以CYP2C19基因型指导的丁基苯二甲酸盐治疗急性脑梗死患者的预后分析

摘要

本文描述了一项评估CYP2C19基因型引导丁基苯二甲酸盐治疗急性脑梗死预后的研究，显示代谢能力差者结局更差，且Hcy、NIHSS和CYP2C19为独立预测因子。

摘要

基于细胞色素P450 2C19（CYP2C19）基因型，研究使用丁基苯二甲酸酯治疗急性期脑梗死患者的预后。回顾性纳入了2022年1月至2025年1月期间，我们医院接受丁基苯二甲酸酯治疗的175名急性脑梗死患者。根据治疗后3个月的修正Rankin量表（mRS）评分，患者被分为良好预后组（mRS ≤2）和不良预后组（mRS ≥3）。分析了CYP2C19基因型和代谢表型。比较了临床数据和基因型分布，并进行了逻辑回归分析以识别预后因素。中间代谢者占主导（46.29%），代谢差者最少（12.00%）。与良好预后组相比，预后较差组的高血压患病率显著更高（P <0.05）、血清同型半氨酸（Hcy）升高（P <0.05）以及较高的基础美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）得分（P <0.05）。代谢差者（CYP2C19*2/*2， *2/*3， *3/*3）在预后不良组中比例过高，而快速代谢者（CYP2C19*1/*1）在良好预后组中更为常见（P <0.05）。逻辑回归分析发现，控制协变量后有三个独立预测因子预测预后不良：同型半胱氨酸水平升高（比值比（OR）=2.255;95%置信区间：1.404–3.622;P < 0.001），更高基线NIHSS评分（OR = 3.127;95% CI：1.508–6.482;P = 0.002），以及CYP2C19代谢能力差（OR = 4.559;95% CI：2.392–8.688;P < 0.001）。Hcy水平升高、NIHSS评分升高以及代谢表现CYP2C19不良，是丁基苯二甲苯治疗急性脑梗死的重要预后因素。代谢者基因型较差的患者结局更差，凸显了个性化治疗策略以优化治疗效果的必要性。

引言

急性脑梗死占所有中风病例的80%以上，是全球健康中极其重要的负担，特点是高死亡率、残疾和复发率高。作为全球第二大死因，它通过长期神经损伤和功能依赖对社会经济造成严重^影响1。治疗干预的紧迫性体现在“时间即大脑”概念中——在未治疗的缺血2期中，每分钟约有190万神经元^死亡。

在这一临床领域，丁基苯二甲酸盐（dl-3-n-丁基苯二甲酸盐）已成为中国的一线神经保护剂，展现出多模式疗效，能改善大脑微循环、减轻氧化应激和缓解神经元凋^亡。然而，治疗反应在个体间存在显著差异，12%–18%的患者临床益处或不良事件有限，包括肝毒性和神经系统恶^化4。这种异质性凸显了个性化治疗方法的迫切需求。药物基因组学的进展阐明了细胞色素P450酶，尤其是CYP2C19酶，是药物代谢和疗效的关键决定^因素5。CYP2C19多态性显著影响神经活性药物的药代动力学，且对氯吡格雷在中风预防中的反应性有明确影响。超过40%的亚洲人群携带功能丧失等位基因（*2， *3），这些等位基因导致代谢表型不良，导致药物暴露和临床预后发生变化。值得注意的是，尽管CYP2C19基因分型彻底改变了抗血小板治疗⁶，但它在指导神经保护方案中的作用仍未被充分探讨。丁基苯二甲酸酯经历复杂的肝脏代谢，涉及CYP450亚型，但CYP2C19变异对其治疗疗效的预后影响尚不清楚。与需要CYP2C19介导激活的前药氯吡格雷不同，丁基苯二甲酸盐的代谢途径及CYP2C19在其特性和有效性中具体作用尚待充分表征。这一区别凸显了我们研究的新颖之处：超越了抗血小板药物基因组学的既定范式，进入新兴的神经保护剂个性化治疗领域。这一知识空白阻碍了精准医疗在急性中风护理中的实施。因此，本研究探讨CYP2C19遗传多态性与接受丁基苯二甲酸盐治疗的急性脑梗死患者3个月功能结局之间的关联。通过整合基因型数据与既有预后标志物，我们旨在建立药物基因组学框架，优化该人群的神经保护治疗，从而将中风药物基因组学的应用扩展到抗血小板药物之外。

本研究是最早探讨CYP2C19药物基因组学对丁基苯二甲酸盐单药治疗结果影响的研究之一。研究结果显示，代谢表型不良与功能恢复较差之间存在显著关联，为个性化神经保护策略提供了依据。

方案

该研究依据赫尔辛基宣言进行，并经惠州中央人民医院机构伦理委员会批准（批准号2022-015）。由于该研究具有回顾性设计，未被注册为临床试验。由于分析具有回顾性质，放弃了知情同意，所有患者数据均进行了去标识化处理。摄政员和所用设备列于 材料表中。

1. 研究设计与患者选择

作为一项回顾性多中心研究，我们承认存在选择偏差的潜在风险。为缓解这一问题，患者识别遵循了每个参与中心潜在卒中登记处的连续入组方案。研究期间（2022年1月至2025年1月）所有急性脑梗死患者均接受筛查以确定资格，符合纳入标准的患者按顺序注册。数据汇集自三家机构：邵新上瑜人民医院、邵伦邵医院和惠州中央人民医院。所有参与中心之间建立了数据共享协议，以确保适当的监督和数据访问。

为处理缺失数据，采用了多重补补方法，使用链式方程对缺失率<5%的变量进行处理。对于缺失数据>5%的变量，采用了完整案例分析，并透明地报告缺失模式。关键变量，包括CYP2C19基因型、基线NIHSS和3个月mRS，均为所有参与者提供完整数据。通过统计模型中的多变量调整，包括已知预后因素如年龄、基线中风严重度、血管风险因素及联合用药，解决了潜在混杂因素。具体收集了联合用药（抗血小板药、他汀类药物、降压药）的数据，并在分析中进行了调整。

1. 纳入标准
   纳入标准如下：（1）根据《中国急性缺血性卒中诊断治疗指南》通过影像和临床标准确诊急性脑梗死;（2）首次中风，发病至入院时间<72小时;（3） 空腹服用丁基苯二甲酸盐（每胶囊0.1克），每日三次，每次0.2克，入院后24小时内开始治疗;（4）无既往溶栓或抗凝治疗。
2. 排除标准
   排除标准如下：（1）共病精神疾病或认知障碍;（2）严重的肝脏、肾脏或心脏功能障碍;（3）对研究药物的过敏反应;（4）全身性炎症性或自身免疫性疾病。患者根据三个月修正后的Rankin量表评分，分为预后良好（mRS ≤2）和预后较差（mRS ≥3）^组7。患者纳入过程如 图1所示。
   通过住院期间直接观察用药情况、药片计数和随访时的用药日记复查、每两周进行结构化电话访谈以评估依从性和不良反应，以及门诊患者药房续药记录的审查，监测患者对丁基苯二甲胺治疗的依从性。检测中排除了依从性<80%的患者（n=7）。3个月随访终点基于既定的卒中结局研究标准选定，因为mRS在中风后90天被广泛接受为关键恢复期的主要终点。

2. 临床数据收集

数据通过电子病例报告表格系统收集，涵盖五个领域：人口统计特征（年龄、性别、身体质量指数， 见表1）、血管风险因素（高血压、糖尿病、吸烟史、饮酒史）、临床表现（梗死部位、基线NIHSS评分）、实验室参数及治疗细节。血液生物标志物的测量方法如下：

1. 脂质谱（TC、TG、LDL-C、HDL-C）
   使用自动生化分析仪分析，测定范围为TC为0–20 mmol/L，TG为0–10 mmol/L，LDL-C为0–15 mmol/L，HDL-C为0.5–2.0 mmol/L。
2. 血清同型半胱氨酸（Hcy）
   通过ELISA测量（检测范围5–50 μmol/L，变异系数<5%）。样本采集后2小时内保存在-80°C下，以避免降解。

3. CYP2C19基因分型

1. 样本采集与DNA提取
   上午从肘正中静脉采集空腹静脉血（5毫升）。在室温凝血30分钟后，样品在1600× 克 、4°C下用高速离心机分离血清，持续10分钟。按照制造商的方案，从300微升血清中提取基因组DNA。样本在56°C的300微升裂解缓冲液中短暂孵育10分钟，随后加入100微升绝对乙醇。混合物被转移到纯化塔中，在室温下以12,000× 克 离心1分钟。DNA在两次洗涤后用50微升预热（70°C）洗脱缓冲液洗脱，每次500微升洗涤缓冲液，每次清洗后以12,000× 克 离心1分钟。最终DNA浓度通过分光光度计调整至50–100 ng/μL，并储存在-20°C。
2. 实时PCR基因分型
   CYP2C19基因分型 通过 实时PCR进行。20微升反应混合物由10微升2×TaqMan主混合液、1微升引子探针混合物、2微升DNA模板和7微升无核酸酶水组成。热循环条件设定如下：初始变性在95°C下持续30秒，随后在95°C下进行40次变性循环5秒，最后在60°C下进行联合退火/拉伸34秒。在退火/延伸步骤中收集了荧光数据。
3. 基因型确认与质量控制
   基因型呼叫通过第二代Hi-SNP测序确认，覆盖范围为100×。对于结果不一致（n=3），采用限制性片段长度多态性分析作为备选方法：20 μL PCR产物与1 μL HpyCH4V限制性内切酶及4 μL对应缓冲液在37°C下孵育1小时，随后 通过 2%琼脂糖凝胶电泳在100 V下分离45分钟。
   实施了严格的质量控制措施。所有样本均进行了双重处理，采用盲法重复检测;每次PCR运行中都包含了内部控制组（已知基因型）;实时PCR与Hi-SNP测序结果的一致性为100%;随机抽取的样本（10%）送往独立实验室进行验证，结果达到100%一致性;呼叫率超过99.5%，最低基因型质量评分为Q30。
4. 代谢表型分类
   代谢表型基于基因型分类CYP2C19如下：代谢差者（*2/*2，*2/*3，*3/*3）;中间代谢者（*3/*17， *2/*17， *1/*2， *1/*3）;快速代谢者（*1/*1）。采用这一三层分类体系是为了与区域临床实验室实践保持一致。*17等位基因的频率及IM组基因型分布详见结果部分。

4. 统计分析

统计分析使用SPSS 25.0版本进行。类别数据表示为[n （%）]， 并通过 χ² 检验进行比较（对小样本进行了耶茨校正）。连续变量使用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验;正态分布数据以均值±标准差呈现，并采用独立t检验分析，非正态数据则采用Mann-Whitney U检验分析。
多重共线性通过容忍（≥0.1）和方差膨胀因子（VIF <10）进行评估。采用逻辑回归分析（使用SPSS中的二元逻辑菜单路径→→回归分析）识别独立的预后因素，进入和退出标准分别设定在P <0.05和P >0.10。模型中输入的变量包括Hcy水平（连续）、基线NIHSS评分（连续）、高血压（类别）和CYP2C19代谢表型（类别，以快速代谢者为参考）。进行了Hosmer-Lemeshow拟合优度检验以评估模型校准。双尾P <0.05被认为具有统计学显著性。
效应量计算方式如下：连续变量的Cohen d使用分析<比较均值独立样本T检验函数计算，并启用额外效应量计算;对于类别变量，phi系数来自统计选项中选择的“分析描述性统计交叉表”下的χ²检验输出，Phi和Cramer的V。

结果

CYP2C19基因型和代谢表型的分布

对175名急性脑梗死患者的CYP2C19基因型和代谢表型分析显示，中间代谢者最为普遍（81/175,46.29%），而代谢不良者最少见（21/175,12.00%）。基因型分布显示，CYP2C19 * 1/*1（快速代谢者）是最常见的基因型（73/175,41.71%），其次是*1/*2（中间代谢者，72/175,41.14%）。*2/*2基因型占代谢差者的8.57%（15/175）（见表2）。这些发现支持了CYP2C19遗传变异在该人群中常见的假设，显著比例的患者代谢能力下降，这可能影响丁基苯二甲酸盐治疗的效果。

按预后组比较临床特征

对预后良好组（mRS ≤ 2组）与预后较差组（mRS ≥ 3组）进行比较分析显示，年龄、性别、梗塞大小、BMI、饮酒史、吸烟史或血脂...

讨论

急性脑梗死是一种由脑血管功能不全引起的综合征，代表了一种关键的神经系统紧急情况 ^8,9,10。丁基苯二甲酸盐已成为该病症的主要治疗药物。研究表明，其治疗机制包括抑制细胞内自由基生成、增强抗氧化酶活性以及保持线粒体完整性，共同改善缺血-缺氧条件下神经组织的能量代谢¹¹。尽管其在缓解神经功能缺陷方面有效，临床观察仍发现其不良反应，包括血清转氨酶水平升高、腹部不适，以及极少数情况下神经功能障碍加重，可能对患者预后产生负面影响¹²。因此，精确的预后评估对于指导临床医生及时实施干预措施、降低死亡率、致残和改善长期结局至关重要。

本研究确定血清同型半胱氨酸（Hcy）水平及美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）基线评分为急性脑梗死的显著预后决定因素...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2×TaqMan 母混音	赛莫飞世尔科学	4371355	用于CYP2C19基因分型实时PCR反应
琼脂糖	无	无	用于制备琼脂糖凝胶电泳所需的2%凝胶
丁基苯二甲胺胶囊	NBP制药有限公司	H20050299	每粒胶囊含0.1克;空腹每日三次，每次0.2克
DNA提取套件	天源生物技术	DP304	用于从血清样本中提取基因组DNA;包括裂解缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液
电子病例报告表格（e-CRF）	无	无	系统化的临床数据收集工具，涵盖五个临床数据领域
同型半胱氨酸（Hcy）ELISA套件	上海酶联生物技术	无	探测距离5–50 & mu;mol/L;变异系数 <5%;用于血清Hcy测量
洗脱缓冲液	天源生物技术	无	预热至70度;C;DP304 DNA提取套件的组成部分，用于DNA洗脱
埃彭多夫5425R冷藏高速离心机	埃彭多夫	5425R	用于血清分离和基因组DNA纯化离心步骤及nbsp;
Hi-SNP测序平台/分析系统	华大基因组学	无	第二代测序;用于CYP2C19基因型确认，100×报道范围
HpyCH4V限制酶	新英格兰生物实验室	无	用于不一致基因分型结果的限制性片段长度多态性分析
裂解缓冲液	天源生物技术	无	DP304 DNA提取套件的组件;与样品在56度浓度孵育;C10分钟
纳米滴光度计	赛莫飞世尔科学	无	用于将最终基因组DNA浓度调整至50-100 ng/μL
无核酸酶水	无	无	用于制备CYP2C19基因分型实时PCR反应混合物
引子-探针混合物（CYP2C19*2）	赛莫飞世尔科学	C__25986767_30	专门用于实时PCR中的CYP2C19*2基因分型
引子-探针混合比（CYP2C19*3）	赛莫飞世尔科学	C__27861809_10	专门用于实时PCR中的CYP2C19*3基因分型
罗氏LightCycler 480 II系统	罗氏诊断	LightCycler 480 II	用于CYP2C19基因分型的实时PCR系统
罗氏/日立7600分析仪	罗氏诊断/日立	7600	用于脂质谱（TC、TG、LDL-C、HDL-C）测量;研究中指定的脂质检测范围
SPSS	IBM公司	25	统计分析软件;用于所有研究数据分析（和 Chi;²检验、T检验、逻辑回归等）
洗涤缓冲	天源生物技术	无	DP304 DNA提取套件的组件;两个500和mu的洗涤台阶;在DNA纯化中，L各是