方法文章

动态钳技术用于研究与自闭症相关的神经元兴奋性损伤

1.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/69155

⸱

2025年10月17日

 , 
1Department of Biology, Miami University

本文内容

摘要

动态钳电生理技术可用于建立神经元放电缺陷与离子通道功能障碍之间的因果关系。本文介绍了在小鼠小脑浦肯野神经元中应用动态钳的技术与实验方案，并指出了有用的资源和技术注意事项。在一个代表性研究中，我们向Tsc1-/-浦肯野神经元中引入模拟的钠电导，以恢复其重复放电能力。

摘要

自闭症谱系障碍（ASD）由多种遗传和环境因素引起。尽管大量与ASD相关的突变会破坏突触的发育或可塑性，但越来越多的研究表明，这些突变还会改变电压门控离子通道的表达和功能，从而导致神经元固有兴奋性的缺陷。全细胞电压钳记录可用于表征ASD相关突变如何影响离子通道功能。然而，这些实验无法直接评估离子电导的改变如何影响神经元动作电位的发放。动态钳电生理技术通过将用户定义的离子电导实时注入活体神经元，弥补了这一空白。该方法可对离子通道特性变化如何影响特定细胞类型电活动进行因果性检验。在本方法学文章中，我们描述了如何在急性制备的小脑脑片中、于生理条件下记录成年小鼠浦肯野神经元时，实施动态钳电生理技术。浦肯野神经元是本研究特别相关的模型，因其具有自发产生重复性、高频（20–100 Hz）动作电位的固有能力，且在ASD相关的小脑环路功能障碍中始终被涉及。我们聚焦于Tsc1基因，其功能缺失突变是ASD最常见的单基因病因之一。在小鼠浦肯野神经元中，Tsc1的缺失也与电压门控钠（Nav）通道表达减少相关。我们采用马尔可夫动力学状态模型来模拟并重现浦肯野神经元Nav电导特性，并进一步利用动态钳技术直接评估Nav电导变化对完整小脑浦肯野神经元固有放电活动的影响。我们提供了修改和调优离子电导模型的操作指南与资源。通过整合离子电导建模、动态钳技术以及传统的膜片钳技术，该方法为将遗传扰动与ASD相关神经元的生理结果相联系，提供了一个强大且灵活的研究框架。

引言

先前关于自闭症谱系障碍（ASD）分子与细胞驱动机制的研究，通常强调突触功能障碍在其病理生理过程中的核心作用1,2大量研究表明，兴奋性突触密度增加2,3,4，突触修剪功能受损5以及突触后密度蛋白的改变6,7 在自闭症谱系障碍（ASD）模型中，突触功能障碍被认为是主要的病理机制。然而，近期研究表明，神经元内在兴奋性的改变同样是驱动ASD病理的重要因素。例如，ASD转基因小鼠模型及患者来源的细胞系研究发现，小脑浦肯野细胞的动作电位生成能力受损8,9,10 皮层锥体神经元11以及皮层锥体神经元亚类中树突兴奋性和突触整合能力的减弱12通道病涉及功能丧失性突变 SCN2A，编码电压门控钠（Nav）通道Nav1.2的孔形成α亚基 亚基，现已被公认为自闭症谱系障碍（ASD）的一种单基因致病原因13，并已被证明会导致多种中枢神经元固有兴奋性的缺陷14,15,16,17随着这类研究的深入，建立离子电导的病理性改变与这些改变对神经元及神经环路功能影响之间的因果关系显得尤为重要。动态钳电生理技术为此提供了一种有效的研究方法。Sharp 等（1992 和 1993）18,19，以及Robinson和Kawai（1993）20 最初描述了动态钳技术，其中将模拟的非线性离子电导（无论是否具有电压依赖特性）注入活体神经元，使研究者能够实时评估电压门控离子电导的特性或假定变化对神经元放电活动的影响21,22.

动态钳实验的实施得益于多个可免费获取的软件系统，例如 RTXI23QuB24,25和 StdpC26；然而，近期的技术进步已通过商用即插即用系统简化了动态钳制的实施，这些系统可在单台计算机和单一软件包内实现模型电导的建立、修改和应用。本文提供了使用 Sutter dPatch 系统进行动态钳制的实验方案27 并提供一个示例研究，用于检测结节性硬化症1（tuberous sclerosis 1, TSC1）靶向缺失如何影响Tsc1)9，这是自闭症谱系障碍（ASD）突变的常见位点28，由于电压门控钠电导表达的改变，影响了小脑浦肯野神经元的固有放电活动8.

方案

所有动物实验均按照迈阿密大学机构动物护理和使用委员会批准的方案（方案编号 #1044）进行。实验使用了雄性和雌性野生型 C57BL/6J 小鼠，以及以 C57BL/6J 品系为背景的转基因小鼠品系。电生理学实验中，动物年龄为 6–7 周。所有记录均来自小脑蚓部第 5、6 或 7 小叶的浦肯野神经元。

1. 普肯耶神经元膜片钳实验的装置设置与组织制备

  1. 配制1 L人工脑脊液（ACSF），其中包含：125 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、25 mM NaHCO3、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2和25 mM葡萄糖，pH值为7.4（约300 mOsM/L）。同时配制250 mL“切割液”，其中包含：240 mM蔗糖、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、0.5 mM CaCl2和7 mM MgCl2。在使用前至少20分钟以及整个实验过程中，持续用碳合气（95% O2/5% CO2）对ACSF和切割液进行通气（鼓泡）处理。
  2. 准备一个装有ACSF的脑片保存室以备后续使用。确保小脑切片（一旦放入切片室）两侧均浸没于ACSF中。可通过将切片置于一张完全浸没且拉紧的尼龙网筛上来实现此目的。
  3. 准备手术台。准备好四段胶带，用于固定麻醉后的动物。在一个盛有冰的桶或冰盘中，将培养皿的下半部分倒置放入冰中，使皿壁朝下、皿底朝上。在培养皿底部放置一张滤纸（≥3 cm2），并用2–3 mL切割液充分浸润。
    注：在本实验中，使用Compresstome振动切片机切割350 µm厚的旁矢状面小脑切片。使用Compresstome时，待切组织被粘附于一根可穿过外围细金属管的塑料样品管上。切片过程中，样品管被推过保持固定的金属管。组织粘附于样品管后，需将其包埋于温热的2%琼脂糖中。Compresstome的刀片被粘在固定支架上，该支架连接至振动切片机的机械臂。其他类型的振动切片机可能无需将组织包埋于温热琼脂糖中，但应同样适用于本实验。
  4. 同时，在冰上放置一片单刃剃须刀片和一个盛有切割液的小型（10 mL）烧杯。准备一个冷却块，用于在将温热琼脂糖加入样品管后迅速冷却；另准备一支装有预冷切割液的30 mL注射器，置于冰上。确保该30 mL注射器通过鲁尔锁公接头连接一段30–60 cm长的静脉输液管（IV管），输液管末端连接一根带有鲁尔锁母接头的针头（≥26 G）。
  5. 将剩余的切割液放入-80 °C冰箱中冷冻。当切割液形成冰沙状（约20–25分钟）后，从-80 °C冰箱中取出并置于冰上。
  6. 通过腹腔注射方式，以每公斤动物体重1 mL的剂量给予5–8周龄成年小鼠氯胺酮（10 mg/mL）与赛拉嗪（0.25 mg/mL）混合麻醉剂进行麻醉。
  7. 通过将0.5 g琼脂糖溶解于25 mL切割液中制备2%琼脂糖溶液。待动物麻醉成功（对脚趾夹捏无反应）后，将2%琼脂糖溶液加热（微波炉约30秒），然后转移至40 °C水浴中保温。
    注：步骤1.8–1.18必须在温热琼脂糖凝固前迅速完成。
  8. 用胶带将动物四肢固定于手术台上。使用剪刀打开动物胸腔，注意避免损伤肺部和腹腔器官。使用止血钳或持针钳夹住肋骨并撑开，暴露心脏。操作时可将止血钳夹于胸骨上，并小心将其向动物前侧方向压下（工具指环靠近动物头部）。
  9. 将连接30 mL注射器的针头插入左心室，并用止血钳夹紧针头周围组织，使针头固定于左心室内。使用手术剪在右心耳处剪开一小口，然后迅速用25 mL预冷的切割液灌注动物全身。
    注：确保灌注液从左心室进入，从右心房流出，以清除动物循环系统中的血液。
  10. 灌注完成后，迅速将动物断头，并沿头部中线向bregma方向剪开头皮，暴露颅骨表面。
  11. 使用剪刀清除颅骨后部的结缔组织，并去除多余的脊髓组织，确保脊髓不从枕骨大孔突出。
  12. 将剪刀一叶插入枕骨大孔，沿颅骨两侧颞部向bregma方向环形剪开，但在bregma处保留部分颅骨组织。
  13. 将剪刀一叶或精细镊子的一半插入枕骨大孔，向上提起，使颅骨与脑组织分离。在抬起颅骨时，注意避免剪刀或镊子刺入脑组织。
  14. 使用手术铲工具从脑前部下方轻轻铲起脑组织，小心将其转移至盛有预冷切割液的10 mL烧杯中，转移过程中注意保护小脑。此时更换为洁净手套。
  15. 小心使用手术铲工具将脑组织从烧杯中取出，置于滤纸上（放置于培养皿中）。使用单刃刀片在距中线数毫米处沿旁矢状面进行切割，弃去较小的旁矢状切片部分。在前脑中部（小脑前方）做第二次冠状切口，弃去小脑前方的冠状切片部分。
  16. 将单刃刀片插入前脑前部下方并轻轻抬起，旋转剩余组织，使最初旁矢状切面朝下（贴于滤纸上），未切割的小脑半球朝上。
  17. 将样品管垂直置于冰上，并在其表面涂一层薄薄的超级胶水（氰基丙烯酸酯粘合剂）。使用带有90°弯角的铲形工具，小心地将脑组织从滤纸上转移至样品管表面，保持组织方向不变。确保未切割的小脑半球仍朝上。组织放置并粘附于样品管后，将金属管向上滑动，使其包裹住脑组织。
  18. 使用电动10 mL移液器，将温热的琼脂糖注入样品管中（包埋脑组织）。通过将冷却块夹在金属管周围约30秒，迅速冷却已包埋于温热琼脂糖中的组织。
  19. 将样品管放入振动切片机的浴槽中，并向浴槽内加入冰沙状切割液。在切片过程中持续对切割液通气，但避免气泡直接接触小脑切片。
  20. 切割300–350 µm厚的旁矢状面切片，并立即将每一片切片转移至装有通气处理的室温ACSF的切片保存室中。所有切片转移完毕后，将切片保存室置于33 °C水浴中孵育25分钟。
  21. 水浴孵育25分钟后，再次将切片保存室移至室温环境中，至少再静置35分钟，之后方可从小脑切片上进行膜片钳记录。

2. 在动态钳制中配置基于马尔可夫的电导模型

注意：动态钳（dynamic clamp）是指将模拟的电导实时施加于活细胞的技术。通过尖锐电极或膜片钳电极记录/采样细胞膜电压，将数字化信号发送至动态钳软件；该软件根据所应用的离子电导模型，计算出对应采样电压的适当动态钳电流注入值。计算得到的动态钳电流注入信号被传送至放大器及头级，再通过电极注入细胞。为了将模拟电导恰当地添加到能够产生动作电位的细胞中（动作电位会引起膜电压的快速瞬时变化），电压采样频率必须足够高，且电压采样与动态钳电流注入之间的时间延迟（有时称为延迟时间，latency）应尽可能小并保持恒定29。

  1. 在进行任何动态钳制实验之前，需建立或获取拟在实验中使用的离子电导的数学模型。这些模型可以是马尔可夫动力学状态模型、霍奇金-赫胥黎（Hodgkin-Huxley, HH）模型，或被动（线性）电导模型。应确保所选的电导模型能够准确再现目标离子电导的动力学特性和电压依赖特性。
    注意：实验人员可在动态钳实验中使用之前，通过测试所建模的离子电导来验证其特性，计算机模拟在电压钳制模拟研究中。Markov动力学状态模型和HH电导模型的重要特性与注意事项在讨论部分进行了描述。以下步骤介绍了如何在动态钳制软件中建立Markov电导模型。
  2. 创建或获取用于动态钳实验的电导模型的马尔可夫状态转移图。利用该图在动态钳软件（如下所述）中准确构建马尔可夫电导模型。
    注意：SutterPatch 是 dPatch 放大器的数据采集软件。动态钳实验可在该软件内进行，允许在电流钳协议期间通过电流注入来组装和施加模拟的电导。图中显示了基于小鼠浦肯野神经元 Nav 电流测量结果构建的电压门控钠电导的马尔可夫状态转移图。 图1A该模型由 Ransdell 等人于 2022 年建立。30 并已被用于研究浦肯野神经元放电中持续性钠电流和恢复性钠电流组分的作用31门控状态（C、IC、IF、IS 和 O）通过转换速率常数相互连接，这些常数用变量表示（即 S0、S3、S1、S4）。该模型用于代表性动态钳实验，可在 GitHub 上下载： https://github.com/morenomdphd/Resurgent_INa
  3. 在数据采集软件中，打开 动态钳编辑器 窗口从 SutterPatch 标签 > 动态钳制编辑器 或单击相应图标 仪表盘 窗口。动态钳编辑器窗口的部分内容如下所示： 图1B.
    注意：动态钳制编辑器窗口包含在电流钳制记录协议期间应用模型化电导所需的所有设置。电导池界面（图1B，左上角）允许用户对模型电导组进行组织并同时加载。
  4. 在 电导池 界面（图1B，左上角），通过点击创建一个池 新 并根据需要命名。选择一个电导池后，在窗口右侧的探头选择器界面中（图1B，左下角） 选择 相应电导池的模型类型（模型-马尔可夫、霍奇金-赫胥黎、可变电导等），以及模型电导应在何时应用，例如在常规/方案过程中激活模式）。头级选择器界面还允许选择动态钳制 更新速率 （以 kHz 为单位）以及 电压信号源 （参见 图1B，右侧）。对于 电压信号源选择记录电压信号的前置放大器。
  5. 在 前置放大器选择器 面板，以钠离子电导马尔可夫模型为例（图1A），选择 马尔可夫模型 用于 模型，扫描期间 用于 激活模式, 200 kHz 用于 更新速率，以及 Headstage 1 用于 电压信号源. 检查 应用 和 输出命令信号至AuxOUT1 以响应电压信号启动模型计算，并分别向任何电流钳制协议添加动态钳制电流注入（图1B左下角
  6. 主界面下方 动态钳制编辑器 面板是状态矩阵（图1C，底部）。通过先点击状态矩阵进行编辑 编辑模型参数 在 前置放大器 选择器界面（图1B，左下角）。此时将出现一个与编辑器并列的新窗口，名为 动态钳制马尔可夫模型参数在此面板中，输入表示马尔可夫模型电导的状态矩阵方程。
  7. 在 通道设置 面板（图1B，右上角），选择应应用的已保存电导模型（在动态钳中）。或者，选择一个空通道并开始创建新的模型电导。在此面板右侧，输入 V反转 （模拟电导离子的反转电位）。在本研究中使用钠电导时，输入55.0 mV，以反映基于ACSF和膜片电极内液的钠离子反转电位。
  8. 也在以下内容中 通道设置 面板，提供所选电导的动能状态数量（参见 图1B，右上角，红色方框）。在此处输入 9，以反映所建模电导的 9 个动力学状态（参见 图1A).
  9. 下方 通道设置 面板是 状态方程 面板。将状态转移速率常数方程适当地放置在 门控状态矩阵 以反映马尔可夫模型的拓扑结构。将方程输入到 状态方程 面板并提供一个ID，从 "S0" (图1B，中段。
    注意：只要这些变量在方程中被正确赋值，方程输入的顺序并不重要。 门控状态矩阵 以反映马尔可夫模型的拓扑结构。
  10. 填充 门控状态矩阵 利用现已确定的速率常数变量，点击 编辑状态矩阵 在右侧的 状态方程 面板（图1B，中间）。每个动力学状态均以数字编号，从0开始。例如，对于包含状态X和Y的双动力学状态模型，这些状态将被称为 "0" 和 "1" 并包含两个转换速率常数 a1 和 b1，其中 a1 表示从 0 到 1 的转换，b1 表示从 1 到 0 的转换。
  11. 为了恰当地使用这些方程进行连接 状态矩阵编辑器 (图1B，底部），将速率常数输入到一个行列编号均从0开始的表格中（示例见 图1C).
    注意：状态之间的转换由其在本表中的位置决定 "行转列"例如，在步骤 2.1 的双态模型示例中，从状态 0 到状态 1 的转变依赖于速率常数 "a1" 随后置于第0行第1列。该转移速率常数 "b1" 驱动从状态1到状态0的转变，因此速率常数应置于第1行、第0列。在 图1C，示例门控状态矩阵中的速率常数反映了所示Nav电导模型的拓扑结构 图1A例如， "S0" 是定义从IC1到IC2动力学状态转变的速率常数；因此， "S0" 位于第 0 行，第 1 列 门控状态矩阵 (图1C）。定义每个速率常数变量的转变速率常数方程随后填充一个 填充态矩阵 (图1C，下部。
  12. 由于速率常数方程通过状态矩阵编辑面板相互关联，相应的行和列将自动填充 连接 方程旁边的面板图1B，右中）。请注意代表性钠电导模型中的开放/导通状态（图1A），加入到第7行和第7列中 图1C （顶部，红色方框），这一步骤对后续操作至关重要。
  13. 在 图1B （右下角），使用 电导方程（纳西门子） 面板用于定义在动态钳制过程中将应用的模型电导的幅值。在马尔可夫模型中选择开放/导通状态，并提供一个电导值（图 1B，下方红色方框。
  14. 对于本实验，请输入 "400 nS" 进入 "G7" 方框中添加的峰值Nav电流值与在小鼠浦肯野神经元上通过电压钳实验测得的峰值Nav电流相似。
  15. 上述步骤完成后，单击 加载 在启动电流钳程序后，使模型准备好进行动态钳应用。
  16. 使用类似的方法来构建HH模型；但是，需添加方程以定义独立的门控状态（在 门电路方程）以及电导率在 G最大值.
  17. 要应用动态钳制电导，首先使用电流钳程序创建一个常规流程 常规编辑器 （点击） SutterPatch 标签 > 常规编辑器) (图1D）。要创建电流钳程序，请选择 父级输出通道 （在此示例中为StimOut1）。这将打开一个面板，允许用户定义程序运行期间的电流命令输出。确保 记录模式 设定为 CC模式 在 常规编辑器.
    注意：在代表性实验中，由于本方案涉及自发放电的细胞，因此采用零电流注入的无间隙电流钳记录程序。
  18. 在 常规编辑器输入通道 (图1D，右上方）定义输入信号，在实验过程中，这些输入信号将显示在记录的示波窗口中。这些输入必须包含一个电压信号，还必须包含常规的指令电流注入以及动态钳制电流注入，称为 电流1 和 AuxIN1，分别（图1D，左下角）。
  19. 对于涉及正向和/或负向电流注入指令的电流钳程序，指令电流注入信号将自动与动态钳电流信号合并。请创建一个虚拟示波器窗口，以减去指令电流信号，从而记录独立的动态钳电流注入。要创建新的虚拟示波器窗口，首先通过选中复选框来选择一个额外的输入通道 虚拟1.
  20. 在……之内 常规编辑器， 在……之下 数学公式编辑器，选择 方程 并选择（在下方 来源频道) 电流钳程序的指令输入信号，在本示例中为 电流1在空白字段中输入一个方程，用以从动态钳制电流注入信号中减去电流钳制指令信号。
    注意：在本示例实验中，此步骤使用以下公式完成 t[3]-t[2]。该 虚拟1 示波窗口现在显示动态钳位电流注入（从电流指令信号中分离出来）。用户可以通过双击输入或输出通道下方来自定义其标签 标记.

3. 从小鼠小脑旁矢状切片中的浦肯野神经元获取电流钳记录

  1. 在电生理实验装置上配备组织切片槽，并用接近生理温度（34–36 °C）的预热人工脑脊液（ACSF）通过重力灌流系统持续灌注。小心将一个矢状旁小脑切片放入切片槽中，并使用切片固定网（slice harp）使小脑切片保持浸没且固定的位置。确保氯化银接地电极和温度探头也浸没在小脑切片槽中并保持稳定。
  2. 使用40倍浸油物镜定位浦肯野神经元层。浦肯野神经元体积较大，呈泪滴状。健康的浦肯野细胞其细胞膜通常表面光滑，细胞核不可见。
  3. 一旦识别并选定用于膜片钳记录的健康浦肯野神经元，将显微镜物镜向上调整。移动并聚焦于连接在电极夹持器和前置放大器头段上的玻璃微电极尖端。通过三轴机器人微操纵器控制头段/微电极。
    注意：在本实验中，确保微电极电阻值为2–4 MΩ，并填充适当的电流钳内液。代表性实验所用内液成分为：144 mM K-葡萄糖酸盐、0.2 mM EGTA、3 mM MgCl2、10 mM HEPES、8 mM NaCl、4 mM Mg-ATP 和 0.5 mM Na-GTP。
  4. 在接近目标浦肯野神经元之前，向电极夹持器的压力接口中加入2–3 mL正压空气。
  5. 在放大器控制面板上切换至电压钳（VC）模式，并启用电极补偿和电极电压偏移功能。在本示例中，点击电极补偿和电压偏移选项旁的自动按钮即可完成。
  6. 启动连续的膜封接测试程序（点击膜测试）。将膜测试参数设置为5 ms左右的扫描时间，阶跃电压为5 mV或10 mV。将保持电位（V-保持）设为0 mV。
  7. 将微电极移向目标细胞，同时调节焦平面，使视野始终聚焦于电极尖端或略低于尖端的位置。将电极置于目标细胞质膜略上方。利用微操纵器和电极尖端的正压推开目标细胞胞体周围的细胞外碎屑，以“清洁”细胞膜表面。
  8. 当目标细胞表面无细胞外碎屑后，缓慢将电极移至浦肯野神经元胞体宽端（轴突由此延伸出）的膜表面附近。当电极尖端接近细胞膜时，膜表面可能出现凹陷（由电极正压所致）。此时释放正压，并通过口吸施加少量负压。
  9. 在放大器控制面板中，将V-保持电位从0 mV调整为-80 mV。在监测膜封接测试的同时，当微电极电阻达到≥1 GΩ时，增加负压，并点击膜封接测试面板上的击穿功能，以破裂细胞膜，形成全细胞膜片钳构型。
  10. 使用短暂的电压钳程序测量细胞膜的被动电学特性（电容和输入电阻值），然后通过放大器控制面板切换至电流钳模式。
  11. 切换至电流钳模式后，进行桥式平衡补偿，补偿程度应达到≥70%。
  12. 在使用膜片电极施加动态钳导电性之前，需校正液结电位误差（该误差根据电极内液与ACSF溶液的组成计算得出）。在代表性实验所用溶液条件下，应施加17.5 mV的液结电位校正值。在动态钳研究中，精确的液结电位校正至关重要，以确保导电性模型使用准确的电压信号来计算动态钳电流注入。

4. 应用动态钳制电导

  1. 由于浦肯野神经元会自发产生重复的动作电位，因此在添加（或去除）模拟的离子电导之前，应先记录其放电特性，以检测细胞状态并测量膜兴奋性的基线特性。通过点击动态钳设置窗口中的加载按钮来应用模拟电导。此时，在dPatch控制器上将可见一个小型的DynC标签，覆盖在CC之上（见图1D，红色框）。
  2. 开启/加载动态钳后，当电流钳程序/协议处于激活状态时，动态钳电导将自动施加。在示波器窗口中查看对应于所选AuxIN1输入信号的动态钳电流注入情况。
    注意：交替记录施加与不施加动态钳介导电导条件下的自发放电，对于确定所施加的模型电导如何影响兴奋性，以及判断实验过程中兴奋性的基线水平是否稳定/一致，具有重要意义。

结果

在本实验中，我们采用动态钳技术，将模拟的电压门控钠（Nav）电导施加于急性分离的成年（6-7周龄）小鼠小脑旁矢状切片中的浦肯野神经元。研究在野生型（对照）小鼠和转基因小鼠上进行，后者通过Cre-loxP重组技术选择性地从小脑浦肯野神经元中删除结节性硬化症1基因（Tsc1）。结节性硬化症复合体（TSC）是一种多系统疾病，由TSC1或TSC2基因的功能丧失性突变引起32,28,33。TSC患者常被诊断患有癫痫、认知障碍和自闭症谱系障碍34,35。浦肯野神经元特异性Tsc1基因敲除的小鼠（本文中称为Tsc1mut/mut）表现出多种与自闭症谱系障碍相关的表型，包括运动功能障碍、社交互动行为异常、发声异常以及重复行为显著增强9,36。Tsc1mut/mut浦肯野神经元的动作电位发放能力减弱（图2A、B），这与Nav电流幅度显著降低（图2C）以及Tsc1mut/mut浦肯野神经元轴突起始段Nav通道表达减少有关8。Tsc1mut/mut浦肯野神经元中的Nav电流在动力学特性和电压依赖性方面与野生型浦肯野神经元相似8。在该转基因Tsc1mut/mut小鼠模型中，我们利用动态钳技术检测向Tsc1mut/mut浦肯野神经元添加Nav电导是否能够恢复其重复放电能力。随后我们进一步检测在野生型浦肯野神经元中减去内源性Nav电导是否会导致与Tsc1mut/mut浦肯野神经元中观察到的类似的放电减弱现象（图2B）。为了减去内源性表达的Nav电导，我们仍通过动态钳施加Nav电导，但将其电导极性反转。

用于模拟浦肯野神经元Nav电导的马尔可夫动力学状态模型（图1A）包含九个动力学状态，其中八个为非导通状态，分别标记为闭合态（C1、C2和C3）、失活-闭合态（IC1和IC2）、快失活态（IF1和IF2）以及慢失活态（IS）。此外还有一个开放/导通态（O）动力学状态30,31。各标记动力学状态之间的转换速率常数（见图1A）决定了模拟通道/电导在各个动力学状态中所占的比例。膜电压影响该模型中所有速率常数。在模拟的电压钳实验中，该模型产生的模拟Nav电流（in silico）以红色显示，位于急性分离的浦肯野神经元实测Nav电流（黑色）的右侧（图1A，下图）。引发这些模拟电流（红色）和浦肯野神经元Nav电流（黑色）的电压指令以黑色显示在电流迹线的上方。注意，在电压指令中，初始去极化步骤（至0 mV）引发快速瞬时的内向钠电流；在模拟迹线中，这反映了通道从非导通的闭合态进入开放动力学状态，产生短暂的内向电流，随后开放态通道进入快失活态（IF1和IF2）并累积。该去极化电压步持续时间较短（5 ms），随后膜电位跳变至-45 mV的中间复极化电压，并在此电位维持80 ms（图1A，下图）。在此复极化电压步期间，可观察到内向钠电流的再次增强，这一电流成分被称为“复苏性钠电流”（INaR）。在-45 mV持续80 ms的过程中，INaR表现出较INaT缓慢的幅度衰减，最终达到一个稳定的内向电流水平，即持续性Nav电流成分（INaP）。在膜复极化过程中，模型中INaR的激活（图1A，下图，红色）反映了模拟通道从快失活态（IF1 + IF2）恢复至开放/导通态。随着时间推移（在-45 mV维持期间），部分处于开放态的模拟通道逐渐累积进入一个吸收型的慢失活态（IS），这表现为INaR的衰减；而另一部分通道则持续停留在开放/导通态，表现为稳态的INaP电流成分30,31。

在代表性实验/结果中，将钠通道Markov电导模型（图1A）添加至急性分离的小脑切片中的成年浦肯野神经元。该实验装置的示意图如图3A所示。为了通过动态钳技术注入电流来施加建模的钠通道电导，我们使用了dPatch放大器系统（见图3B），该系统集成了完整的模数（A/D）和数模（D/A）转换功能。该系统还通过集成的ARM核心处理器（位于PC外部）处理信号转换，并配有集成的FPGA（现场可编程门阵列）电路，能够近乎实时地处理输入信号并反馈输出信号至电流注入电极27。本实验中采用动态钳技术施加了一个复杂的Markov电导模型，我们实现了最高达500 kHz的电流注入更新速率。

在无间隙电流钳记录期间，向 Tsc1mut/mut 普肯耶神经元中加入模拟的钠通道电导（400 nS），导致细胞重复放电频率明显升高（图3C1，D1），表明在这些细胞中添加钠通道电导可能足以挽救 Tsc1mut/mut 普肯耶神经元兴奋性的缺陷，尽管我们并未检验 Tsc1mut/mut 普肯耶神经元兴奋性中报道的全部缺陷表型8。从 图3C2（上）所示的代表性轨迹可以看出，野生型普肯耶神经元具有以高频内在产生重复动作电位的能力。利用动态钳技术，我们通过施加反向（负极性）的模拟钠通道电导（-400 nS），从野生型普肯耶神经元中减去该模拟电导。减去模拟钠通道电导后，重复放电立即出现明显降低（图3C2，下），这一结果也支持以下假设：在 Tsc1mut/mut 普肯耶神经元中测得的钠电流减少，有助于解释这些细胞中观察到的放电特性减弱8。在多个 Tsc1mut/mut 或野生型普肯耶神经元中进行的动态钳实验表明，分别添加或减去钠通道电导对放电频率均产生了稳定一致的影响。添加钠通道电导显著提高了 Tsc1mut/mut 普肯耶神经元的放电频率（P = 0.029）（图3D1），而在野生型普肯耶神经元中，减去钠通道电导则显著降低了放电频率（P = 0.031）（图3D2）（配对样本t检验）。

Dynamic clamp method; conductance model; transition rate matrix; electrophysiology diagram; software setup.
图1在动态钳制软件中建立马尔可夫模型。 (A) 一个马尔可夫状态转移图展示了能够重现小鼠小脑浦肯野神经元中测得的Nav电导特性的模型30该模型包含九个动力学状态，其中8个为非导电状态：三个闭合状态（C）、两个失活-闭合状态（IC）、两个快失活状态（IF）和一个慢失活状态（IS）。模型包含一个开放状态（O），该状态具有导电性。相邻动力学状态之间的连接或随时间的状态占据转换由转换速率常数（标记为S0-S15）定义。注意，每个动力学状态均被赋予一个数值编号红色），使用户能够定义马尔可夫模型及其动力学状态拓扑结构 门控状态矩阵 （如面板所示） C，如下所述）. (B) 展示了用户在 SutterPatch 动态钳制编辑器中操作的面板/图形界面。需要注意的是，这些动态钳制编辑器面板的排列方式与动态钳制软件中的实际布局并不一致。此外，并未展示与动态钳制编辑器相关的所有面板。C（上图）显示了一个门控状态矩阵的示例，其中输入的变量对应于该图中所示状态转移图的拓扑结构 A. 红色方框标注了门控状态矩阵中的第7行和第7列，对应模型的开放（O）动力学状态。在第7列中列出了所有进入开放（O）动力学状态的转换速率常数，而在第7行中列出了所有从开放（O）动力学状态转出的转换速率常数。通过这种组织方式，门控状态矩阵描述了模型的动力学状态数目、速率常数变量以及模型的拓扑结构（动力学状态之间的相互连接关系）。如图所示（DSutterPatch 面板/用户界面用于加载动态钳制电导模型，以及创建电流钳制程序的相关界面。用户与这些模型的交互操作在实验方案步骤 2.17–2.20 中予以描述。 请点击此处以查看此图的放大版本。

电生理分析示意图；神经元放电、电压钳、野生型与 Tsc1^mut/mut 比较。
图 2：Tsc1mut/mut 普肯耶神经元的膜兴奋性较野生型对照减弱。（A）全细胞电流钳记录显示，野生型（上方，黑色）和 Tsc1mut/mut（下方，蓝色）普肯耶神经元中，Tsc1 突变型细胞的放电活动减弱。（B）与野生型对照相比，Tsc1mut/mut 普肯耶神经元的放电频率降低，且在不同细胞间具有一致性。Tsc1mut/mut 普肯耶神经元的平均（±± SEM）自发放电频率显著低于野生型细胞（P < 0.0001）（Welch 非配对 t 检验；对照组 N = 13，n = 32；Tsc1mut/mut N = 6，n = 21）。（C）成年普肯耶神经元中钠离子通道电流（Nav 电流）的电压钳测量结果显示，与野生型对照相比，Tsc1mut/mut 细胞的平均（±± SEM）快速瞬态钠电流（INaT）峰值显著降低（P = 0.007，重复测量双因素方差分析；野生型对照：N = 6，n = 22，黑色；Tsc1mut/mut：N = 6，n = 16，蓝色方块）。右侧插图展示了由 -35 mV 去极化脉冲诱发的 INaT 记录示例，位于图 C 右侧。数据先前发表于 Brown 等人8。请点击此处查看该图的放大版本。

使用Nav电导模型和放大器装置的神经元放电动态；图表显示放电频率。
图3：使用动态钳技术确定离子电导对浦肯野神经元兴奋性的影响。动态钳技术包括通过记录电极采样膜电位，并基于所采样的电压计算模型电导的电流输出，然后通过电流注入电极将计算得到的电流施加到生物细胞上。图（A）展示了该实验装置。如果电压采样的频率足够高，并且电压采样与施加计算电流之间延迟（潜伏期）极小，则该技术可用于评估添加或减去模拟电导对神经元放电和膜兴奋性的影响。（B）在代表性实验中，使用SutterPatch软件和dPatch放大器系统获取动态钳记录。 dPatch是一种膜片钳放大器，具有外部信号处理器和完全集成的数字化器，非常适合进行动态钳记录（见讨论部分）。（C）代表性电流钳记录显示了在使用动态钳添加或减去400 nS模拟Nav电导前后，浦肯野神经元自发放电的情况（该模型电导见图1A）。在C1（左图）中，记录来自一个放电减弱的Tsc1mut/mut浦肯野神经元。添加400 nS的Nav电导后，该细胞的放电频率明显增加。而在C2中，记录来自一个野生型浦肯野神经元。在此实验中，模拟Nav电导以相反极性（-400 nS）施加，相当于减去Nav电导，导致重复放电频率显著降低。动态钳电流注入记录（灰色）显示在动作电位放电（电压）记录（黑色）下方。（D）这些动态钳实验的结果显示，在向Tsc1mut/mut浦肯野神经元添加Nav电导后（D1，n = 3），或从野生型浦肯野神经元减去Nav电导后（D2，n = 3），自发放电频率均发生一致且显著的变化（配对Student t检验），分别在Tsc1mut/mut 细胞（P = 0.029）和野生型细胞（P = 0.031）中具有统计学意义。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

小脑环路参与本体感觉和运动控制37,38，但也对社交互动和情绪处理等复杂行为至关重要39,40,41。小脑结构与功能的病理改变常与自闭症谱系障碍（ASD）相关42,43,44,45,46。小脑环路结构简单47，且其在ASD病理中的作用明确，因此成为研究ASD行为缺陷的分子与细胞驱动机制以及潜在治疗策略的理想脑区。动态钳制电生理技术为这些研究提供了重要工具，使研究者能够直接检验与ASD相关的离子通道特性或离子电导改变与小脑神经元放电之间的因果关系。尽管动态钳制方法特别适用于研究ASD相关的神经元兴奋性变化，但该技术也适用于探究影响可兴奋膜细胞的多种病理机制。此外，动态钳制仍是解析神经元和肌肉细胞调控并维持适当动作电位发放的复杂过程的优秀工具。

精确执行动态钳实验需要对技术参数进行严格控制。具体而言，实验人员应了解并理解电压采样与电流注入之间延迟的潜在变异性（通常称为抖动29）所带来的影响，同时还需考虑电极的被动特性、空间钳制限制以及被研究实验体系的生理保真度。Bettencourt 等人（2008）48 和 Butera 等人（2001）29 此前已表明，实现至少 50 kHz 的高采样率对于准确捕捉快速离子电导至关重要，反馈延迟应理想地保持在采样间隔的 25% 以下（≤ 5 µs）。商业系统（尤其是基于 Windows 的平台）所报告的标称采样率可能具有误导性；因此，通常需要独立验证系统性能，Milescu 等人（2008）25 和 Clausen 等人（2012）49 对此进行了更详细的讨论。空间钳制的限制也必须加以考虑，特别是在处理具有复杂形态和非等电位膜特性的完整神经元时。例如，若通过远离整合部位（如轴突起始段 AIS）的电极施加（或减去）电导，将导致所施加电导效应的表征不准确。电极电阻过高（不良）、电容补偿不足，和/或未校正液结电位误差，也可能导致电压测量值（输入信号）失真，从而错误地应用模型化的离子电导50,51。

数千个马尔可夫模型和霍奇金-赫胥黎（HH）模型可免费供研究人员使用，这些模型存储于在线数据库中，例如由人类脑计划支持的 ModelDB52 和由神经微环路实验室支持的 Channelpedia53。这些数据库包含突触电导、离子通道电导以及基于电导的神经元模型，这些模型主要用 NEURON、MATLAB 或 Python 编写。数据库文件通常提供必要的模型方程，以及有关建模所依据的细胞类型和实验的各类信息。

Markov 模型和 HH 电导模型均包含导通状态（模拟通道开放/激活）和非导通状态（模拟通道关闭）的门控状态/变量。然而，这两类模型在每个采样电压下计算电导值的方式上存在差异：Markov 模型需要更高的计算资源，但能更详细地描述模拟通道的门控特性。例如，在 HH 模型中，导通与非导通状态是相互独立的变量，各自由相应状态的电压输入和门控动力学决定54,55。相比之下，HH 模型并不模拟或限制门控状态之间的转换过程，例如在电压门控钠电导模型中，无法模拟通道从激活/开放动力学状态直接进入快失活动力学状态的转变过程25。这使得 HH 模型的计算复杂度较低54,55，并允许研究者同时引入多个快速电导的 HH 模型，同时保持较高的采样率和更新速率。

马尔可夫动力学状态模型由离散的动力学状态组成，这些状态可能是导通的或非导通的，并且这些状态以固定的拓扑结构相互连接。在马尔可夫模型模拟中，通过计算在每个采样电压下处于导通动力学状态的模拟通道比例，来确定电导值。各动力学状态中模拟通道所占比例（随时间变化）由速率常数决定，速率常数是控制状态占据从一个动力学状态向另一个动力学状态转变速率的参数。速率常数的单位为秒的倒数（s-1），表示单位时间内发生状态转换的概率。根据模型的不同，速率常数的数值可能依赖于电压或温度等动态因素。

在马尔可夫模型中，常微分方程用于描述每个动力学状态随时间变化的占据情况。这些方程描述了基于转移速率常数，系统处于各状态的概率如何随时间演化。这由一个速率矩阵 Q 表示：量子态动力学的微分方程，公式表示，用于教学。56。如上所述，决定状态之间转换的转移速率常数（r）可能受到输入电压（V）以及参数 α 和 β 的影响，后者反映了电导在不同电压下的动力学特性。这些方程可表示为：反应速率公式 \(r_x = a_x \times \exp(V/\beta_x)\)；动力学分析方程。，并且可以通过图形直观表示，图中包含连接各个动力学状态的边（即转移速率常数），展示进入和离开每个状态的转换关系56,57,58。关于马尔可夫模型的构建及其拓扑结构的详细讨论，可参见 Schoening 和 Silva（2024）的研究56。

自从动态钳技术发展为当前形式以来，非线性离子电导得以建模，并通过电流注入电极实时施加于活细胞19,59，该技术的方法与资源不断演进，且由于基于微控制器的低成本系统60以及免费开源软件23,25,26等创新，正变得越来越易于获取且成本低廉。商用系统，如Sutter Instrument公司的dPatch或Cytocybernetics公司的Cybercyte，通过集成化的硬件与软件解决方案，进一步推动了动态钳实验的快速实施27,61。

动态钳技术的多功能性使其具有广泛的应用，包括构建虚拟的化学和电突触、将真实神经元嵌入人工神经网络（或反之），以及添加虚拟离子通道62。重要的是，所施加电导的电压依赖性、动力学特性和幅值均可快速调节，使研究者能够直接检验一个或多个参数的变化如何影响动作电位的发放和膜兴奋性31。当前的系统具备高采样率，能够精确施加快速瞬变的电导，并且可轻松与传统的电生理设备集成60,63，这使得动态钳成为深入理解神经元功能及其功能障碍的理想方法。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢 Sutter Instrument 公司的 Telly Galiatsatos 和 Josh Stanford 在技术咨询方面提供的帮助。同时，我们感谢 Jan Dolzer 在启动 dPatch 动态钳制研究方面给予的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CaCl2Fisher ChemicalC79-500 试剂
毛细玻璃管，硼硅酸盐标准壁，外径 1.5 mm，内径 0.86 mm，长度 10 cmWarner Instruments64-0793仪器设备
CleanBenchTMC63-9090E仪器设备
Compresstome VF-500-Z 振动切片机 Prescisionary Instrumentshttps://precisionary.com/product-category/compresstome-parts/parts-by-model/vf-500-0z/仪器设备
Dell OptiPlex 7080戴尔https://www.dell.com/zh-cn/shop/%E5%8F%B0%E5%BC%8F%E8%AE%A1%E7%AE%97%E6%9C%BA/optiplex-7080-%E5%A1%94%E5%BC%8F%E6%9C%BA%E5%9E%8B%E5%92%8C%E5%B0%8F%E5%9E%8B%E6%9C%BA%E7%AE%B1/spd/optiplex-7080-desktop/s005o7080sffus仪器设备
葡萄糖Fisher ChemicalD16-500 试剂
dPatch 放大器系统Sutter InstrumentFG-DPATCH仪器设备
EGTAEMD Millipore324626-25GM试剂
HEPESFisher Chemical7365-45-9试剂
在线加热器Warner Instruments64-0102仪器设备
KClFisher ChemicalP330-500 试剂
氯胺酮德克拉动物保健产品193.40620.3 试剂
K-葡萄糖酸盐TCI ChemicalsG0040试剂
LinLab 软件Scientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-linlab-2仪器设备
LSE 6L 水浴锅康宁6783仪器设备
Mg-ATPSigma-Aldrich74804-12-9试剂
MgCl2Fisher Chemical012288.A9试剂
Model P-1000 程序控温拉针仪Sutter InstrumentFG-P1000仪器设备
NaClFisher ChemicalS271-500 试剂
Na-GTPMP Biomedicals56001-37-7试剂
NaH2PO4J.T. Baker02-004-220 试剂
NaHCO₃3Fisher ChemicalS233-500 试剂
眼科软件Digital Optics Limitedhttps://www.scientifica.uk.com/products/qimaging-ocular-software仪器设备
剃刀刀片Personna60-0139-CTN仪器设备
切片拨片器Warner Instruments64-0255仪器设备
SliceScope Pro 3000Scientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/slicescope-pro-3000仪器设备
超级胶水Loctite8040-00-142-9193仪器设备
SutterPatch 软件Sutter Instrumenthttps://www.sutter.com/amplifiers/sutterpatch仪器设备
温度控制器Warner Instruments64-2400仪器设备
赛拉嗪MP Biomedicals158307试剂

参考文献

  1. Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), a009886-a009886 (2012).
  2. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nat Commun. 5 (1), 4742(2014).
  3. Connor, S. A., et al. Altered cortical dynamics and cognitive function upon haploinsufficiency of the autism-linked excitatory synaptic suppressor MDGA2. Neuron. 91 (5), 1052-1068 (2016).
  4. Pagani, M., et al. mTOR-related synaptic pathology causes autism spectrum disorder-associated functional hyperconnectivity. Nat Commun. 12 (1), 6084(2021).
  5. Tang, G., et al. Loss of mTOR-dependent macroautophagy causes autistic-like synaptic pruning deficits. Neuron. 83 (5), 1131-1143 (2014).
  6. Fatemi, S. H., Eschenlauer, A., Aman, J., Folsom, T. D., Chekouo, T. Quantitative proteomics of dorsolateral prefrontal cortex reveals an early pattern of synaptic dysmaturation in children with idiopathic autism. Cereb Cortex. 34 (13), 161-171 (2024).
  7. Deneault, E., et al. Complete disruption of autism-susceptibility genes by gene editing predominantly reduces functional connectivity of isogenic human neurons. Stem Cell Rep. 11 (5), 1211-1225 (2018).
  8. Brown, S. P., Jena, A. K., Osko, J. J., Ransdell, J. L. Tsc1 deletion in Purkinje neurons disrupts the axon initial segment, impairing excitability and cerebellar function. Neurobiol Dis. 207, 106856(2025).
  9. Tsai, P. T., et al. Autistic-like behaviour and cerebellar dysfunction in Purkinje cell Tsc1 mutant mice. Nature. 488, 647-651 (2012).
  10. Sundberg, M., et al. Purkinje cells derived from TSC patients display hypoexcitability and synaptic deficits associated with reduced FMRP levels and reversed by rapamycin. Mol Psychiatry. 23, 2167-2183 (2018).
  11. Brumback, A., Sohal, V. Intrinsic excitability defects in specific subtypes of medial prefrontal cortex pyramidal neurons in a mouse model of autism. Neurology. 82 (10), I4-1.010(2014).
  12. Mitchell, D. E., Miranda-Rottmann, S., Blanchard, M., Araya, R. Altered integration of excitatory inputs onto the basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons in a mouse model of Fragile X syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (2), e2208963120(2023).
  13. Sanders, S. J., et al. De novo mutations revealed by whole-exome sequencing are strongly associated with autism. Nature. 485, 237-241 (2012).
  14. Ben-Shalom, R., Keeshen, C. M., Berrios, K. N., An, J. Y., Sanders, S. J., Bender, K. J. Opposing effects on NaV1.2 function underlie differences between SCN2A variants observed in individuals with autism spectrum disorder or infantile seizures. Biol Psychiatry. 82 (3), 224-232 (2017).
  15. Spratt, P. W. E., et al. The autism-associated gene Scn2a contributes to dendritic excitability and synaptic function in the prefrontal cortex. Neuron. 103 (4), 673-685.e5 (2019).
  16. Nelson, A. D., et al. Physical and functional convergence of the autism risk genes Scn2a and Ank2 in neocortical pyramidal cell dendrites. Neuron. 112 (7), 1133-1149.e6 (2024).
  17. Zhang, J., et al. Severe deficiency of the voltage-gated sodium channel NaV1.2 elevates neuronal excitability in adult mice. Cell Rep. 36 (5), 100858(2021).
  18. Sharp, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. Artificial electrical synapses in oscillatory networks. J Neurophysiol. 67 (6), 1691-1694 (1992).
  19. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16 (10), 389-394 (1993).
  20. Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49 (3), 157-165 (1993).
  21. Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27 (4), 218-224 (2004).
  22. Muñiz, C., Arganda, S., Rodríguez, F. B., De Polavieja, G. G. Realistic stimulation through advanced dynamic-clamp protocols. Computational Methods in Neural Modeling. Mira, J., Álvarez, J. R. , Springer. Berlin. 95-105 (2005).
  23. Ortega, F. A., Butera, R. J., Christini, D. J., White, J. A., Dorval, A. D. Dynamic clamp in cardiac and neuronal systems using RTXI. Methods Mol Biol. 1183, 327-354 (2014).
  24. Milescu, L. S., Tabak, J. Dynamic clamp on a Windows PC. Methods Mol Biol. 2188, 157-177 (2021).
  25. Milescu, L. S., Yamanishi, T., Ptak, K., Mogri, M. Z., Smith, J. C. Real-time kinetic modeling of voltage-gated ion channels using dynamic clamp. Biophys J. 95 (1), 66-87 (2008).
  26. Kemenes, I., et al. Dynamic clamp with StdpC software. Nat Protoc. 6 (3), 405-417 (2011).
  27. Dolzer, J. Patch clamp technology in the twenty-first century. Methods Mol Biol. 2188, 21-49 (2021).
  28. Crino, P. B., Henske, E. P. New developments in the neurobiology of the tuberous sclerosis complex. Neurology. 53 (7), 1384-1390 (1999).
  29. Butera, R. J., Wilson, C. G., DelNegro, C. A., Smith, J. C. A methodology for achieving high-speed rates for artificial conductance injection in electrically excitable biological cells. IEEE Trans Biomed Eng. 48 (12), 1460-1470 (2001).
  30. Ransdell, J. L., Moreno, J. D., Bhagavan, D., Silva, J. R., Nerbonne, J. M. Intrinsic mechanisms in the gating of resurgent Na+ currents. eLife. 11, e70173(2022).
  31. Brown, S. P., Lawson, R. J., Moreno, J. D., Ransdell, J. L. A reinterpretation of the relationship between persistent and resurgent sodium currents. J Neurosci. 44 (29), e2396232024(2024).
  32. European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium. Identification and characterization of the tuberous sclerosis gene on chromosome 16. Cell. 75 (7), 1305-1315 (1993).
  33. Henske, E. P., Jóźwiak, S., Kingswood, J. C., Sampson, J. R., Thiele, E. A. Tuberous sclerosis complex. Nat Rev Dis Primers. 2 (1), 16036(2016).
  34. Wiznitzer, M. Autism and tuberous sclerosis. J Child Neurol. 19 (9), 675-679 (2004).
  35. Jeste, S. S., Sahin, M., Bolton, P., Ploubidis, G. B., Humphrey, A. Characterization of autism in young children with tuberous sclerosis complex. J Child Neurol. 23 (5), 520-525 (2008).
  36. Lawson, R. J., et al. Selective deletion of Tsc1 from mouse cerebellar Purkinje neurons drives sex-specific behavioral impairments linked to autism. Front Behav Neurosci. 18, 1474066(2024).
  37. Sherrington, C. S. The Integrative Action of the Nervous System. , Yale University Press. New Haven. (1911).
  38. Russell, J. S. R., Horsley, V. A. H. II Experimental researches into the functions of the cerebellum. Proc R Soc Lond. 55, 57-60 (1894).
  39. Rudolph, S., et al. Cognitive-affective functions of the cerebellum. J Neurosci. 43 (45), 7554-7564 (2023).
  40. Schmahmann, J. D. The cerebellum and cognition. Neurosci Lett. 688, 62-75 (2019).
  41. Beuriat, P. -A., Cristofori, I., Gordon, B., Grafman, J. The shifting role of the cerebellum in executive, emotional and social processing across the lifespan. Behav Brain Funct. 18 (1), 6(2022).
  42. Stoodley, C. J. Distinct regions of the cerebellum show gray matter decreases in autism, ADHD, and developmental dyslexia. Front Syst Neurosci. 8, 92(2014).
  43. Bruchhage, M. M. K., Bucci, M. -P., Becker, E. B. E. Cerebellar involvement in autism and ADHD. Handb Clin Neurol. 155, 61-72 (2018).
  44. Mosconi, M. W., Wang, Z., Schmitt, L. M., Tsai, P., Sweeney, J. A. The role of cerebellar circuitry alterations in the pathophysiology of autism spectrum disorders. Front Neurosci. 9, 296(2015).
  45. Weber, A. M., Egelhoff, J. C., McKellop, J. M., Franz, D. N. Autism and the cerebellum: evidence from tuberous sclerosis. J Autism Dev Disord. 30 (6), 511-517 (2000).
  46. Wang, S. S. -H., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83 (3), 518-532 (2014).
  47. Ransdell, J. L., Nerbonne, J. M. Voltage-gated sodium currents in cerebellar Purkinje neurons: functional and molecular diversity. Cell Mol Life Sci. 75 (19), 3495-3505 (2018).
  48. Bettencourt, J. C., Lillis, K. P., Stupin, L. R., White, J. A. Effects of imperfect dynamic clamp: computational and experimental results. J Neurosci Methods. 169 (2), 282-289 (2008).
  49. Clausen, C., Valiunas, V., Brink, P. R., Cohen, I. S. MATLAB implementation of a dynamic clamp with bandwidth of >125 kHz capable of generating INa at 37°C. Pflugers Arch. 465 (4), 497-507 (2013).
  50. Preyer, A. J., Butera, R. J. The effect of residual electrode resistance and sampling delay on transient instability in the dynamic clamp system. Annu Int Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2007, 430-433 (2007).
  51. Preyer, A. J., Butera, R. J. Causes of transient instabilities in the dynamic clamp. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17 (2), 190-198 (2009).
  52. McDougal, R. A., et al. Twenty years of ModelDB and beyond: building essential modeling tools for the future of neuroscience. J Comput Neurosci. 42 (1), 1-10 (2017).
  53. Ranjan, R., et al. Channelpedia: an integrative and interactive database for ion channels. Front Neuroinform. 5, 36(2011).
  54. Carbonell-Pascual, B., Godoy, E., Ferrer, A., Romero, L., Ferrero, J. M. Comparison between Hodgkin-Huxley and Markov formulations of cardiac ion channels. J Theor Biol. 399, 92-102 (2016).
  55. Andreozzi, E., Carannante, I., D'Addio, G., Cesarelli, M., Balbi, P. Phenomenological models of NaV1.5. A side by side, procedural, hands-on comparison between Hodgkin-Huxley and kinetic formalisms. Sci Rep. 9 (1), 17493(2019).
  56. Schoening, M. E., Silva, J. R. Creating Computational Models of Ion Channel Dynamics. Potassium Channels: Methods and Protocols. , Springer. New York. (2024).
  57. Mangold, K. E., et al. Identification of structures for ion channel kinetic models. PLoS Comput Biol. 17 (8), e1008932(2021).
  58. Silva, J. R., Cooper, P., Nichols, C. G. Modeling KATP-dependent excitability in pancreatic islets. Biophys J. 107 (9), 2016-2026 (2014).
  59. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69 (3), 992-995 (1993).
  60. Desai, N. S., Gray, R., Johnston, D. A dynamic clamp on every rig. eNeuro. 4 (5), (2017).
  61. Han, L., et al. Reconciling computer models and stem cell models of human cardiac repolarization: reply. Cardiovasc Res. 106 (1), 6-7 (2015).
  62. Wilders, R. Dynamic clamp: a powerful tool in cardiac electrophysiology. J Physiol. 576 (2), 349-359 (2006).
  63. Kullmann, P. H. M., Wheeler, D. W., Beacom, J., Horn, J. P. Implementation of a fast 16-bit dynamic clamp using LabVIEW-RT. J Neurophysiol. 91 (1), 542-554 (2004).

重印与许可

标签

动态钳技术用于研究与自闭症相关的神经元兴奋性损伤
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。