一种从鼠心脏组织分离内体并与心肌细胞共培养的创新方法

摘要

内体是一类参与内吞膜运输途径的细胞内分选细胞器。我们建立了一种利用自动纳米过滤设备从心脏组织中分离内体的新方法，并通过将内体与原代心肌细胞共培养，研究了细胞对内体的摄取情况。

摘要

内体是膜结合细胞器，在细胞内运输、信号转导和膜循环中发挥关键作用。尽管其在心血管生物学中的功能正逐渐受到重视，但从心脏组织中高效分离内体仍是一项重大的技术挑战。我们开发了一种快速且高得率的小鼠心脏组织内体分离方案，该方法结合了亚细胞组分分离与超快速纳米过滤分离平台。本方法包括连续离心、纳米过滤以及基于纳米多孔膜的囊泡回收步骤。通过蛋白质印迹、动态光散射（DLS）和纳米流式细胞术（NanoFCM）分析对分离得到的内体进行表征。为评估其生物活性，将纯化的内体与原代新生心肌细胞共培养。结果显示，内体标志物EEA1和Rab7在分离的囊泡中高度富集。DLS分析显示囊泡平均直径为187.30 ± 23.42 nm，zeta电位为-26.60 ± 5.79 毫伏（n = 12）。NanoFCM 定量结果约为 1.07 ± 0.31 × 10¹² 颗粒/mL（n = 12）来自100 毫克心脏组织。在心肌细胞中观察到内体的功能性摄取。 体外 共培养，表明囊泡的完整性和活性得以保持。该整合式分离平台为从心脏组织中提取高纯度的内体提供了一种可重复且高效的方法。本方案有助于后续的生物化学和功能研究，为探讨内体在心血管生理与疾病中的作用提供了有价值的工具。

引言

内体是重要的细胞内细胞器，可调控内吞作用、货物分选以及信号通路^1，2。活化的信号受体及其他下调蛋白最初被分选至早期内体（EEs）内的腔内小泡（ILVs）中，随后早期内体成熟为多泡体（MVBs）或内体运输小泡（ECVs）。这些小泡进一步与晚期内体（LEs）融合，晚期内体作为次级分选中心，将货物定向输送至溶酶体降解或其它替代通路。当内体与质膜融合后，腔内小泡还可能作为外泌体被释放到细胞外^3，4。与此同时，自噬途径通过自噬小体将胞质物质运送至晚期内体，自噬小体在与晚期内吞区室融合后获得降解能力⁵。目前认为，内体在受体再循环⁶、离子通道定位⁷、外泌体生成⁸以及细胞间通讯⁹等过程中发挥关键调控作用，这些过程在神经元和心肌细胞等特化细胞中尤为重要。

新兴证据凸显了内体通路在心血管功能中的关键作用。Eps15同源结构域蛋白3（EHD3）可调控多种重要心脏离子转运蛋白的内体再循环，包括Na⁺/Ca²⁺ 交换体和L型Ca²⁺ 通道。小鼠EHD3缺失会导致心动过缓、传导异常以及钙离子稳态改变²⁺ 操作¹⁰血管平滑肌细胞中的功能性内体-溶酶体转运可防止磷酸盐诱导的中膜钙化，这一机制与慢性肾病和动脉粥样硬化密切相关¹¹然而，内体在心血管疾病中的功能作用及其作为治疗靶点的潜力仍未被充分阐明，有待进一步研究。

多种方法已实现功能完整的内体的生物化学分离。Marsh 及其同事首次将密度梯度离心与自由流电泳相结合，成功分离出早期内体和晚期内体，并保持了其酸化能力及结构完整性¹²。近年来发展的方法，例如蔗糖梯度法，为分离早期内体和晚期内体群体提供了标准化途径，这对于后续的蛋白质组学和脂质组学研究至关重要¹³。基于离心柱的商业化试剂盒也已被开发，适用于高通量应用。

通过自动超快速分离系统进行外泌体分离，利用了创新的超声纳米过滤技术，该技术结合了双膜纳米过滤系统、周期性负压振荡和双耦合谐波振荡，能够从生物液体中分离出高纯度的外泌体¹⁴。在此，我们将亚细胞组分分离与内体分离相结合，利用自动超快速分离系统，建立了一种从小鼠心脏组织中快速、高得率、高纯度分离内体的新方法。

此外，我们将提取的外泌体与原代心肌细胞（CM）进行共培养。 体外 并发现外源性内体成功进入了CM。使用一种内体报告系统，其中内体定位蛋白Numb与mCherry红色荧光蛋白融合^15,16我们观察到mCherry荧光在心肌细胞内呈点状分布。

方案

所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院关于实验动物使用指南，并经休斯顿大学机构动物护理和使用委员会批准。

注意：在开始分离操作之前，必须确保所有所需缓冲液均已新鲜配制并冷却至 4 °C。无菌器械、组织培养板和适当的离心管应放置在指定的工作站上，所有材料除非另有说明，均需保持在冰上或 4 °C 环境中。离心机及转子必须在使用前预先在 4 °C 平衡至少 2–3 小时。分步提取缓冲液应在实验前一天配制，并于 4 °C 保存，在实验过程中使用前需置于冰上。除非另有说明，所有孵育和离心步骤均应在 4 °C 下进行。

1. 心脏裂解液的制备

1. 使用70%乙醇对手术区域进行消毒，随后在工作台面上放置无菌吸水垫，并将已灭菌的外科器械有序摆放于其上。
2. 通过吸入CO₂（10-30% CO₂，持续3-5分钟）或经相关机构动物护理与使用委员会批准的其他方法处死小鼠（C57BL/6雄性，8-12周龄，20-25 g；mCherry: NumbKI雄性，8-12周龄，20-25 g）。
   警告：请在通风良好的开放空间内操作，并确保CO₂气瓶及时关闭以防止泄漏。在处死过程中应持续监测小鼠，确认其意识丧失并完成正确操作流程。一旦小鼠失去意识，应采用二次确认死亡的方法，如颈椎脱位、开胸术或放血法，以确保动物死亡。
3. 将小鼠置于仰卧位，并用70%乙醇清洁胸部区域。
   1. 迅速打开胸腔以取出心脏，并将心脏转移至置于冰上的60 mm培养皿中、含有冰冷Hank's平衡盐溶液（HBSS）的容器内。
   2. 使用镊子轻柔去除心腔内的残留血液，并充分清洗心脏，直至心腔内无可见血液残留。在整个处理过程中保持心脏处于冰上。
      注意：保留50-100 mg的心脏组织用于蛋白质印迹（WB）分析作为阳性对照。该组织可迅速在液氮中冷冻，并在-80 °C下保存最长6个月。
4. 在冰上向50 mL离心管中加入8 mL裂解分级缓冲液（表1）。将100-120 mg新鲜或冷冻的小鼠心脏组织转移至含有裂解分级缓冲液的离心管中。
   注意：小鼠心脏组织的任何部分均可用于内体提取。为获得足够量的内体以进行后续分析，至少需要100 mg心脏组织。为确保实验组间的一致性，在将组织加入裂解分级缓冲液前应准确称重。
   警告：操作裂解分级缓冲液时应穿戴适当的个人防护装备，避免与身体任何部位直接接触。
5. 始终在冰上、于裂解分级缓冲液中使用显微手术剪将组织剪切成约1 mm³大小的碎块。
6. 使用电动匀浆器以中等速度进行匀浆，采用工作40秒、停30秒的循环模式，共进行5-7个循环（图1A）。
   注意：充分的匀浆过程至关重要，有助于提高最终内体的浓度。
7. 将匀浆后的心脏裂解物置于冰水浴中，使用超声波清洗仪超声处理10分钟（图1A）。

2. 亚细胞分级分离

1. 将40 µm细胞滤筛置于50 mL离心管上，将匀浆后的心脏裂解液通过滤筛过滤（图1A）。
2. 获取核沉淀：将心脏裂解液在4 °C条件下以1,000 × g离心5分钟。转移上清液至新的标记管中。
   注意：收集沉淀，即核组分；如需用于Western blot（WB），可将核沉淀重悬于200 µL WB裂解缓冲液中。用放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液轻轻吹打核沉淀20次，并超声处理10分钟。将核裂解液在14,000 × g、4 °C条件下离心10分钟。收集上清液，于-80 °C保存以备后续使用。步骤2.2为可选步骤；若仅需囊泡组分，可跳过此步骤。
3. 获取线粒体组分：将上清液在4 °C条件下以10,000 × g再次离心10分钟。沉淀即为线粒体组分。将上清液转移至新的超速离心管中。
   注意：如需将线粒体组分用于Western blot，可参照前一条注释中所述步骤2.2保存沉淀。
4. 仔细平衡离心管。称量每根离心管，并向较轻的管中加入额外的冷裂解缓冲液，确保重量相等。将超速离心机转子及适配器在4 °C预冷2-3小时。将上清液在4 °C条件下以160,000 × g超速离心30分钟。
   注意：在超速离心过程中，必须确保所有超速离心管均正确配平，且缓冲液体积填充至距离管口约0.5-1 cm处。填充不足可能导致离心管因受到高离心力而变形或塌陷。
5. 将上清液转移至新离心管中。该上清液含有内体。在50 mL离心管上方安装连接有0.45 µm注射式滤器的10 mL注射器，将上清液过滤至管中。加入5 mL无菌PBS缓冲液稀释溶液，以避免滤器堵塞。
   注意：该过滤步骤可确保在开始分离步骤时，上清液中的所有内体均<450 nm。
6. 用步骤2.4中获得的5 mL无菌PBS缓冲液重悬沉淀，并上下吹打至少20次以充分混匀。该沉淀含有其他细胞内囊泡。在50 mL离心管上方安装连接有0.45 µm注射式滤器的10 mL注射器，将沉淀悬液过滤至管中。再加入5 mL无菌PBS缓冲液稀释溶液，以避免滤器堵塞。
   注意：该过滤步骤可确保在开始分离步骤时，沉淀中所有囊泡均<450 nm。

3. 内体及其他细胞内囊泡的分离过程

1. 将步骤 2.5 的滤上清液和步骤 2.6 的滤沉淀溶液分别用无菌 PBS 缓冲液稀释至终体积为 30 mL，装入 50 mL 离心管中。将样品置于 4 °C 保存（图 1A）。
   注意：样品可在 4 °C 保存 24 小时。若当天无法完成后续操作，可将样品在 4 °C 冰箱中保存，待次日继续实验。
2. 开启仪器并启动每日清洗程序，通常需要 20 分钟。
3. 选择中等规格 EXODUS 外泌体分离装置（M EID）进行分离。安装 50 mL 管适配器，并将装有样品的 50 mL 离心管放入样品位置。在屏幕上点击 EID 弹出选项，然后加载 M EID。
   注意：中等规格 EID 适用于 20–50 mL 样品，推荐体积为 30 mL。
4. 设置程序：
   1. 输入样品名称和样品体积。
   2. 选择样品类型：血浆。
   3. 选择程序：血浆. 强-MA. A03。
   4. 选择离心管：50 mL。
   5. 开启高纯度模式。
   6. 选择程序选项 3000。
   7. 点击 确定 开始运行。
      注意：整个分离过程需 1–2 小时完成。样品浓度越高，所需时间越长。
5. 回收内体及其他细胞内囊泡：
   1. 取出 EID 装置，转移至生物安全柜中进行后续操作。
   2. 使用 200 µL 移液器将 200 µL 无菌 PBS 缓冲液加入 EID 中，分别冲洗纳米多孔膜两侧各 20 次。
   3. 收集内体或其他细胞内囊泡，重悬于 200 µL 溶液中，转移至 1.5 mL 离心管。若在 24–48 小时内使用，可于 4 °C 保存；如需长期保存，则置于 -80 °C。
      注意：洗脱液含有内体或其他细胞内囊泡，可用于后续分析及与心肌细胞共培养。根据已有数据，内体样品在 -80 °C 保存 5 个月仍保持稳定。
6. 为 WB 实验洗脱内体及其他细胞内囊泡：
   1. 取出 EID 装置，向其中加入 80 µL WB 裂解缓冲液，分别冲洗纳米多孔膜两侧各 20 次。
   2. 将 EID 置于冰上孵育 30 分钟以确保完全溶解，每 10 分钟用移液器吹打 EID 内缓冲液一次。将内体或其他细胞内囊泡的裂解液收集至 1.5 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 14,000 × g 离心 10 分钟。收集上清液，于 -80 °C 长期保存。若管中有沉淀残留，弃去沉淀。

4. 内体蛋白定量与囊泡表征

1. Western blot 分析
   1. 从每个样品中保留 5 µL，用于通过二辛可宁酸（BCA）测定法定量蛋白质浓度。
   2. 将样品用 4× Laemmli 上样缓冲液稀释，并通过涡旋充分混匀。在 95 °C 加热 10 分钟以使蛋白质变性。
   3. 将变性后的样品在 4 °C 下以 14,000 × g 离心 10 分钟，收集上清液用于后续分析。
   4. 将聚丙烯酰胺凝胶组装到电泳装置中，并向电泳槽内加入含十二烷基硫酸钠（SDS）的电泳缓冲液。
   5. 将分子量标记物和制备好的蛋白质样品上样至凝胶中，根据目标蛋白的分子量选择合适的丙烯酰胺浓度。
      注：通常，心脏组织裂解液和内体裂解液每孔上样 20 µg 蛋白质。
   6. 以 6 V 电压电泳约 120 分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。
   7. 使用 Western blot 转膜系统将凝胶中的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
      注：湿转法同样效果良好。
   8. 用含 0.05% Tween-20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）短暂漂洗 PVDF 膜。
   9. 用含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 TBST 在室温下封闭膜 1 小时。
   10. 在 4 °C 下，将膜与针对所选内体标志物的特异性一抗（材料表）共同孵育过夜，同时轻轻振荡。
   11. 次日，在摇床上用 TBST 室温洗涤膜三次，每次 10 分钟。
       注：充分洗涤对降低非特异性背景至关重要；确保整个过程中膜始终保持充分水合状态。
   12. 在室温下，将膜与适当的二抗（材料表）孵育 1 小时。
   13. 在摇床上用 TBST 室温洗涤膜三次，每次 10 分钟。
   14. 向膜上加入化学发光底物，用于检测抗体结合的蛋白质。
   15. 使用凝胶成像系统曝光膜并采集蛋白质图像。
2. 动态光散射（DLS）分析
   1. 使用动态光散射（DLS）技术¹⁷测定内体的粒径和泽塔电位，仪器为配备 Kalliope 软件版本 2.10.4 的 Litesizer 500（Anton Paar）。DLS 测定在 25 °C 下使用 658 nm 激光以 90° 检测角进行三次重复。
   2. 将"粒径标准纳米球"用超纯水稀释，加入 1 mL 至一次性比色皿中，并将其放入样品室。
      注：根据未知样品的预期粒径，选择使用小粒径或大粒径的标准纳米球。
   3. 打开 DLS 软件，点击新测量选项卡。在测量模式中选择粒径。在“未命名”字段中命名文件，输入参数（溶剂、温度等），然后点击开始。测定标准颗粒粒径后，将比色皿从样品室中取出。
   4. 将"泽塔电位参考物质"用超纯水稀释，加入泽塔电位 Omega 比色皿中，并将其放入比色皿室。在软件中点击新测量选项卡，在测量模式中选择泽塔电位。在未命名字段中命名文件，输入参数（溶剂、温度等），然后点击开始。
   5. 为测定内体的粒径和泽塔电位，将内体样品用超纯水稀释，分别加入相应的比色皿中，并放入比色皿室。按照标准品的测定方法进行测量。
      注：根据样品浓度，用超纯水对未知样品进行适当稀释。
3. NanoFCM 分析
   注：使用 NanoFCM 流式纳米分析仪及 Professional Suite V2.3 软件¹⁸测定内体颗粒浓度。使用 488 nm 蓝色激光（20 mW，0.2% SS 衰减）和/或 638 nm 红色激光（8 mW，10% SS 衰减），在由气压模块调节并维持的 1.0 kPa 采样压力下进行 2 分钟的颗粒信号采集。使用超纯水作为鞘液，通过重力进样将样品聚焦至 1.4 µm。使用二氧化硅纳米球混合质控微球（S16M-Exo）测试并校准最佳激光对准。在分析前使用 S16M-Exo 粒径标准微球（含已知浓度为 2.17 × 10¹⁰/mL、粒径分别为 68、91、113 和 155 nm 的二氧化硅纳米颗粒混合物）进行粒径校准。
   1. 浓度标准采集：
      1. 启动并初始化 nanoFCM 的流体系统。将 QC 微球用 0.22 µm 滤膜过滤的超纯水稀释（1:100），加入 0.5 mL 管中，并放入进样舱。从样品信息下拉菜单中选择QC FL SiNPs，并输入 QC 微球样品的稀释倍数。
      2. 从样品流下拉菜单中选择“增强”模式，以高速引入 QC 样品，并将系统中的清洗液排出 45 秒。在增强过程中，将 488 nm 蓝色激光的激光功率设为 20/50 mV，638 nm 红色激光设为 20/100 mW，SS 衰减为 0.2%。
      3. 从样品流下拉菜单中选择“采样”模式，并对大信号进行阈值调整。在采样过程中，如有需要，可手动调整信号聚焦透镜对准，并通过软件调整激光聚焦透镜对准。大信号的自动阈值调整必须保持在侧向散射通道 50–120 范围内，两个荧光通道均低于 75。
      4. 点击计时记录以采集 120 秒数据。确保在数据采集期间，感兴趣区域（ROI）保持在 1500–15000 范围内。将结果文件保存在弹出文件夹中，文件扩展名为"nfa"，并卸载样品管。
         注：每次样品运行后，使用清洗液（1×）以“增强”模式冲洗管路 45 秒，以清除已处理的样品。然后将毛细管尖端浸入超纯水中，清除毛细管外壁残留的清洗液，再加载下一个样品。
   2. 粒径标准采集：
      1. 将"粒径标准微球"用 0.22 µm 滤膜过滤的超纯水稀释（1:100），并放入进样舱。从样品信息下拉菜单中选择68-155 S16M-Exo，并输入粒径标准微球样品的稀释倍数。
      2. 从样品流下拉菜单中选择“增强”模式，以引入粒径标准微球并清除系统中的清洗液，持续 45 秒。在增强过程中，将 488 nm 蓝色激光的激光功率设为 8/50 mV，638 nm 红色激光设为 20/100 mW，SS 衰减为 10%。
      3. 从样品流下拉菜单中选择采样模式，并对小信号进行阈值调整。窗口中应可见四个明显的峰（68 nm、91 nm、113 nm、155 nm）。点击计时记录以采集 120 秒数据。将结果文件保存在弹出文件夹中，文件扩展名为"nfa"，并卸载样品管。
   3. 空白标准采集：
      1. 使用超纯水或（样品的缓冲液/稀释液）按照上述相同流程进行测量，将文件命名为"空白"，保存在扩展名为"nfa"的文件夹中，并卸载样品管。
   4. 测定内体颗粒浓度
      1. 将内体样品用超纯水稀释，并放入进样舱。
      2. 在增强和采样后，点击计时记录开始测量。若侧向散射通道的阈值不在 50–120 范围内，或 ROI 超过 15,000，则应考虑进一步稀释样品。
   5. 数据分析：
      1. 在软件中从采集选项卡切换至分析选项卡，打开已保存的"nfa"文件。通过打开保存的 QC 结果文件date__QC FL SnNPs.nfa设置浓度标准，并点击设置阈值工具设定大信号的阈值。
      2. 使用圆形门控工具选择颗粒浓度。点击Count STD，在关闭窗口前核对 QC 微球的浓度（2.17 × 10¹⁰/mL）。
      3. 为设置粒径标准，打开date_68-155 S16M-Exo.nfa 文件。点击粒径工具以打开标准曲线生成窗口，并通过点击设置阈值工具设定小信号的阈值。
      4. 从用户自定义下拉菜单中选择S16 exo 68-155 nm。点击寻找峰以识别四种粒径群体的侧向散射强度峰。
      5. 选择空白文件并点击设置空白，以识别假阳性数量并从样品中扣除。为分析内体浓度，首先选择样品，并通过点击设置阈值工具设定小信号的阈值。以粒径（nm）和浓度（颗粒/mL）报告的形式呈现定量数据。

5. 原代心肌细胞培养

注意：使用原代心肌细胞分离试剂盒分离心肌细胞，该试剂盒提供的试剂足以从最多50个新生小鼠或大鼠心脏中分离心肌细胞。试剂盒还包含适用于原代心肌细胞培养的组分。所有培养基和缓冲液均应小心移除，避免扰动细胞。建议使用1000 µL移液器吸头进行手动移液，避免使用真空抽吸。在开始操作前，应将Hank's平衡盐溶液（HBSS）预冷至4 °C。

1. 使用试剂盒中提供的含有木瓜蛋白酶的心肌细胞分离酶1，加入2. mL预冷的HBSS至一支小瓶中进行重悬。轻轻混匀约5分钟，或直至酶完全溶解。整个操作过程中将酶溶液置于冰上保存。
   注意：一支重悬后的心肌细胞分离酶1足以从10个新生小鼠心脏中分离心肌细胞。该溶液可在-20 °C保存长达6个月，并可耐受两次冻融循环。若在4 °C保存，应在1周内使用，以确保酶活性。
2. 将新鲜解剖的新生小鼠心脏分别放入无菌的1. mL微量离心管中，并立即向每管加入500 µL冰冻HBSS。
   注意：建议每管处理一个心脏，以最大化细胞得率和实验可重复性。
3. 使用无菌解剖剪将心脏组织剪切成1- mm³大小的组织碎片。每份样品用500 µL冰冻HBSS洗涤两次，以去除残留血液。
4. 向每管中加入200 µL重悬后的心肌细胞分离酶1（木瓜蛋白酶）和10 µL试剂盒中提供的心肌细胞分离酶2（含嗜热菌蛋白酶）。轻轻混匀后，将各管在37 °C孵育30–35分钟。
   注意：心肌细胞分离酶2以HBSS中的悬浮液形式提供，使用前应在冰上解冻。加样前需通过移液吹打使其充分混匀，形成均匀悬浮液。
5. 酶消化完成后，小心吸除酶溶液，并用500 µL冰冻HBSS每份样品洗涤两次。
6. 向每管中加入mL用于原代细胞分离的完全DMEM培养基。使用无菌1.0 mL移液枪头，上下吹打25–30次，轻柔地将组织分散。此步骤中应尽量减少气泡产生。
   注意：通过吹打分散组织可提高细胞得率，但过度吹打可能导致细胞损伤。
7. 将上清液在300 × g离心5分钟。
8. 小心用移液器吸除完全DMEM培养基。向每管中加入1 mL新鲜完全DMEM培养基，使用无菌1.0 mL移液枪头上下吹打25–30次。吹打过程中避免产生气泡。
9. 当组织基本形成单细胞悬液后，向每管中加入0.5 mL用于原代细胞分离的完全DMEM培养基，使总体积达到1.5 mL。合并各管的单细胞悬液，用于细胞浓度和细胞活力的测定。

6. 将内体与心肌细胞共培养

1. 将心肌细胞接种于60 mm培养皿中，并加入完全DMEM培养基至总体积。
   注意：每只新生小鼠心脏预计接种一个培养皿，每个培养皿的总体积为5 mL（图1B）。
2. 将60 mm培养皿置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育24 h。24 h后，弃去原培养基，更换为等体积的新鲜含心肌细胞生长添加剂（1000倍稀释）的完全DMEM培养基，用于原代细胞培养。
3. 将步骤3产生的内体洗脱液从-80 °C转移至-20 °C放置1 h。随后将内体置于冰上，缓慢解冻。
   注意：在冰上缓慢解冻有助于保持内体膜的完整性，并减少降解。
4. 48 h后，将每100 µL内体洗脱液与5 mL新鲜完全DMEM混合，更换各培养皿中的旧培养基。将内体与心肌细胞共培养24 h。
5. 用2 mL冷的无菌PBS洗涤心肌细胞。每皿加入80–100 µL预冷的裂解缓冲液。使用预冷的塑料细胞刮刀刮取细胞，并将细胞收集至1.5 mL离心管中。
6. 按照步骤4.1所述进行WB实验。
7. 进行免疫荧光染色（IF）时，请按以下步骤操作。
   1. 将心肌细胞接种于8孔细胞培养板中。用完全DMEM将单细胞悬液从1.5 mL稀释至3 mL。
   2. 每孔接种300 µL细胞悬液。重复步骤6.2–6.4。
   3. 室温下用200 µL 4%多聚甲醛（PFA）固定心肌细胞20 min，随后用200 µL无菌PBS洗涤三次。8孔培养板即可用于免疫荧光染色。
      警告：操作4% PFA时，请穿戴适当的个人防护装备。使用后请将4% PFA弃置于指定容器中。

结果

我们检测了五个组别中早期内体、晚期内体、溶酶体和自噬体标志物的表达水平：心脏组织裂解液、核组分、线粒体组分、来自步骤2.6和3.6的其他细胞内囊泡，以及来自步骤2.5和3.6的内体。图2A、B显示，EEA1（早期内体抗原1）在内体中的表达水平最高，在其他组别中几乎不表达。Rab7在内体中的表达水平也最高（图2A、C），而Lamp1和LC3在其他细胞内囊泡中的表达水平最高（图2A、D、E）。多项先前研究已证实，EEA1主要定位于早期内体¹⁹，具体位于内体膜的胞质面²⁰。Rab7主要定位于晚期内体，在内吞途径中发挥关键作用，特别是在货物从晚期内体向溶酶体转运过程中^21,

讨论

本研究中，我们介绍了一种结合亚细胞分级分离与超快速分离平台，从小鼠心脏组织中快速、可重复地分离高纯度早期内体的方法¹⁴。传统的内体分离方法，如密度梯度离心¹²或免疫分离法，通常耗时耗力，且需要大量组织样本或特异性抗体。通过将机械匀浆方案与纳米过滤技术相结合，我们显著简化了分离流程，同时保持了内体囊泡的理化特性和分子完整性。

该实验的成功依赖于多个关键步骤。初始组织匀浆和温度控制下的离心对于维持细胞器完整性以及富集囊泡组分至关重要。在基于EXODUS的分离步骤¹⁴中需谨慎操作，特别是在膜清洗和囊泡洗脱过程中，这对于最大化回收率和纯度尤为关键。

该方案具有可适应性，可根据实验需求进行调整。例如，可根据下游应用选择性地保留或去除特定的细胞内组分（如细胞核或线粒体组分）。故障排除策略包括优化匀浆次数以提高得率，调整离心参数以实现更清晰的分离，以及稀释样品以防止过滤过程中膜堵塞。此外，逐步解冻内...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
µ-Slide 8 孔高底培养板	ibidi	80806-90
1.5 mL 带刻度微量离心管	USA Scientific	1615-5500
10x Tris/甘氨酸缓冲液	Bio Rad	1610734
4x Laemmli 样品缓冲液	Bio Rad	1610747
台式离心机	Eppendorf	Eppendorf Centrifuge 5810R
牛血清白蛋白	Sigma	A9418
细胞筛	Corning	CLS431750	孔径 40 μm，无菌
CELLSTAR 组织培养皿	VWR	82050-546	聚苯乙烯，无菌，60 mm ´ 15 mm
ChemiDoc 成像系统	Bio Rad	ChemiDoc XRS+
清洗液	NanoFCM	17159
用于 Pierce 原代细胞分离试剂盒的 DMEM	Fisher Scientific	PI88287
DTT	Fisher Scientific	BP172
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 (PBS)	Thermo Scientific	10010023
ECL 蛋白印迹检测试剂	Bio Rad	1705061
EDTA	Sigma	E4884
EEA1	Cell signaling	3288S	WB (1:1000)
EGTA	Sigma	E-4378-25
EID	EXODUS	MA03 EID
ERp72	Cell signaling	5033S	WB (1:1000)
乙醇	UH 研究用品库		200 证明，5 加仑
EXODUS H-600	EXODUS	H-600
GAPDH	Proteintech	10494-1-AP	WB (1:5000)
Hank’s 平衡盐溶液 (HBSS)	Thermo Scientific	14175095
HEPES	Sigma	H3375
匀浆器	Fisher Scientific	15340167
KCl	Sigma	P3911
Lamp1	Abcam	ab320851	WB (1:2000)
LC3	Cell signaling	2775S	WB (1:1000)
Litesizer 500	Anton Paar	Litesizer 500	其他设备如 Zetasizer (Malvern) 或 DLS  (Wyatt) 也可使用
mCherry	Biorbyt	orb66657	WB (1:500)
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
NaCl	Sigma	S7653
NanoFCM	NanoFCM	Flow NanoAnalyzer
纳米球尺寸标准品	Thermo Scientific	3020A
Nikon AXR 共聚焦显微镜	Nikon	AXR
4% 多聚甲醛 PBS 溶液	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
鬼笔环肽标记探针	Invitrogen	A22284	IF (1:500)
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific	23227
Pierce 原代心肌细胞分离试剂盒	Thermo Scientific	88028
聚醚砜注射器滤器	Millipore	SLHPR33RS	孔径 0.45 μm，无菌
预制蛋白凝胶	Bio Rad	4561093
质控微球	NanoFCM	QS2503
Rab7	Cell signaling	9367S	WB (1:1000)
RIPA 裂解与提取缓冲液	Thermo Scientific	89900
Roche PhosSTOP（蛋白酶抑制剂混合物）	Roche	4906837001
二氧化硅纳米球	NanoFCM	S16M-Exo
蔗糖	Sigma	84097
摆动转子	Beckman Coulter	SW55Ti
Trans-Blot Turbo 转膜系统 RTA 转膜试剂盒	Bio Rad	1704270
Tween 20	Bio Rad	1662404
超速离心机	Beckman Coulter	Optima XE-90
超速离心管	Beckman Coulter	326819
超声波清洗仪	Branson Ultrasonics	CPX952238R
VWR 50 mL 离心管	VWR	89039-656
VWR 15 mL 离心管	VWR	89039-666
Zeta 电位标准物质	Anton Paar	175108