度富集。DLS分析显示囊泡平均直径为187.30 ± 23.42 nm，zeta电位为-26.60 ± 5.79 毫伏（n = 12）。NanoFCM 定量结果约为 1.07 ± 0.31 × 10¹² 颗粒/mL（n = 12）来自100 毫克心脏组织。在心肌细胞中观察到内体的功能性摄取。 体外 共培养，表明囊泡的完整性和活性得以保持。该整合式分离平台为从心脏组织中提取高纯度的内体提供了一种可重复且高效的方法。本方案有助于后续的生物化学和功能研究，为探讨内体在心血管生理与疾病中的作用提供了有价值的工具。

引言

内体是重要的细胞内细胞器，可调控内吞作用、货物分选以及信号通路^1，2。活化的信号受体及其他下调蛋白最初被分选至早期内体（EEs）内的腔内小泡（ILVs）中，随后早期内体成熟为多泡体（MVBs）或内体运输小泡（ECVs）。这些小泡进一步与晚期内体（LEs）融合，晚期内体作为次级分选中心，将货物定向输送至溶酶体降解或其它替代通路。当内体与质膜融合后，腔内小泡还可能作为外泌体被释放到细胞外^3，4。与此同时，自噬途径通过自噬小体将胞质物质运送至晚期内体，自噬小体在与晚期内吞区室融合后获得降解能力⁵。目前认为，内体在受体再循环⁶、离子通道定位⁷、外泌体生成⁸以及细胞间通讯⁹等过程中发挥关键调控作用，这些过程在神经元和心肌细胞等特化细胞中尤为重要。

新兴证据凸显了内体通路在心血管功能中的关键作用。Eps15同源结构域蛋白3（EHD3）可调控多种重要心脏离子转运蛋白的内体再循环，包括Na⁺/Ca

方案

所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院关于实验动物使用指南，并经休斯顿大学机构动物护理和使用委员会批准。

注意：在开始分离操作之前，必须确保所有所需缓冲液均已新鲜配制并冷却至 4 °C。无菌器械、组织培养板和适当的离心管应放置在指定的工作站上，所有材料除非另有说明，均需保持在冰上或 4 °C 环境中。离心机及转子必须在使用前预先在 4 °C 平衡至少 2–3 小时。分步提取缓冲液应在实验前一天配制，并于 4 °C 保存，在实验过程中使用前需置于冰上。除非另有说明，所有孵育和离心步骤均应在 4 °C 下进行。

1. 心脏裂解液的制备

1. 使用70%乙醇对手术区域进行消毒，随后在工作台面上放置无菌吸水垫，并将已灭菌的外科器械有序摆放于其上。
2. 通过吸入CO₂（10-30% CO₂，持续3-5分钟）或经相关机构动物护理与使用委员会批准的其他方法处死小鼠（C57BL/6雄性，8-12周龄，20-25 g；mCherry: NumbKI雄性，8-12周龄，20-25 g）。
   警告：请在通风良好的开放空间内操作，并确保CO₂气瓶及时关闭以防止泄漏。在处死过程中应持续监测小鼠，确认其意识丧失并完成正确操作流程。一旦小鼠失去意识，应采用二次确认死亡的方法，如颈椎脱位、开胸术或放血法，以确保....

结果

我们检测了五个组别中早期内体、晚期内体、溶酶体和自噬体标志物的表达水平：心脏组织裂解液、核组分、线粒体组分、来自步骤2.6和3.6的其他细胞内囊泡，以及来自步骤2.5和3.6的内体。图2A、B显示，EEA1（早期内体抗原1）在内体中的表达水平最高，在其他组别中几乎不表达。Rab7在内体中的表达水平也最高（图2A、C），而Lamp1和LC3在其他细胞内囊泡中的表达水平最高（图2A、D、E）。多项先前研究已证实，EEA1主要定位于早期内体¹⁹，具体位于内体膜的胞质面²⁰。Rab7主要定位于晚期内体，在内吞途径中发挥关键作用，特别是在货物从晚期内体向溶酶体转运过程中^21,

讨论

本研究中，我们介绍了一种结合亚细胞分级分离与超快速分离平台，从小鼠心脏组织中快速、可重复地分离高纯度早期内体的方法¹⁴。传统的内体分离方法，如密度梯度离心¹²或免疫分离法，通常耗时耗力，且需要大量组织样本或特异性抗体。通过将机械匀浆方案与纳米过滤技术相结合，我们显著简化了分离流程，同时保持了内体囊泡的理化特性和分子完整性。

该实验的成功依赖于多个关键步骤。初始组织匀浆和温度控制下的离心对于维持细胞器完整性以及富集囊泡组分至关重要。在基于EXODUS的分离步骤¹⁴中需谨慎操作，特别是在膜清洗和囊泡洗脱过程中，这对于最大化回收率和纯度尤为关键。

该方案具有可适应性，可根据实验需求进行调整。例如，可根据下游应用选择性地保留或去除特定的细胞内组分（如细胞核或线粒体组分）。故障排除策略包括优化匀浆次数以提高得率，调整离心参数以实现更清晰的分离，以及稀释样品以防止过滤过程中膜堵塞。此外，逐步解冻内.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
µ-Slide 8 孔高底培养板	ibidi	80806-90
1.5 mL 带刻度微量离心管	USA Scientific	1615-5500
10x Tris/甘氨酸缓冲液	Bio Rad	1610734
4x Laemmli 样品缓冲液	Bio Rad	1610747
台式离心机	Eppendorf	Eppendorf Centrifuge 5810R
牛血清白蛋白	Sigma	A9418
细胞筛	Corning	CLS431750	孔径 40 μm，无菌
CELLSTAR 组织培养皿	VWR	82050-546	聚苯乙烯，无菌，60 mm ´ 15 mm
ChemiDoc 成像系统	Bio Rad	ChemiDoc XRS+
清洗液	NanoFCM	17159
用于 Pierce 原代细胞分离试剂盒的 DMEM	Fisher Scientific	PI88287
DTT	Fisher Scientific	BP172
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 (PBS)	Thermo Scientific	10010023
ECL 蛋白印迹检测试剂	Bio Rad	1705061
EDTA	Sigma	E4884
EEA1	Cell signaling	3288S	WB (1:1000)
EGTA	Sigma	E-4378-25
EID	EXODUS	MA03 EID
ERp72	Cell signaling	5033S	WB (1:1000)
乙醇	UH 研究用品库		200 证明，5 加仑
EXODUS H-600	EXODUS	H-600
GAPDH	Proteintech	10494-1-AP	WB (1:5000)
Hank’s 平衡盐溶液 (HBSS)	Thermo Scientific	14175095
HEPES	Sigma	H3375
匀浆器	Fisher Scientific	15340167
KCl	Sigma	P3911
Lamp1	Abcam	ab320851	WB (1:2000)
LC3	Cell signaling	2775S	WB (1:1000)
Litesizer 500	Anton Paar	Litesizer 500	其他设备如 Zetasizer (Malvern) 或 DLS  (Wyatt) 也可使用
mCherry	Biorbyt	orb66657	WB (1:500)
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
NaCl	Sigma	S7653
NanoFCM	NanoFCM	Flow NanoAnalyzer
纳米球尺寸标准品	Thermo Scientific	3020A
Nikon AXR 共聚焦显微镜	Nikon	AXR
4% 多聚甲醛 PBS 溶液	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
鬼笔环肽标记探针	Invitrogen	A22284	IF (1:500)
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific	23227
Pierce 原代心肌细胞分离试剂盒	Thermo Scientific	88028
聚醚砜注射器滤器	Millipore	SLHPR33RS	孔径 0.45 μm，无菌
预制蛋白凝胶	Bio Rad	4561093
质控微球	NanoFCM	QS2503
Rab7	Cell signaling	9367S	WB (1:1000)
RIPA 裂解与提取缓冲液	Thermo Scientific	89900
Roche PhosSTOP（蛋白酶抑制剂混合物）	Roche	4906837001
二氧化硅纳米球	NanoFCM	S16M-Exo
蔗糖	Sigma	84097
摆动转子	Beckman Coulter	SW55Ti
Trans-Blot Turbo 转膜系统 RTA 转膜试剂盒	Bio Rad	1704270
Tween 20	Bio Rad	1662404
超速离心机	Beckman Coulter	Optima XE-90
超速离心管	Beckman Coulter	326819
超声波清洗仪	Branson Ultrasonics	CPX952238R
VWR 50 mL 离心管	VWR	89039-656
VWR 15 mL 离心管	VWR	89039-666
Zeta 电位标准物质	Anton Paar	175108