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保留形态和RNA的钙化动脉组织制备与处理用于数字空间分析

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DOI：

10.3791/69159

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2026年1月23日

 ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, Department of Surgery, University of Washington, 2Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Washington, 3Division of Vascular Surgery, VA Puget Sound Health Care System

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案包含针对钙化血管样本的逐步操作流程：组织处理、脱钙、RNA 验证、钙化水平检测，以及在 Nanostring GeoMx 数字空间分析仪（DSP）上进行感兴趣区域的选择策略。目标是提供一种全面的方法，以保存血管组织形态和RNA，实现可靠的原位转录组分析。

摘要

空间转录组学将全转录组谱直接映射到组织切片上，揭示细胞微环境与基因表达之间的关联，以及这些活动如何驱动健康与疾病状态。尽管该技术已彻底改变了肿瘤学、神经科学、免疫学、发育生物学等多个领域，但在血管生物学中的应用却相对有限，尽管血管疾病仍是全球主要的死亡原因之一。其中两个主要障碍尤为突出：动脉和静脉可用于切片的平坦表面较少，而病变样本（常表现为动脉粥样硬化、血栓形成、斑块沉积或钙化）往往需要脱钙等剧烈处理，这会损害组织形态和RNA完整性。然而，这些血管本身具有同心层状的内膜、中膜和外膜结构，恰恰非常适合进行空间分析，因为每一层都含有特定的细胞类型和基因表达程序，并在血管壁内相互作用。

目前很少有详细的方案专门介绍如何为空间转录组学准备血管组织，这一不足限制了研究人员充分挖掘该技术潜力的能力。为弥补这一空白，我们提供了一种针对具有晚期病变的人体胫动脉优化的逐步操作流程。本方案涵盖了组织处理、固定以及适当的脱钙步骤，以保持组织结构和RNA质量的完整性，随后进行组织学染色以评估钙化严重程度的分级。我们还描述了构建组织微阵列（TMA）以减少批次效应的方法，以及在NanoString GeoMx数字空间分析仪（DSP）上进行感兴趣区域（ROI）选择的策略。

通过降低技术门槛，本方案使血管研究者能够生成可靠的空间转录组学数据，并研究健康与病变血管中各层特异性的转录活性。我们预期该方法将加速揭示钙化、炎症、内膜动脉粥样硬化及其他血管病理过程的潜在机制，并推动空间转录组学在血管生物学中的更广泛应用。

引言

在过去十年中，新一代测序技术与高分辨率成像技术的结合推动了空间转录组学的发展，该技术能够在保留组织切片中每个转录本精确定位的同时实现全转录组的定量分析1,2。当与快速发展的单细胞RNA测序（scRNA-seq）领域相结合时，空间分析方法为将基因表达特征与组织或器官中的特定细胞类型、细胞状态及微环境关联提供了高效途径，极大加深了我们对疾病机制的理解3,4,5,6,7。目前已有多个商业化平台正在开发中，例如10X Visium、NanoString GeoMx和CosMx、Slide-seq以及DBiT-seq，这些平台各自配套的实验流程均针对肿瘤和脑组织等柔软且细胞密集的组织进行了优化。该领域正经历爆炸式增长，PubMed在2023年收录的相关文献约为150篇，2024年接近300篇，预计2025年将超过500篇。尽管如此，相较于癌症、神经科学和免疫学领域，血管生物学的研究仍显不足。

硬组织或矿化组织（如骨、软骨、牙齿以及含有牙菌斑且钙化的动脉或静脉）已被证明远不如其他组织易于处理。技术上的障碍是多方面的。首先，具有致密矿物基质的组织需要通过螯合或酸处理来去除矿物质，而这些较为剧烈的处理方式可能导致RNA断裂并破坏组织形态。其次，病变组织（无论是受损还是纤维化组织）通常仅含有少量嵌入大量细胞外基质（ECM）中的活细胞，这会降低转录本的产量并增加数据标准化的难度。此外，血管组织具有围绕中空管腔的薄层同心结构（包括内膜、中膜和外膜）。由于管壁较薄，尤其是仅由单层细胞构成的内膜，捕获区域可能仅含有极少量组织，且在长达数小时的染色和杂交步骤中切片容易撕裂或脱落。因此，尽管心血管疾病在全球范围内始终位居死亡和严重发病的主要原因之列，针对血管组织的空间转录组学研究仍然十分稀少。现有的方案类论文绝大多数侧重于数据处理、可视化或非NanoString GeoMx8,9,10,11,12,13的技术平台。在这些论文中，极少有描述针对胫动脉病变组织的实验操作方法，而胫动脉是外周动脉疾病（PAD）中具有重要临床意义的血管，尤其在糖尿病患者中，该人群在受影响群体中的比例正不断上升。

为解决这一空白，我们提出了一套针对外周动脉疾病（PAD）患者截肢术后获取的钙化人胫动脉的综合性实验流程。该方案涵盖以下步骤：（1）手术室取材后的组织修剪与解剖；（2）适当的组织固定与脱钙处理，以保持组织形态学结构及RNA的完整性；（3）构建成本较低的组织微阵列（TMA），以最小化批次效应；（4）RNAscope检测 原位 杂交与组织学钙染色用于质量控制；以及（5）针对胫动脉钙化区域在GeoMx数字空间分析仪（DSP）平台上专门设计的兴趣区域（ROI）选择策略。这些步骤涵盖了在DSP仪器上进行样本采集之前的所有操作，包括文库构建、测序及数据分析。

尽管本方法在引用的DSP平台上进行了演示，但其原理可指导10X Visium或其他平台的组织制备，且该方法可轻松适用于其他血管床或动物模型。本方案可调整用于生物样本库和死后组织，但其成功与否在很大程度上取决于组织保存、固定和储存条件。组织应在采集后立即固定，以尽量缩短缺血时间（理想情况下在1小时内完成）。建议使用标准的10%中性缓冲福尔马林（NBF）在室温（RT）下固定至少16小时。组织固定后应尽快进行包埋，且在乙醇中储存不应超过3天。按照推荐条件处理和储存的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块在约3年内仍适用于空间分析，但RNA质量会随组织块存放时间延长而下降。因此，建议对细胞含量较低的样本、储存超过6个月的组织块、生物样本库标本以及死后组织进行RNA质量评估。可接受的最低RNA质量取决于所选检测方法、感兴趣区域（ROI）的选择、所需分辨率以及核心设施的建议。实际操作中，通常建议每个片段至少包含50–100个细胞核，以获得可靠的结果。DSP平台支持FFPE组织和新鲜冷冻组织。在本方案中，我们重点介绍FFPE组织的处理。

尽管本研究聚焦于空间转录组学，但其可轻松整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）。利用已发表的scRNA-seq数据集及计算空间去卷积方法，可估算每个空间位点的细胞类型比例，并将由scRNA-seq定义的细胞状态投射到组织结构上。通过保持组织结构和RNA完整性，本方案支持后续的单细胞或单分子验证，从而最大限度地从珍贵的血管样本中获取生物学信息，并推动空间转录组学在血管生物学研究中的广泛应用。

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方案

所有采集人体动脉标本的程序均经华盛顿大学人类受试者分部机构审查委员会（IRB）和退伍军人普吉特海峡医疗保健系统（华盛顿州西雅图）IRB 批准。在采集组织前，已从患者处获得书面知情同意书。本研究使用的所有材料和设备均列于材料表中。

1. 组织修剪与固定

  1. 组织修剪
    1. 使用多层包装准备运输袋，包括内管、次级容器、外层运输罐和生物危害标本袋。在内层50 mL离心管中加入30 mL储存用杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），其中含1%的4-[2-羟乙基]-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和1%青霉素-链霉素（P/S）。
    2. 将获取的胫前动脉（AT）、胫后动脉（PT）和腓动脉（PR）（理想长度>5 cm）分别置于50 mL离心管中。将运输罐置于冰上，从手术室转移至组织培养室。
      注意：建议获取的样本长度至少为5 cm，以便进行重复实验，并保留足够的组织用于冷冻储存，以备后续其他检测或验证使用。
    3. 将每条动脉转移至含培养基的100 mm培养皿中。使用无菌剪刀和镊子去除多余的血管周围结缔组织，仅保留动脉壁（从外膜向内）。
      注意：应在经RNase失活溶液擦拭过的生物安全柜中操作并修剪组织，以防止RNA污染。使用无菌手术刀和镊子；在不同样本之间，用无菌无核酸酶水冲洗器械以去除残留物，并用70%乙醇彻底擦拭。
    4. 在新的培养皿中用杜尔贝科磷酸盐缓冲液（PBS）短暂冲洗修剪后的动脉。在新培养皿内放置无菌切板，并将动脉移至其上。
    5. 用手术刀将动脉横向切成每段1 cm的节段。
  2. 组织固定与储存
    1. 将两个节段迅速放入冻存管中，在液氮（LN2）中速冻，用于后续蛋白质/RNA实验的冷冻保存。
    2. 将剩余节段放入含10%中性缓冲福尔马林（NBF）的15 mL管中，于4 °C固定24–48小时，适用于1 cm长的动脉节段。
      注意：推荐使用10% NBF。若使用4%多聚甲醛（PFA），应新鲜配制或在使用前确认其pH为中性，以尽量减少对RNA的损伤。

2. 脱钙、组织处理与切片

  1. 配制脱钙液：将乙二胺四乙酸（EDTA）固体溶解于RNA稳定溶液（RSS）中，配制成10%（w/v）溶液。无需过滤。先用氢氧化钠（NaOH）颗粒调节pH至9.2以充分溶解EDTA，然后用10 M盐酸（HCl）将pH降至5.2，此为RSS的典型工作pH值，有助于保持RNA完整性。
  2. 用 PBS 手动快速冲洗固定后的组织。将每个样本转移至含有脱钙液的 15 mL 管中，在 4 °C 下振荡处理。 °C，72 小时。
  3. 当脱钙完成后，用 PBS 清洗样本（2 × 5分钟）。将组织放入包埋盒中，然后使用4小时程序将其加载到组织处理机中。
  4. 每个组织包埋块中包埋多个动脉节段。在载玻片背面标记受限的组织区域，并确认所有切片均位于该区域内。
  5. 修整多余石蜡。将包埋块切片至5 µ使用切片机和低剖面刀片将组织切成 m 厚的切片，并将切片置于已标记的载玻片区域内。
    注意：修面后丢弃最初的几个切片，收集后续的组织切片。使用无RNase的毛刷，并在每批样本之间清洁水浴槽。
  6. 每个组织块至少制备四张连续切片，用于不同的染色以及数字空间分析（DSP）实验。将载玻片置于4℃保存。 °直至使用前（理想情况下 < 6个月。

3. RNAscope 原位 原位杂交（ISH）和组织学染色

  1. RNAscope 原位杂交（ISH）
    1. 将切片在 60 °C 的干烤箱中烘烤过夜，以增强组织与载玻片的黏附性。
    2. 脱蜡：将切片浸入二甲苯（3 次 × 5 分钟），随后浸入 100% 乙醇（2 次 × 3 分钟）。在 60 °C 下干燥 7 分钟。
    3. 根据制造商的说明书进行 RNAscope 2.5 HD Red ISH 检测。在室温下用 3% H2O2 封闭内源性过氧化物酶 10 分钟，然后用去离子水（DI 水）冲洗。
    4. 将切片在预热的 100 °C 修复缓冲液（按 1:10 用去离子水稀释）中孵育 15 分钟（使用蒸锅时，每架最多 24 张切片需使用 200 mL 修复缓冲液），在 100% 乙醇中浸洗 5 次，并在 60 °C 下干燥 7 分钟。使用疏水性屏障 PAP 笔在组织周围绘制疏水性屏障，以防止溶液扩散。
    5. 将切片放入杂交炉架中，每张切片加入 200 µL 消化酶补充液（厂商已预稀释于滴瓶中），在 40 °C 下孵育 15 分钟。用去离子水冲洗两次。
    6. 向切片上加阳性对照探针 Human Ppib，在 40 °C 下孵育 2 小时。用洗涤缓冲液洗涤 2 次。
    7. 进行顺序扩增：AMP1 在 40 °C 下孵育 30 分钟；AMP2 在 40 °C 下孵育 15 分钟；AMP3 在 40 °C 下孵育 30 分钟；AMP4 在 40 °C 下孵育 15 分钟；AMP5 在室温下孵育 30 分钟；AMP6 在室温下孵育 15 分钟。每次扩增之间用洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次 2 分钟。
    8. 加入 Fast Red 工作液，在室温下孵育 10 分钟。倾去液体，将切片浸入去离子水中，然后在新鲜去离子水中浸洗 5 次。确认 Ppib 阳性对照信号呈现为独立、点状的红色斑点。
    9. 用 Gill's 1 苏木精复染，于两份去离子水中各浸洗 5 次，用 0.02% 氨水返蓝，再于两份去离子水中各浸洗 5 次。确认细胞核呈蓝色，且组织形态保存良好。让切片过夜干燥，然后用封片介质加盖玻片。
  2. 茜素红 S 染色
    1. 对于额外的连续切片，重复步骤 3.1.2 中的脱蜡和复水过程。
    2. 确认茜素红 S 工作液的 pH 值为 4.1–4.3。
    3. 将切片浸入茜素红 S 溶液中 30–60 秒，或直至钙沉积物呈现橙红色。
    4. 抖去多余的染色液。用 100% 丙酮快速浸洗 20 次，然后在丙酮:二甲苯（1:1）溶液中浸洗 20 次。
    5. 在两份新鲜的二甲苯中各透明 3 分钟。用封片介质加盖玻片。

4. GeoMx DSP 芯片制备与感兴趣区域（ROI）选择

  1. 开始之前，使用RNase失活溶液清洁所有设备和容器，并用DEPC处理水干燥或冲洗，以防止RNA污染。遵循空间RNA分析实验的操作说明。
  2. 在60℃干烤箱中烘烤载玻片 °4°C 过夜以增强组织与载玻片的黏附性。
  3. 脱蜡与复水：将切片浸入二甲苯（3次） × 5 分钟），随后用 100% 乙醇（2 × 5 分钟）以及用 DEPC 处理水稀释的 95% 乙醇中处理 5 分钟。将切片转移至 1× PBS 洗涤 1 分钟。
  4. 将切片放入预热至100℃的孵育液中孵育 °C Tris/EDTA pH 9.0 抗原修复缓冲液中孵育 20 分钟，然后将切片转移至 1× 室温下用 PBS 洗涤 5 分钟。
  5. 在预热的 1.0 µg/ml 蛋白酶 K 处理 15 分钟，然后用 1 洗涤× 室温下用 PBS 洗涤 5 分钟。
  6. 用10% NBF固定载玻片（200 µ每张载玻片加入 L，室温孵育 5 分钟，随后用 PBS 洗涤 5 分钟。
  7. 从 PBS 中取出载玻片，轻拍滤纸以吸去多余液体，用无尘纸擦去组织周围的过量液体，然后放入杂交染色架中。
  8. 加入200 µL 杂交溶液（用 Buffer W 按 1:10 稀释）加入每张载玻片，盖上杂交盖片。关闭杂交室，放入烘箱中，在 37℃ 下孵育 °4°C 过夜。
  9. 将载玻片浸入盐水-柠檬酸钠缓冲液（SSC, 2×），并在5分钟内让杂交盖片自行滑落。
  10. 用严格洗涤缓冲液清洗载玻片，该缓冲液由等体积的 4× SSC 和去离子甲酰胺在 37 ℃ °C，每次洗涤25分钟。用2× SSC缓冲液，每次洗涤2分钟。
  11. 用缓冲液 W 在室温下封闭载玻片 30 分钟。
  12. 在室温下的湿盒中，用一抗溶液（Rabbit anti-CD45）覆盖组织，孵育1小时，随后用2× 3倍SSC缓冲液
  13. 加入二抗溶液（山羊抗兔IgG-AF647）孵育1小时，随后在2中洗涤× SSC缓冲液
  14. 在室温下，于加湿盒中用标记的抗体（Mouse anti-SMA-AF488）覆盖组织，孵育1 h。随后在2中洗涤× SSC缓冲液
  15. 将切片在 2 中染色 10 分钟 µM Syto83 核标记物用 Buffer W 稀释，孵育 10 分钟。
  16. 使用RNA分析仪器扫描切片，以观察形态学标记物的染色情况。针对每条动脉组织中钙化病变的近端和远端选择感兴趣区域（ROI），并对每个ROI的层特异性位置进行标注。
    注意：将杂交盖片应用于组织切片时，需谨慎操作以防止产生气泡。

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结果

本方案概述了从接收到胫动脉样本到制备组织微阵列切片的完整流程，所获切片可同时保留形态学特征和RNA完整性，适用于空间转录组学分析。此外，本文还详细介绍了用于显示动脉中钙盐沉积的组织学方法、形态学标志物染色技术，以及感兴趣区域（ROI）的选择策略。

在图1中，动脉组织用10% NBF固定（步骤2）。NBF可快速渗透组织，最大限度减少RNA降解，其磷酸盐缓冲液（pH 7.0）可中和固定过程中产生的甲酸，防止pH值降至6以下。在分析仪上选定感兴趣区域（ROI）后，本方案未展示后续步骤。简而言之，紫外（UV）激光精确照射每个ROI，释放带有条形码标记的寡核苷酸。这些寡核苷酸随后通过nCounter或下一代测序进行定量，获得具有空间分辨的基因表达计数数据（步骤6）。多个动脉切片被排列并包埋于同一蜡块中，以降低试剂成本，并为统计分析提供足够的重复样本。所有组织芯必须位于所示区域内，以确保GeoMx仪器能够捕获信号。（图2）。

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讨论

本方案详细说明了在NanoString GeoMx DSP平台上对钙化的人体胫动脉进行空间转录组学分析前所需的制备步骤。胫动脉与其他血管一样，具有同心排列的内膜、中膜和外膜三层结构，每层均含有不同的细胞群体，参与调控损伤与修复过程。为实现按层解析的转录组分析，保持这些结构层次的完整性至关重要；然而，若干常被忽视的前期处理步骤可能影响这一目标的实现。

获取动脉组织后，必须去除外膜周围的脂肪组织，同时保持外膜完整；这有助于保留连续的血管壁结构，为感兴趣区域（ROI）的定位提供空间框架。关键步骤之一是保持RNA的质量。我们使用10%中性缓冲福尔马林（NBF）固定组织，因为其中的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）可中和固定过程中产生的甲酸，从而限制酸催化引起的RNA水解。需要注意的是，其他甲醛固定剂（如4%多聚甲醛PFA）提供的甲醛浓度相当，但4% PFA的pH值在储存过程中更容易发生偏移，因此建议现配现用，并在使用前验证pH值。固定后的组织可长期保存于磷酸盐缓冲液（PBS）中，但根据一家医院组织库的研究，若在70%乙醇中长期储存，RNA的得率和完整性会显著下降

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本工作获得了美国退伍军人事务部普吉特湾医疗保健系统种子基金、退伍军人事务部杰出研究奖 I01 BX004975-02 以及美国退伍军人事务部普吉特湾医疗保健中心资源和设施使用的支持。  本文内容由作者完成，不一定代表退伍军人事务部或美国政府的立场或政策。  我们感谢华盛顿大学组织学与影像核心（HIC）提供的影像服务。  我们感谢华盛顿大学 Dr Shreeram Akilesh 在 DSP 实验方面的指导及其在 MANTIS Labs 团队的支持：  华盛顿大学空间生物学核心。  我们还感谢华盛顿大学糖尿病研究中心的 Nishi Ivanov 提供的组织学染色支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高糖含丙酮酸的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） Thermo Fisher Scientific11995065
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液，1 MThermo Fisher Scientific15630080
青霉素-链霉素（P/S），10,000 U/mLThermo Fisher Scientific15140122
10% 中性缓冲福尔马林（NBF）Millipore Sigma65346-M
乙二胺四乙酸（EDTA）Millipore Sigma3620
RNA later 稳定溶液Thermo Fisher ScientificAM7024RNA 稳定溶液（RSS）
过氧化氢（H2O2）Advanced Cell Diagnostics, Inc322335
靶标修复溶液Advanced Cell Diagnostics, Inc322001
蛋白酶 PlusAdvanced Cell Diagnostics, Inc322331消化酶补充剂
DapB（阴性对照）Advanced Cell Diagnostics, Inc310043
RNAscope 洗涤缓冲液（RNAscope 2.5 HD Red ISH 检测试剂盒）Advanced Cell Diagnostics, Inc320058
AMP1Advanced Cell Diagnostics, Inc324511
AMP2Advanced Cell Diagnostics, Inc324512
AMP3Advanced Cell Diagnostics, Inc324513
AMP4Advanced Cell Diagnostics, Inc324514
AMP5 红色Advanced Cell Diagnostics, Inc324515
AMP6 红色Advanced Cell Diagnostics, Inc324516
Fast Red AAdvanced Cell Diagnostics, Inc324517
人 PpibAdvanced Cell Diagnostics, Inc313901
Gill’s 苏木精Millipore SigmaGHS132
抗原修复，Tris/EDTA pH 9Thermo Fisher Scientific00-4956-58
蛋白酶 KThermo Fisher ScientificAM2546
杂交溶液-Hs WTANanostring121401102
Hybrislip杂交盖片
杂交溶液-缓冲液 RNanostring121300313
兔抗 CD45 Cell Signaling1317
缓冲液 WNanostring121300313
山羊抗兔 IgG-AF647Jackson Immunoresearch111-605-144
小鼠抗 SMA-AF488 Thermo Fisher Scientific53-9760
Syto83 Thermo Fisher ScientificS11364
手术刀片BD Biosciences371110
Superfrost  Plus 显微镜载玻片Thermo Fisher Scientific1255015
ImmEdge 笔
切片机刀片Thermo Fisher Scientific22-500-125
RNase AWAYRNase 失活溶液
仪器
HybEZ 杂交炉 Advanced Cell Diagnostics, Inc321710
GeoMx 数字空间分析仪Nanostring 型号：GeoMx DSP
数据访问平台：GeoMx DSP 控制中心（版本 3.1.2.12）		通道扫描设置：FITC 通道曝光时间为 300 ms，荧光染料为 AlexaFluor 488；Cy3 通道曝光时间为 50 ms，荧光染料为 Syto83；Cy5 通道曝光时间为 300 ms，荧光染料为 AlexaFluor 647。

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RNA RNAscope

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