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利用质谱技术对糖组进行空间分子成像

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DOI：

10.3791/69154

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2025年11月28日

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1Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR), University of Florida, Gainesville, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida, Gainesville, 3Markey Cancer Center, University of Kentucky, 4Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Kentucky

本文内容

摘要

本方案详细阐述了利用质谱成像技术对糖原和N-连接聚糖进行严格且可重复测量的关键步骤。

摘要

组织内糖组的空间分布是生理功能分子基础的关键。复杂且动态变化的糖组对代谢、信号传导和黏附等基本细胞过程至关重要。空间生物学领域的创新为多种糖组类别的空间分子成像开辟了新途径。本文介绍了一种针对新鲜冷冻小鼠肝脏糖组进行空间生物分子成像的优化方案。该工作流程包括：（1）快速取材与冷冻，（2）在最佳厚度和位置下进行恒冷切片，（3）组织预处理及利用碳水化合物活性酶在组织上进行原位酶解，（4）基质喷涂及通过基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）获取数据，（5）数据处理与可视化，以将研究结果置于生物学背景下解读。采用该方法可获得N-连接聚糖和糖原的详细空间分布图谱，揭示关键的生理与细胞特征。这些数据有助于界定与肝脏功能及功能障碍相关的关键空间糖组异质性。该工作流程实现了小鼠肝脏高重复性、高灵敏度的空间糖组学分析。此外，该方法可轻松拓展至其他组织或物种，推动对健康与疾病状态下糖组生物学的空间机制研究。

引言

空间生物学领域正在迅速扩展，为了解生物体动态的空间生物分子复杂性提供了关键见解。目前正采用多种方法在生物学背景下研究不同的生物分子。尽管其中一些是高度专业化的技术，但质谱法（MS）已发展成为一种重要的通用技术，可用于在细胞、组织或生物体背景下定量多种生物分子。

基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）是用于多组学空间生物分子成像的一种新兴通用技术。该技术最初建立用于组织切片中蛋白质和多肽的可视化1。此后，其应用已扩展至多种不同的生物样本和分子类型2。该技术可应用于细胞样本3、类器官4、模式动物5以及患者样本6,7。某些分子类别可直接通过基于质谱成像的方法进行检测，包括多种代谢物和脂质；而其他更复杂的生物分子类型，如蛋白质和聚糖，则需要经过酶解或化学处理后才能适用于基于质谱成像的检测2,8。

基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）已应用于N-连接聚糖和糖原的空间分析，其工作流程需通过酶处理产生适合质谱成像检测的聚糖片段9,10,11,12,13,14,15。N-聚糖通过PNGase F酶从蛋白质的天冬酰胺残基上切割下来，糖原的葡萄糖链则通过异淀粉酶进行切割。MALDI糖原分析的关键优势在于，它能够提供生物样本中糖原分布的空间定位信息、相对定量结果以及葡萄糖链分支结构的信息。由于N-聚糖和糖原分析的工作流程均需对样本进行酶处理才能开展质谱成像分析，因此二者已被整合为一个统一的糖组分析工作流程（图1A）。该流程需要对生物样本进行精细制备和特定处理，以实现糖组的质谱分析，随后进行数据采集与处理。尽管该流程包含一系列专业化步骤，但能够生成丰富、高质量且高度可重复的空间糖组数据，并可适用于多种不同类型的样本16。此外，该工作流程具有模块化特点，样本处理步骤可由独立的研究实验室完成，之后将样本送至专门机构进行MALDI-MSI的数据采集与分析。

方案

本研究严格按照佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行。所使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 肝脏的收获

  1. 动物安乐死与解剖
    1. 采用颈椎脱位法并进行断头以安乐死小鼠（遵循机构批准的实验方案）。
      注意：本示例使用了一只6月龄的野生型C57BL/6J小鼠。在此年龄，小鼠体重约为25–33 g。多种年龄、体型和品系的小鼠均适用于本分析。
    2. 立即将动物置于吸水垫上，并使用无菌手术刀暴露腹腔。
    3. 使用无菌镊子和剪刀，尽量减少操作和组织损伤的情况下分离肝脏。
      注意：代谢变化发生迅速。应尽可能避免灌注或镇静处理，并确保解剖步骤尽快完成17。
  2. 快速清洗和清洁组织
    1. 将肝脏轻轻浸入1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，以去除血液。
    2. 将组织在去离子水（DI水）中浸洗两次。
    3. 用组织轻触洁净的擦拭纸，吸去多余水分。
      注意：大于标准显微镜载玻片容纳范围的样品应在冷冻前切成小块。
  3. 样品冷冻
    1. 将清洁后的肝脏直接放入漂浮于液氮中的预冷一次性聚苯乙烯称量舟中。
    2. 待组织颜色变为有光泽的不透明状（约3分钟）后，立即将组织转移至预先制备并标记好的铝箔袋中，并置于干冰上。
    3. 将装有样品的铝箔袋放入-80 °C超低温冰箱中保存。样品可在-80 °C长期储存。

2：生物样本的制备

  1. 冷冻切片前的准备
    1. 确保冷冻切片机已开启，并平衡至适合组织的温度，通常在 -16 °C 至 -20 °C 之间。具体温度取决于组织类型。肝脏组织应稍高一些，约为 -16 °C 至 -17 °C，以防止组织撕裂；其他组织则应在 -20 °C 下进行切片。
    2. 确保冷冻切片机内至少备有两块样品头、两把细毛刷、一对细镊子和一个70 mm的玻璃插件。此外，在将载玻片放入冷冻切片机前，需用铅笔预先标记，使其适应低温环境。
    3. 将组织从 -80 °C 冰箱中取出，并置于干冰上转移至冷冻切片机中。
    4. 让组织在冷冻切片机中至少适应温度30分钟。
    5. 检查玻璃插件边缘是否完好无损，并确保组织接触防卷导板的位置光滑，可用戴手套的手指沿边缘轻轻滑动确认。
    6. 将玻璃插件放入防卷导板中。
    7. 取一把低剖面刀片，小心地将其插入打开的刀片夹中，然后关闭刀片夹。在开始切片前，将红色刀片保护罩盖在刀片上。
    8. 使用适用于质谱（MS）的M1包埋介质将组织固定在样品头上。在冷冻切片机内将室温的M1包埋介质涂于样品头表面，覆盖至少两个环形区域，以确保组织牢固固定。
      注：在冷冻切片中常使用最佳切割温度（OCT）包埋剂；然而，OCT会导致质谱应用中的离子抑制，必须避免使用。若必须使用OCT，则应采用额外的多步方案以尽量减少或去除OCT残留。此外，某些质谱资源中心将不分析曾使用OCT包埋的样本。
    9. 取一对预冷的镊子，从铝箔中取出组织，并用镊子将组织按所需方向放置在样品头上。
    10. 将样品头放回冷冻切片机中，使包埋介质冻结，约需2分钟。冻结后介质会变硬并呈现不透明状。
  2. 肝脏组织的冷冻切片
    1. 将带有组织的样品头装入样品头夹持器中。调整样品头位置，使组织切割方向与刀片呈90°角。
    2. 将样品头夹持器向后缩回，使组织不接触刀片。然后缓慢推进样品头，直至组织紧邻刀片，准备开始切片。
    3. 以30 µm的厚度开始切片，以去除不需要的组织部分。
    4. 调节卷板深度，确保切出的切片平整，且组织不会卷到卷板上方。若发生卷曲，则略微松开卷板；若组织推动卷板并在旋转复位时再次撞击卷板，则略微拧紧卷板。
    5. 当接近目标切片位置时，将切片厚度调整为10 µm，或根据具体应用需求设定其他合适的厚度。
    6. 完成10次旋转，使样品头达到稳定切片厚度，避免滞后和切片不均。
    7. 用预冷的毛刷清理切片台，准备切片。合上卷板盖住刀片，缓慢进行一次切片。
    8. 抬起卷板，使用两把预冷的细毛刷轻轻将切片从刀片上分离，并将切片移至切片台一侧，便于后续转移到载玻片上。
    9. 从冷冻切片机内的载玻片架中取出一张预冷的载玻片，用食指按住载玻片上与组织放置位置相对的一侧，持续10秒。
    10. 轻轻将载玻片压向组织，然后缓慢抬起。切勿用力按压，以免撕裂组织。组织应轻微融化并粘附于载玻片上，变得半透明。
    11. 迅速将载玻片转移至干燥器中进行干燥，干燥时间为1小时。
    12. 干燥后，载玻片可直接用于质谱分析，或经真空密封后保存于 -80 °C。

3. 糖组学质谱成像的载玻片制备

  1. 酶的制备
    注：可直接购买适用于质谱（MS）的低盐冻干PNGase F，并直接使用。
    1. 用于质谱分析的异淀粉酶需经透析去除过量盐分。通过将透析杯置于HPLC级水中15分钟，制备一个或多个透析杯。
    2. 将200 µL储存液异淀粉酶使用500 µL透析杯，在14.3 mL HPLC级水中于4 °C下透析2小时，不搅拌。更换14.3 mL新鲜HPLC级水，继续在4 °C下透析16小时（过夜）。再次更换14.3 mL新鲜HPLC级水，在4 °C下再透析8小时。
    3. 用移液器小心从透析杯中取出异淀粉酶，转移至1.5 mL微量离心管中。测量透析后异淀粉酶溶液的总体积（以µL计）。根据起始酶活性（通常为200 Units/mL）和最终体积，计算获得3 Units异淀粉酶所需的总体积。
    4. 将含3 Units异淀粉酶的溶液分装至薄壁PCR管中，液氮速冻，-80 °C保存。每管透析后的异淀粉酶溶液可用于一次喷雾程序，足够处理四张载玻片。避免反复冻融以维持酶活性。
  2. 组织固定与洗涤
    1. 将载玻片放入玻片架中，浸入盛有10%中性缓冲福尔马林（NBF）的玻璃容器中，固定1小时。
    2. 取出载玻片，转移至70%乙醇中浸泡2小时。
    3. 准备四个科林瓶，分别装有70%、80%、90%和100%乙醇。清晰标记每个瓶子，以避免在连续洗涤过程中混淆。
    4. 依次转移载玻片：70%乙醇中5分钟，80%乙醇中5分钟，90%乙醇中5分钟，100%乙醇中5分钟。
    5. 将载玻片转移至盛有新鲜100%二甲苯的玻璃培养皿中，确保载玻片完全浸没。在摇床上以70 rpm振荡孵育1小时，具体时间取决于组织的脂质含量。使用新鲜二甲苯重复此步骤两次。
      ​注：本方案旨在实现最大程度的去脂化，因为脂质已知会导致离子抑制，从而影响数据重现性。然而，这也会导致信号定位偏移，降低可获得的空间分辨率。减少洗涤步骤、缩短处理时间以及严格控制湿度可能减轻信号偏移，从而提高数据分辨率。
    6. 将载玻片置于干燥器中过夜干燥。
    7. 将载玻片在70%乙醇中再水化1分钟，随后转移至去离子水（DI水）中3分钟。用新鲜DI水重复洗涤一次。
    8. 将载玻片在干燥器中干燥10分钟，或直至完全干燥。
  3. 载玻片的酶处理前准备
    1. 准备HTX湿度孵育室：在金属架下方放置一张浸透DI水的纸巾，并将孵育室置于37 °C培养箱中。
    2. 准备食品蒸锅：将水箱加满自来水，设置定时器为60分钟以启动加热。
    3. 配制柠康酸缓冲液：向50 mL Falcon管中加入50 mL HPLC级水、25 µL柠康酸酐和2 µL 12 M HCl，涡旋混匀10秒。每50 mL柠康酸缓冲液可处理四张载玻片。确认溶液pH为3.0（可接受范围：2.5–3.5）。
    4. 将配制好的柠康酸缓冲液加入每个邮寄盒中。将载玻片组织面向内放置，防止组织接触盒壁，以确保有效的抗原修复。每个邮寄盒可放置两张载玻片，置于两侧边缘位置，且组织均朝向内侧。
    5. 确认食品蒸锅已产生蒸汽，将邮寄盒放入蒸锅中，孵育30分钟。
    6. 将邮寄盒转移至DI水浴中5分钟。将邮寄盒中一半的柠康酸缓冲液替换为DI水，静置5分钟。重复此稀释步骤两次。
    7. 移除所有溶剂，向邮寄盒中加入100% DI水清洗载玻片，随后去除DI水。使用实验室擦拭纸，擦干组织区域以外的水分。
    8. 在每张载玻片背面绘制一个圆圈和一个三角形，用于标记内标位置。在载玻片正面分别点加1 µL 1 mg/mL辣根过氧化物酶（HRP；圆圈）和1 µL 10 mg/mL兔肝糖原（三角形）。
    9. 将载玻片置于干燥器中干燥15分钟，直至完全干燥。
  4. 酶喷雾与消化
    1. 取出一管100 µg冻干PNGase F（500 units/µg）和一管3 Units异淀粉酶，室温解冻10分钟。在微量离心机中以约2000 x g离心5秒。此酶量足够喷雾处理四张载玻片。
    2. 向每管冻干PNGase F中加入50 µL DI水，轻轻涡旋10秒，然后在微量离心机中以约2000 x g离心5秒。将50 µL PNGase F溶液直接加入异淀粉酶管中，再加入HPLC级水至终体积1 mL。
    3. 将双酶混合液在微量离心管中涡旋10秒，并以约2000 x g离心5秒。
    4. 开启HTX M5喷雾仪并打开HTX M5软件。在System选项卡下，确保托盘类型设置为Ambient。
    5. 按下Knauer泵前面右侧面板上的停止按钮，关闭该泵。通过其背面开关开启外置注射泵。
    6. 在HTX软件的Methods选项卡下，选择适用于双酶喷雾的方法。参数设置为：喷嘴温度45 °C、15次循环、流速0.025 mL/min、移动速度1200 mm/min、轨迹间距3 mm、CC模式、压力10 psi、气体流速3 L/min、喷嘴高度40 mm。
    7. 进入Temp选项卡，将喷雾喷嘴温度设为45 °C。使用扳手将喷雾管线连接至顶部接口。
    8. 打开超纯氮气阀门，确保喷雾压力为10 psi。在注射泵上将流速设为95 µL/min。
    9. 使用新的注射器和针头吸取4 mL HPLC级水，彻底去除气泡。将2 mL水通过约6英寸长的喷雾管线排入废液杯中。
    10. 将注射器连接至喷雾管线，启动注射泵，以95 µL/min流速运行5分钟，使水流过系统。
    11. 在冲洗注射泵的同时，使用金属对准导板将载玻片固定在加热托盘的左下角，确保组织位于喷雾区域内。在Sample选项卡下，设定喷雾区域的X和Y参数，允许轻微过喷，以确保载玻片完全覆盖。
    12. 5分钟后暂停泵，断开注射器，吸入空气，然后推动空气通过喷雾管线以清除残留水分。根据需要重复操作。
    13. 将双酶溶液吸入新注射器中，连接至泵，确保无气泡残留。
    14. 将注射器连接至喷雾管线。在注射泵上将流速调整为25 µL/min。
    15. 当喷嘴温度达到45 °C后，在Cycle选项卡下点击Start。当提示是否开启Knauer泵时，点击No。随后在注射泵上按下Start，开始喷雾。
    16. 在喷嘴下方放置一张空白载玻片，确认可见的酶喷雾沉积。观察到沉积后，在软件中点击Continue，盖上喷雾仪玻璃盖，观察喷雾是否均匀，以均匀润湿为标志。
    17. 喷雾循环完成后，停止泵，关闭氮气，点击Valve load confirm。清洗喷雾管线和平台，关闭喷雾仪，并确保Knauer泵已重新开启。
    18. 将载玻片放入HTX湿度孵育室中，在37 °C下孵育2小时，载玻片朝上放置。孵育结束后，将载玻片置于干燥器中干燥15分钟。载玻片可在干燥器中过夜保存，或继续后续操作。
  5. MALDI基质的配制与应用
    1. 在施加基质前，使用扫描仪获取载玻片的光学图像。
    2. 称取40 mg CHCA固体粉末至15 mL锥形管中。用含0.1%三氟乙酸和50%乙腈（ACN）的溶液溶解CHCA，终浓度为7 mg/mL。
    3. 将基质溶液超声处理10分钟，采用90秒开启、30秒关闭的循环模式，重复5次，以确保完全溶解和均匀性。
    4. 开启HTX M5喷雾仪并打开HTX M5软件。打开氮气阀门，将系统压力设为10 psi。
    5. 在HTX软件的Methods选项卡下，选择适用于CHCA基质喷雾的方法。参数设置为：喷嘴温度79 °C、10次循环、流速0.1 mL/min、移动速度1300 mm/min、轨迹间距3 mm、CC模式、压力10 psi、气体流速3 L/min、喷嘴高度40 mm。
    6. 进入Temp选项卡，将喷雾喷嘴温度设为79 °C。在Pump选项卡下，将流速设为100 µL/min。
    7. 使用金属导板将载玻片固定在加热托盘的左下角，确保在喷雾区域中正确对齐。在Sample选项卡下，设定喷雾区域的X和Y参数，允许轻微过喷，以确保载玻片完全覆盖。
    8. 使用一次性注射器和针头吸取5.5 mL 50% ACN（去除气泡）。
    9. 将喷雾仪设为LOAD模式。插入ACN注射器并注入ACN。移除ACN注射器后，立即更换为装有5.5 mL过滤后CHCA溶液的新注射器，注入时确保无气泡。将喷雾仪设为SPRAY模式。
    10. 当喷嘴温度达到79 °C后，在Cycle选项卡下点击Start，提示时点击Yes。
    11. 使用空白测试载玻片置于喷嘴下方，确认可见的基质喷雾沉积。喷雾后载玻片上将出现黄色沉积物。观察到后，点击Continue，盖上仪器玻璃盖，监测喷雾一致性。一致的喷雾将产生均匀不透明的载玻片。
    12. 喷雾循环完成后，将喷雾仪设为LOAD模式，并点击Valve load confirm。
    13. 通过将泵压力设为300 psi并将温度降至30 °C来清洗喷雾仪。先后用5 mL 50%乙腈冲洗管线两次，再用5 mL 50%甲醇冲洗两次。用100%甲醇擦拭平台。当温度降至30 °C后，切换至LOAD模式，关闭气体，关闭喷雾仪，并确保Knauer泵已重新开启。
    14. 将载玻片置于干燥器中干燥15分钟，直至基质完全干燥。喷雾后应尽快进行质谱检测，最迟不超过14天，以确保获得具有适当信噪比的可靠数据。

4. MALDI-MSI 糖组学数据采集

  1. 准备数据采集
    1. 使用载玻片适配器将载玻片固定在MALDI仪器的样品支架上。将样品支架插入质谱仪中，并确保其正确就位，以便进行成像。
    2. 打开flexImaging软件，并导入先前记录的光学载玻片图像，参见步骤3.4.1。如有需要，校准图像与仪器载物台的对齐，以确保组织切片和标准点在区域选择时位置正确。
    3. 在软件中定义组织切片、HRP标准品、糖原标准品以及对照基质方块的成像区域。将每个区域分别勾画为独立区域。
    4. 设置光栅步长为50 µm，得到像素分辨率为50 × 50 µm。
    5. 在仪器控制软件中，选择正离子MS模式，并将扫描范围设置为m/z 500 - 4000，低质量截止值为700.00 m/z。
    6. 在仪器控制软件中加载预优化的MALDI成像调谐参数集（或根据需要手动输入参数值）。确认源极和离子光学电压设置为指定值：MALDI板偏压50.0 V；偏转1增量70.0 V；漏斗1射频500.0 Vpp；漏斗2射频500.0 Vpp；多极杆射频500.0 Vpp；离子能量5.0 eV。确认碰撞池和飞行时间（TOF）时序设置：碰撞能量10.0 eV；碰撞射频4000.0 Vpp；传输时间180.0 µs；预脉冲存储25.0 µs。
    7. 在“激光”选项卡下确认激光设置。选择成像50 µm作为应用默认设置。
    8. 使用外部校准混合物（如调谐混合物）校准质谱仪。引入校准物并运行仪器的校准程序。调整校准，使质量准确度误差在0.001%以内，校准准确度评分为100%。
    9. 设置采集参数，以10,000 Hz频率进行320次激光脉冲的爆发式采集。激光衰减应调整为37%，以保持信号强度在最佳动态范围内。根据需要调整激光脉冲次数和衰减。
    10. 使用仪器的自动光束对准功能、目标轮廓调整和聚焦调整，确保激光在样品上正确聚焦。在组织区域外，在控制软件的激光选项卡下执行自动光束调整，以对准激光与离子光学系统。这将确保激光和载物台调整至最佳数据采集状态。最后，在样品载体选项卡中执行目标轮廓生成和聚焦调谐调整。
    11. 确认内标点产生预期的离子峰，表明已准备好进行数据采集。HRP应在m/z 1211.42处出现明显的糖链峰。糖原应出现规律间隔的显著峰，其中最高强度峰位于m/z 1013.32、1175.37和1337.43。
      注意：若发现信号强度存在问题，请重新检查激光配置；若发现质量准确度问题，请重新进行校准。
  2. MALDI-MSI数据采集
    1. 在成像软件中点击开始按钮，启动对已定义区域的MALDI-MS成像采集。仪器将自动以50 µm间隔在每个定义区域内逐点扫描激光，在每个像素点采集一个正离子MS1谱图（m/z 500–4000）。在此分辨率下，肝脏切片的典型数据采集时间为135分钟。
      注意：运行结束后，仪器将自动保存每个像素点采集的谱图，生成包含原始数据的.d文件夹。

5. MALDI-MSI 数据分析

  1. 数据导入与导出
    1. 将数据集导入 SCiLS Lab 或其他等效的质谱成像（MSI）分析软件，以可视化组织切片上糖组的离子强度分布图。
    2. 打开 SCiLS Lab，选择 New，然后选择 MALDI 运行生成的 .mis 文件。
    3. .mis 文件在 SCiLS 中打开后，点击 Next；在 m/z 范围中选择 Automatic range；在 Axis Parameters 中选择 automatic axis；选择 absolute bin size；点击 Next，然后点击 Import；选择文件保存的文件夹。
    4. 导入完成后，打开新生成的 .slx 文件。
    5. 点击 File, Import，选择“从文件导入特征列表”选项；导入糖组注释信息，并前往特征列表面板，选择正确的列表后，点击“创建离子图像”按钮。
      注：已有可靠的特征列表可用于 N-聚糖16,18,19 和糖原13。
    6. 根据需要对数据进行归一化处理；总离子流计数（Total Ion Count, TIC）是最常用的归一化方法。
    7. 离子图像加载完成后，浏览特征列表，确保各峰的积分正确，对未完全积分的特征进行手动调整。调整方法为：按住 Shift 键的同时左键点击目标峰；完成积分后，按下键盘上的 Control 键和空格键，系统将为调整后的峰生成新的离子图像。
    8. 对特征列表中其余条目重复上述操作后，在离子图像面板中选择 Save 特征列表，命名该列表，然后点击 Save。
    9. 进入 File → Feature Table，打开刚刚保存的特征列表表格，按 m/z 值排序；经调整的特征在名称列将显示为空白单元格。通过复制粘贴原名称为调整后的峰重新命名，并在特征表顶部中间位置点击“从特征列表中删除所选行”按钮，移除原始峰条目。
    10. 完成所有名称调整后，即可获得最终的注释峰列表。点击靠近删除按钮附近的 Add Intensity 按钮，从中选择感兴趣的样本，以导出每个成像区域中各注释特征的平均强度值。
    11. 请确保选择 Peak Area interval 处理模式，并选择 Total Ion Count 作为归一化方法，点击 OK；此时将出现包含相应数据的新列。如需导出数据，请点击向外箭头图标，并保存为 .csv 格式。

结果

对野生型小鼠肝脏进行精细处理，包括切割完整的横断面（图1A），从而通过基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）定义其糖组，检测到多种糖原衍生的寡糖和N-连接聚糖，覆盖广泛的质荷比范围（图1B）。糖原广泛分布于肝实质细胞中，而在门管区的血管和结缔组织中则缺乏，符合预期（图1C，D）。重要的是，MALDI-MSI数据不仅可测量糖原的空间分布，还可测定其链长分布，后者是正常代谢及疾病状态下糖原的关键特征（图1D）。此外，多种N-连接聚糖表现出不同的组织模式。其空间分布从在肝实质细胞中广泛存在（图1E），到呈现区域性聚集，与肝脏的窦状隙结构一致（图1F），再到特异性标记门管区结构成分（图1G–I）。

质谱工作流程图、光谱数据和肝脏组织成像，显示聚糖分析结果。
图 1：小鼠肝脏的 MALDI-MSI 糖组分析。（A）样品制备、数据采集和分析中关键方法的示意图。（B）由此方法获得的样品质谱图。红色箭头表示源自糖原的规则间隔的寡糖，其差异为一个葡萄糖单糖。蓝色箭头表示在质谱中广泛分布的 N-聚糖。在肝脏中，糖原峰通常更为显著，尤其是在较高的 m/z 值处。（C）肝脏中源自糖原的麦芽六糖（DP6）的空间分布。（D）肝脏中糖原链长度的分布。（E–G）肝脏中不同 N-连接聚糖种类的空间分布。（H）中心区域的苏木精和伊红（H&E）染色，以及解剖学标注。（I）相应放大插图，显示额外的 N-连接聚糖（Hex5dHex1HexNAc5）在门管区结构中的空间定位。比例尺：500 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

MALDI-MSI 是糖组空间生物学研究中一种新兴的工具。重要的是，尽管本实验方案侧重于使用特定硬件进行数据采集，但它可轻松适配于多个厂商的 MALDI-MSI 平台13。在方法 4 之前，样品处理步骤完全相同，尽管某些厂商可能需要使用专用载玻片。通过采用针对特定 MALDI-MSI 平台的参数进行数据采集的调整，可实现本方案的快速适配。数据处理可使用厂商专用软件（详见步骤 5），或者 alternatively，也可采用适用于严格且可重复的 MALDI-MSI 数据处理的平台19。

基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）是一种特别有用的工具，可用于理解生物学，因为不同的器官、组织和细胞具有不同的糖组分布模式。肝脏非常适合进行糖组分析，因其含有高水平的糖原以及多种N-连接聚糖13。其他器官则具有更高水平和更多样性的N-连接聚糖，但糖原含量较低13。重要的是，糖组会因生物体的代谢状态和疾病状态不同而在不同器官中发生变化，因此糖组提供了丰富的生物学信息来源5,14,15,20。随着针对MALDI-MSI分析的独特碳水化合物活性酶的持续发展，有望将糖组分析扩展至糖组中其他正交的生物分子。

尽管MALDI-MSI具有诸多优势，但与空间生物学中使用的其他工具相比，其目前在分辨率上仍存在局限性。本方案采用50 µm分辨率进行数据采集。虽然该分辨率非常适合生理学分析，但单细胞分辨率的数据将显著推动该领域的发展21。特别是，在采用酶喷雾并随后在高湿条件下孵育的方法中，分子脱定位可能成为提高分辨率的重要障碍。近年来，在样品处理硬件、样品操作方法、数据采集设备、选择性标记技术以及数据处理方面的进展，正推动MALDI-MSI数据采集向细胞级分辨率逼近22,23。然而，在分辨率与信噪比之间存在权衡，且当前MALDI样品制备方法本身存在固有限制，这些因素均需加以考虑。已有极少数特定应用通过样品处理技术24和新型算法的创新，实现了单细胞分辨率的MALDI-MSI，表明针对这些问题的通用解决方案已近在咫尺25,26,27。

数据采集完成后，可对载玻片进行染色 通过 H&E 用于组织学注释。然而，MALDI-MSI 数据采集过程常伴随细胞和组织损伤，因此该策略限制了细胞注释的完整性。另一种方法是使用连续组织切片，分别用于 H&E。该策略可提供高质量数据，但需要对离散的样品切片进行比对和整合。

值得注意的是，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织非常适合通过基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）进行糖组分析，仅需对样本制备方案进行少量修改13。然而，FFPE组织无法有效用于代谢组学及其他类似分析，因此对于多组学研究，建议采用此处详述的新鲜冷冻样本28。样本制备是任何质谱成像（MSI）流程中针对不稳定生物分子的关键环节，需要采用特殊的样本采集与处理方法17,29,30。

随着硬件和软件的显著进步，扩展基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）方法的普适性和广泛应用的技术正在迅速发展19。此外，近期结合机器学习与人工智能的前沿多组学28和多模态21方法，在处理这些高度复杂的數據集方面尤其具有前景31。

披露

R.C.S.、M.S.G. 和 C.W.V.K. 是佛罗里达大学先进空间生物分子研究中心（Center for Advanced Spatial Biomolecule Research, CASBR）的联合主任，同时也是 Sugar3 LLC 的联合创始人。R.C.S. 曾从 Maze Therapeutics 获得研究资助和/或咨询费。M.S.G. 曾从 Maze Therapeutics、Valerion Therapeutics、Ionis Pharmaceuticals、PTC Therapeutics 和 Aro Biotherapeutics 获得研究资助、研究化合物和/或咨询费。M.S.G. 还担任切尔西希望基金会（Chelsea's Hope）、葡萄糖转运蛋白1缺乏综合征基金会（Glut1-Deficiency Syndrome Foundation）以及成人聚糖原样小体疾病基金会（Adult Polyglucosan Body Disease Foundation）的科学顾问委员会成员。

致谢

我们感谢Vander Kooi、Sun和Gentry实验室成员富有成效的讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）生物样本获取项目资助 & 肯塔基大学马基癌症中心转化病理学共享资源中心，P30CA177558（资助D.B.A.），R01AG066653、R01CA266004、R01AG078702、R01CA288696、RM1NS133593（资助R.C.S.），R35NS116824（资助M.S.G.），R01DC019054（资助C.W.V.K.），以及佛罗里达大学医学院。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
吸水垫Denville ScientificB1623
乙腈（ACN）Sigma-Aldrich34851-4X4L
铝箔Fisher Scientific 15078292
柠康酸酐Sigma-Aldrich125318
锥形管（15 mL）Alkali ScientificCW5600
考普林瓶DWK Life Sciences900570
冷冻切片机 LeicaCM1860
冷冻切片机样品夹头Leica14041926491
干燥器Bel ArtF424004131
透析杯Thermo Fisher88400
乙醇Fisher Scientific 22032601
食品蒸锅Rival CKRVSTLM21  
玻璃内衬（70 mm）Gel CompanyLGI50
糖原Sigma-AldrichG8876标准品
辣根过氧化物酶（HRP）Sigma-AldrichP8125标准品
高效液相色谱用水（HPLC水）Sigma-Aldrich270733-4X4L
HTX 喷雾仪HTX TechnologiesM5
盐酸Fisher Scientific A144-500
异淀粉酶MegazymeE-ISAMY
Knauer 泵KnauerP 4.1 S
低剖面刀片Electron Microscopy Sciences63059-01
M1 封片剂Epredia1310
质谱仪Bruker DaltonicstimsTOF fleX
微量离心管（1.5 mL）Alkali ScientificCN3016
针头BD305109
中性缓冲福尔马林（NBF）Millipore sigmaHT501128-4L
氮气AirgasNIUHP300
磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher Scientific SH30256.FS
PCR管MedSupply Partners62-1091-1
PNGase F PRIME-LY ULTRA Bulldog BioNZPULT10LY
SCiLS LabBruker Daltonics1889000
摇床Thermo Scientific88882007
载玻片  Electron Microscope Sciences71873-02
载玻片邮寄盒RPI products212620A
超声破碎仪（Bioruptor Pico）DiagenodeB01080010
无菌镊子DR InstrumentsS08098
无菌手术刀WPIWPI-500240
无菌剪刀Fine Science Tools14084-08
注射器  Grainger19G342
注射泵New EraNE-300
胶带Fisher Scientific 15-901-R
细毛笔Anezus#00
三氟乙酸Sigma-AldrichT6508-1L
调谐混合液，ESI低浓度AgilentG1969-85000
称量舟Sigma-AldrichHS120882
二甲苯Sigma-Aldrich534056
α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）Cayman Chemical Company15254

参考文献

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利用质谱技术对糖组进行空间分子成像
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