保留形态和RNA的钙化动脉组织制备与处理用于数字空间分析

摘要

本方案包含针对钙化血管样本的逐步操作流程：组织处理、脱钙、RNA 验证、钙化水平检测，以及在 Nanostring GeoMx 数字空间分析仪（DSP）上进行感兴趣区域的选择策略。目标是提供一种全面的方法，以保存血管组织形态和RNA，实现可靠的原位转录组分析。

摘要

空间转录组学将全转录组谱直接映射到组织切片上，揭示细胞微环境与基因表达之间的关联，以及这些活动如何驱动健康与疾病状态。尽管该技术已彻底改变了肿瘤学、神经科学、免疫学、发育生物学等多个领域，但在血管生物学中的应用却相对有限，尽管血管疾病仍是全球主要的死亡原因之一。其中两个主要障碍尤为突出：动脉和静脉可用于切片的平坦表面较少，而病变样本（常表现为动脉粥样硬化、血栓形成、斑块沉积或钙化）往往需要脱钙等剧烈处理，这会损害组织形态和RNA完整性。然而，这些血管本身具有同心层状的内膜、中膜和外膜结构，恰恰非常适合进行空间分析，因为每一层都含有特定的细胞类型和基因表达程序，并在血管壁内相互作用。

目前很少有详细的方案专门介绍如何为空间转录组学准备血管组织，这一不足限制了研究人员充分挖掘该技术潜力的能力。为弥补这一空白，我们提供了一种针对具有晚期病变的人体胫动脉优化的逐步操作流程。本方案涵盖了组织处理、固定以及适当的脱钙步骤，以保持组织结构和RNA质量的完整性，随后进行组织学染色以评估钙化严重程度的分级。我们还描述了构建组织微阵列（TMA）以减少批次效应的方法，以及在NanoString GeoMx数字空间分析仪（DSP）上进行感兴趣区域（ROI）选择的策略。

通过降低技术门槛，本方案使血管研究者能够生成可靠的空间转录组学数据，并研究健康与病变血管中各层特异性的转录活性。我们预期该方法将加速揭示钙化、炎症、内膜动脉粥样硬化及其他血管病理过程的潜在机制，并推动空间转录组学在血管生物学中的更广泛应用。

引言

在过去十年中，新一代测序技术与高分辨率成像技术的结合推动了空间转录组学的发展，该技术能够在保留组织切片中每个转录本精确定位的同时实现全转录组的定量分析^1,2。当与快速发展的单细胞RNA测序（scRNA-seq）领域相结合时，空间分析方法为将基因表达特征与组织或器官中的特定细胞类型、细胞状态及微环境关联提供了高效途径，极大加深了我们对疾病机制的理解^3,4,5,6,7。目前已有多个商业化平台正在开发中，例如10X Visium、NanoString GeoMx和CosMx、Slide-seq以及DBiT-seq，这些平台各自配套的实验流程均针对肿瘤和脑组织等柔软且细胞密集的组织进行了优化。该领域正经历爆炸式增长，PubMed在2023年收录的相关文献约为150篇，2024年接近300篇，预计2025年将超过500篇。尽管如此，相较于癌症、神经科学和免疫学领域，血管生物学的研究仍显不足。

硬组织或矿化组织（如骨、软骨、牙齿以及含有牙菌斑且钙化的....

方案

所有采集人体动脉标本的程序均经华盛顿大学人类受试者分部机构审查委员会（IRB）和退伍军人普吉特海峡医疗保健系统（华盛顿州西雅图）IRB 批准。在采集组织前，已从患者处获得书面知情同意书。本研究使用的所有材料和设备均列于材料表中。

1. 组织修剪与固定

1. 组织修剪
   1. 使用多层包装准备运输袋，包括内管、次级容器、外层运输罐和生物危害标本袋。在内层50 mL离心管中加入30 mL储存用杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），其中含1%的4-[2-羟乙基]-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和1%青霉素-链霉素（P/S）。
   2. 将获取的胫前动脉（AT）、胫后动脉（PT）和腓动脉（PR）（理想长度>5 cm）分别置于50 mL离心管中。将运输罐置于冰上，从手术室转移至组织培养室。
      注意：建议获取的样本长度至少为5 cm，以便进行重复实验，并保留足够的组织用于冷冻储存，以备后续其他检测或验证使用。
   3. 将每条动脉转移至含培养基的100 mm培养皿中。使用无菌剪刀和镊子去除多余的血管周围结缔组织，仅保留动脉壁（从外膜向内）。
      注意：应在经RNase失活溶液擦拭过的生物安全柜中操作并修剪组织，以防止RNA污染。使用无菌手术刀和镊子；在不同样本之间，用无菌无核酸酶水冲洗器械以去除残留物，并用70%乙醇彻底擦拭。
   ....

结果

本方案概述了从接收到胫动脉样本到制备组织微阵列切片的完整流程，所获切片可同时保留形态学特征和RNA完整性，适用于空间转录组学分析。此外，本文还详细介绍了用于显示动脉中钙盐沉积的组织学方法、形态学标志物染色技术，以及感兴趣区域（ROI）的选择策略。

在图1中，动脉组织用10% NBF固定（步骤2）。NBF可快速渗透组织，最大限度减少RNA降解，其磷酸盐缓冲液（pH 7.0）可中和固定过程中产生的甲酸，防止pH值降至6以下。在分析仪上选定感兴趣区域（ROI）后，本方案未展示后续步骤。简而言之，紫外（UV）激光精确照射每个ROI，释放带有条形码标记的寡核苷酸。这些寡核苷酸随后通过nCounter或下一代测序进行定量，获得具有空间分辨的基因表达计数数据（步骤6）。多个动脉切片被排列并包埋于同一蜡块中，以降低试剂成本，并为统计分析提供足够的重复样本。所有组织芯必须位于所示区域内，以确保GeoMx仪器能够捕获信号。（图2）。

讨论

本方案详细说明了在NanoString GeoMx DSP平台上对钙化的人体胫动脉进行空间转录组学分析前所需的制备步骤。胫动脉与其他血管一样，具有同心排列的内膜、中膜和外膜三层结构，每层均含有不同的细胞群体，参与调控损伤与修复过程。为实现按层解析的转录组分析，保持这些结构层次的完整性至关重要；然而，若干常被忽视的前期处理步骤可能影响这一目标的实现。

获取动脉组织后，必须去除外膜周围的脂肪组织，同时保持外膜完整；这有助于保留连续的血管壁结构，为感兴趣区域（ROI）的定位提供空间框架。关键步骤之一是保持RNA的质量。我们使用10%中性缓冲福尔马林（NBF）固定组织，因为其中的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）可中和固定过程中产生的甲酸，从而限制酸催化引起的RNA水解。需要注意的是，其他甲醛固定剂（如4%多聚甲醛PFA）提供的甲醛浓度相当，但4% PFA的pH值在储存过程中更容易发生偏移，因此建议现配现用，并在使用前验证pH值。固定后的组织可长期保存于磷酸盐缓冲液（PBS）中，但根据一家医院组织库的研究，若在70%乙醇中长期储存，RNA的得率和完整性会显著下降

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高糖含丙酮酸的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Thermo Fisher Scientific	11995065
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液，1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
青霉素-链霉素（P/S），10,000 U/mL	Thermo Fisher Scientific	15140122
10% 中性缓冲福尔马林（NBF）	Millipore Sigma	65346-M
乙二胺四乙酸（EDTA）	Millipore Sigma	3620
RNA later 稳定溶液	Thermo Fisher Scientific	AM7024	RNA 稳定溶液（RSS）
过氧化氢（H2O2）	Advanced Cell Diagnostics, Inc	322335
靶标修复溶液	Advanced Cell Diagnostics, Inc	322001
蛋白酶 Plus	Advanced Cell Diagnostics, Inc	322331	消化酶补充剂
DapB（阴性对照）	Advanced Cell Diagnostics, Inc	310043
RNAscope 洗涤缓冲液（RNAscope 2.5 HD Red ISH 检测试剂盒）	Advanced Cell Diagnostics, Inc	320058
AMP1	Advanced Cell Diagnostics, Inc	324511
AMP2	Advanced Cell Diagnostics, Inc	324512
AMP3	Advanced Cell Diagnostics, Inc	324513
AMP4	Advanced Cell Diagnostics, Inc	324514
AMP5 红色	Advanced Cell Diagnostics, Inc	324515
AMP6 红色	Advanced Cell Diagnostics, Inc	324516
Fast Red A	Advanced Cell Diagnostics, Inc	324517
人 Ppib	Advanced Cell Diagnostics, Inc	313901
Gill’s 苏木精	Millipore Sigma	GHS132
抗原修复，Tris/EDTA pH 9	Thermo Fisher Scientific	00-4956-58
蛋白酶 K	Thermo Fisher Scientific	AM2546
杂交溶液-Hs WTA	Nanostring	121401102
Hybrislip			杂交盖片
杂交溶液-缓冲液 R	Nanostring	121300313
兔抗 CD45	Cell Signaling	1317
缓冲液 W	Nanostring	121300313
山羊抗兔 IgG-AF647	Jackson Immunoresearch	111-605-144
小鼠抗 SMA-AF488	Thermo Fisher Scientific	53-9760
Syto83	Thermo Fisher Scientific	S11364
手术刀片	BD Biosciences	371110
Superfrost  Plus 显微镜载玻片	Thermo Fisher Scientific	1255015
ImmEdge 笔
切片机刀片	Thermo Fisher Scientific	22-500-125
RNase AWAY			RNase 失活溶液
仪器
HybEZ 杂交炉	Advanced Cell Diagnostics, Inc	321710
GeoMx 数字空间分析仪	Nanostring	型号：GeoMx DSP 数据访问平台：GeoMx DSP 控制中心（版本 3.1.2.12）	通道扫描设置：FITC 通道曝光时间为 300 ms，荧光染料为 AlexaFluor 488；Cy3 通道曝光时间为 50 ms，荧光染料为 Syto83；Cy5 通道曝光时间为 300 ms，荧光染料为 AlexaFluor 647。