本文演示了操作方法及其效果 体内 共聚焦显微镜在干眼病诊断与治疗中的应用及疗效研究 体内 共聚焦显微镜，为未来的研究提供基础。
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摘要
摘要
体内共聚焦显微镜（IVCM）因其无创性和高分辨率而受到广泛关注。该技术能够在细胞水平上对多种与干眼病（DED）相关的 ocular 表面结构进行体内观察和客观定量分析，包括角膜、结膜、睑缘、睑板腺以及毛囊蠕形螨（Demodex）等寄生虫。这一能力有助于眼科医生识别 DED 的特定病因和亚型，从而实现精准诊断、靶向治疗及预后评估。然而，目前仍缺乏标准化的 IVCM 操作与报告规范。熟练掌握眼科专业知识和操作技术对于有效使用该设备并生成高质量报告至关重要。本文详细阐述了针对干眼病患者的 IVCM 检查操作步骤及关键细节，是 JoVE 首个关于 DED 的逐步 IVCM 操作规程。本规程旨在为临床医生提供参考，帮助其避免操作中的低效问题，并持续获取高质量的角膜及眼表图像，以指导临床管理。
引言
由于当地医疗资源有限或患者经济负担较重，干眼症（DED）的临床诊断往往仅关注基本方面（例如裂隙灯显微镜下的观察、主诉眼部干涩和瘙痒）甚至单一指标（例如侵入性泪膜破裂时间、泪液分泌试验或蠕形螨感染）。共聚焦显微镜（IVCM）的应用尚未普及，更不用说其操作流程的标准化。然而，对于配备IVCM设备的眼科机构，作者建议首次就诊患者应接受全面的显微镜检查，以避免漏诊，检查应包括角膜、结膜及睑缘。对于诊断不明确的干眼症病例或需要检测蠕形螨的情况，IVCM尤其适用于提供明确诊断依据。
干眼症（DED）被定义为一种由泪液质量或数量异常以及泪膜稳定性下降引起的慢性眼表疾病。在干眼研讨会II（DEWS II）中，DED被分为五种类型：水样缺乏型干眼（ADE）、蒸发过强型干眼（EDE）、混合型干眼（MDE）、干眼倾向以及临床前期干眼状态1。Ralene 等人总结了共聚焦显微镜（IVCM）在不同类型干眼中的重要临床应用，包括2017年至2022年期间发表的文献2。近期研究表明，炎症在DED的发病机制中起着关键作用3,4。特别是树突状细胞（DCs）的密度可能是与全身免疫介导过程相关的DED的良好指标5。
IVCM 采用共聚焦激光断层扫描技术，其横向和纵向分辨率均为 1 µm。该设备的详细技术参数见 Jeremy 等人发表的报告6。在眼表检查过程中，IVCM 首先用于角膜7，随后用于结膜和睑板腺8。近年来，蠕形螨睑缘炎在临床上受到越来越多的关注9,10。IVCM 可提供角膜、结膜及睑缘的清晰图像，使临床医生能够评估疾病状态，并实现对炎症细胞和免疫细胞的成像与定量分析。
在干眼症（DED）评估中，我们的关注重点包括：角膜上皮细胞（CEC）；上皮下神经纤维（SNF）；上皮间及上皮下炎症/免疫细胞；结膜杯状细胞（CGCs）；结膜炎症/免疫细胞；睑板腺腺泡及开口；毛囊蠕形螨（Demodex folliculorum）和皮脂蠕形螨（Demodex brevis）；以及周围组织中的炎症细胞。这一关注重点源于其病理生理机制：睑板腺功能障碍可导致泪膜脂质层分泌减少或成分改变，从而引起泪液蒸发加快及眼表损伤。蠕形螨感染可导致眼部瘙痒和不适。结膜杯状细胞（CGCs）分泌黏蛋白，这是泪膜的关键组分之一；其数量减少可导致黏蛋白缺乏型干眼症。反之，干眼症本身也会损害眼表结构，包括角膜上皮细胞（CEC）和上皮下神经纤维（SNF），并继而导致角膜和结膜组织中炎症/免疫细胞密度升高。在获得理想的图像后，可有效利用软件内置的定量工具对上述多种细胞进行计数（图1）。然而，由于上皮下神经纤维（SNF）形态多样，其定量需依赖分析软件辅助完成11,12。
IVCM 对于实时评估眼表组织中角膜各层、神经纤维以及炎症/免疫细胞具有不可替代的作用。对于杯状细胞（CGCs）的评估，印迹细胞学是一种替代方法。该技术以结膜穹隆部为靶区，此处杯状细胞密度最高，所得数值通常高于 IVCM 测量结果13,14然而，结果易受染色变异性和操作者技术水平的影响，且耗时较长的实验流程限制了其在临床常规中的应用。睑板腺开口阻塞可直接观察到 通过 裂隙灯显微镜，但该方法无法检测由短小毛囊螨引起的阻塞，而共聚焦显微镜（IVCM）可准确识别此类情况。对于毛囊螨感染的诊断，拔除睫毛后进行光学显微镜检查是一种低成本的方法。尽管该技术操作简单，但仍存在显著局限性：患者的不适感限制了多次取样，且位于睫毛毛囊深部或睑板腺开口处的螨虫无法被检测到15相比之下，IVCM 能够对包括睫毛毛囊和睑板腺开口在内的多个睑缘部位进行全面检查，且患者不适感极小。该方法通过实时成像实现了显著更高的诊断阳性率 体内 在微生境中观察寄生虫16,17.
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方案
检查程序已获得汉口爱尔眼科医院伦理委员会的批准，并已从所有患者处获得知情同意。
注意：患者入选标准包括主诉眼睛干涩、瘙痒的患者，以及前来进行常规眼部检查的个体。患者排除标准包括角膜穿孔或即将发生角膜穿孔的患者、对局部眼用麻醉剂过敏者、年龄过小（例如小于3岁）或过大而无法配合者、睑裂过窄无法容纳眼睑撑开器者、孕妇，以及其他原因无法配合的个体。简要的工作流程图见图2。详细操作步骤如下。
1. 检查前准备
- 材料准备：共聚焦显微镜（IVCM）设备、角膜接触帽、眼科表面麻醉剂、耦合剂、医用棉签、眼睑撑开器、酒精棉球、酒精容器、抗炎眼药水（图3）。
- 了解IVCM设备的关键组件（海德堡视网膜断层扫描仪角膜模块（HRT-RCM）），包括调焦旋钮、监控摄像头、注视引导灯、下颌托、前额托、左右眼切换按钮、用于三轴移动HRT-RCM的旋转旋钮、图像采集按钮和脚踏开关，以及配备专用IVCM软件的计算机，并使用耦合凝胶准备IVCM设备。
- 检查者准备：佩戴口罩，并使用酒精凝胶消毒双手或佩戴一次性手套。
- 设备消毒：使用酒精棉签擦拭设备的前额托和下颌托。
- 操作说明：向患者简要说明该检查无痛，以缓解其焦虑情绪。
2. 检查过程中
- 使用计算机上的配套软件核实并创建新的患者记录。
- 给予表面麻醉剂：在操作前3分钟间隔，于下穹窿处滴入两滴麻醉剂。
- 准备IVCM设备的rostock角膜模块（RCM）：在RCM的激光发射区域涂抹耦合凝胶（确保无气泡）（图4 和 图5），仅需足够量的耦合剂（通常为一至两滴，不宜过多），以确保与角膜接触帽完全接触，最终实现理想的归零界面。安装一次性角膜接触帽。
- 定位设备：将RCM完全缩回。使额托保持水平固定。将监控摄像头调整至受试者颞侧。找到摄像头的止点位置，使其垂直于RCM的光轴。
- 校准焦距：旋转调焦旋钮，直至软件显示最大化的白色光斑，且图像质量值恰好为100。将深度值重置为零（归零）。
- 选择扫描模式：默认使用断层模式，除非另有说明。如需观察毛囊蠕形螨活动，可使用序列模式进行动态图像的连续记录。
- 安置患者：让患者将下巴稳固地放在颏托上，前额紧贴额托。根据患者身高调整检查台和颏托高度。
- 插入眼睑撑开器：嘱患者向下看，同时用棉签抬起上眼睑进行放置；再嘱患者向上看，同时用棉签轻拉下眼睑进行放置。
- 最终指导：再次确认头部位置正确。提醒患者保持放松，避免移动。如有任何不适，立即报告。
- 角膜检查流程
- 首先进行宏观对位：目视调整RCM大致对准角膜顶点（图6）。当RCM接近角膜时，切换至设备的监控摄像头进行微调。引导患者转动视线，使病变角膜的病灶位于RCM正下方。保持轻柔接触，避免角膜损伤。
- 关键技术要点：角膜接触帽物理尺寸较大，但光学区域极小（仅限于激光发射的中心区域）。关键要求：必须实现接触帽与目标组织之间的高精度贴合，因为贴合不良会导致成像伪影（如气泡、油状干扰或信号完全丢失）。
注：进行连续成像时，踩下脚踏开关以延长扫描，获取连续的深度图像，避免遗漏关键数据。
- 分层角膜评估：按以下顺序从浅层至深层进行扫描：角膜上皮细胞层（CEC）、神经纤维层（SNF）、上皮下炎症细胞。
- 以下方涡旋区作为推荐标志点，并检查其邻近的上方/下方区域18。
- 鼻侧结膜检查
- 将焦平面重置至深度值零。在接触帽上涂抹耦合凝胶。嘱患者向颞侧或下颞侧注视。轻柔地将RCM推进至结膜表面。同时操作：右手调整RCM位置以获得最佳视野，左手旋转调焦旋钮，在最外层结膜层中识别杯状细胞。
- 移除眼睑撑开器：嘱患者向下看，用棉签抬起上眼睑进行移除；再嘱患者向上看，用棉签轻压下眼睑进行移除。
- 设备复位：释放并抬起额托。将调焦旋钮归零。在RCM表面重新涂抹耦合凝胶。
- 睑板腺及睫毛毛囊评估
- 患者体位：嘱患者向下注视。检查者操作：轻柔地向内上方提拉并按压上眼睑皮肤，使睑缘与角膜接触帽平面平行。水平移动RCM以观察更多同类型结构图像；垂直移动RCM（从下至上）以在检查睑板腺开口、腺泡及睫毛根部之间切换。
注：初学者在检查睑板腺开口时可翻转眼睑以获得更好暴露。建议本部分检查位置选择上眼睑中央1/3区域。 - 定量标准（机构规程）：评估8个连续毛囊及其邻近的腺泡15，并检查4–8个连续的睑板腺开口。深度校准：为获取清晰的毛囊图像，调焦至毛囊蠕形螨轮廓清晰（如存在）；为获取清晰的腺泡图像，推荐深度约为30–50 µm；对于开口，深度约为30 µm（若存在短毛囊蠕形螨感染，可适当调整以利于观察）19。
- 患者体位：嘱患者向下注视。检查者操作：轻柔地向内上方提拉并按压上眼睑皮肤，使睑缘与角膜接触帽平面平行。水平移动RCM以观察更多同类型结构图像；垂直移动RCM（从下至上）以在检查睑板腺开口、腺泡及睫毛根部之间切换。
3. 检查后处理
- 术后护理：进行手部卫生并彻底消毒双手。使用棉签轻轻擦去眼表残留的耦合凝胶、泪液或碎屑。给予抗生素滴眼液以预防感染。
- 患者须知：建议患者在检查当天避免揉眼。
- 报告撰写：全面分析所有获取的图像，并生成诊断报告。报告要求：每种组织结构至少包含一张图像，如有异常发现，可根据需要增加图像数量。所有选定图像应按检查顺序和深度值排列，并附以准确的描述和测量数据。
- 废弃物处理说明：对于一次性材料（如接触帽、棉签、麻醉剂容器），请将其投入医疗废物桶中，由专业人员进行后续处理。
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结果
所有IVCM显微图像的采集分辨率为384像素 × 384像素，观察视野为400 µm × 400 µm。当设备正确“归零”后，图像中仅可能出现以下三种情况：i）无任何图像（实验失败）：中心光学区未与目标组织接触。ii）仅出现部分图像（图7）或其他异常情况（图8）（实验失败）：中心光学区与目标组织接触不完全或松动。iii）图像清晰且完整（实验成功）：中心光学区与目标组织实现完全贴合（图9至图17）。因此，关键挑战并不在于区分成功与失败的图像，而在于根据操作要求，确保设备的中心光学区与目标组织之间实现正确的对位和充分接触（图7和图8）。以下提供的图像包括正常的 ocular 表面结构（图9至
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讨论
使用关键词进行 PubMed 文献检索 "体内 共聚焦显微镜" 和 "干眼症" （检索于2025年6月）得出 > 300篇出版物。值得注意的是，自2021年以来，每年的发表数量已稳定在每年约40篇论文。IVCM在眼表疾病中的更广泛应用已产生 > 过去二十年（2004–2024年）已有2,000项研究。在临床方面，活体共聚焦显微镜（IVCM）彻底改变了眼表疾病在细胞水平的评估。该技术能够检测亚临床疾病表现，有助于更早诊断和精准干预，这与上述后两类干眼病（DED）高度契合。此外，基于IVCM指导的治疗方案可在客观病情改善时实现循证的药物减量或停药，从而减轻治疗负担及相关社会经济影响。例如，针对睑板腺开口及腺泡阻塞的睑板腺疏通治疗图14 和 图15），针对毛囊蠕形螨感染的抗螨治疗（图14 和 图16），针对炎性细胞增多的抗炎治疗（
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢武汉汉口爱尔眼科医院的 Lina Jin 和武汉亚洲心脏病医院眼科的 Min Chen 协助提供部分图片，同时感谢所有参与本研究的受试者以及参与手术操作的工作人员。本研究由武汉市卫生健康委员会科研项目（WX23A20）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 吸收性棉球 | JIAN QI, 中国 | http://www.hnjianqi.com | 用于制备酒精棉球，小型 |
| 酒精凝胶 | Li Kang, 上海, 中国 | 31107904 | 免冲洗手部消毒凝胶，500ml |
| 卡波姆眼用凝胶 | Vidisic, 德国 | 8187195 | 无菌眼科凝胶，用作耦合剂，10g |
| 角膜接触帽（TomoCap） | Heidelberg, 德国 | 18829 | 光学介质，用于无菌接触角膜 |
| 眼睑拉钩 | Asicon, 中国 | 6102A | 用于撑开眼睛 |
| Heidelberg Eye Explorer 软件 | Heidelberg, 德国 | Version 1.5.2.0 | IVCM 设备配套软件 |
| IVCM 设备 | Heidelberg, 德国 | HRT-?,08398 | 检查用主要设备 |
| 医用棉签 | Esound Med, 中国 | www.e-soundmed.com | 用于清洁患者眼部及辅助撑开眼睛，10cm |
| 75% 医用酒精 | HUICHANG, 中国 | www.huichang888.cn | 用于制备酒精棉球，75%±5%，500ml |
| 0.4% 盐酸奥布卡因滴眼液 | Santen, 日本 | http://www.santen.co.jp | 眼科表面麻醉剂，0.4% (0.5ml: 2mg) |
| 妥布霉素滴眼液 | TOBREX, 比利时 | 8453824 | 抗炎滴眼液，0.3% (5ml: 15mg) |
参考文献
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