本研究旨在探讨电针刺激对脊髓损伤大鼠模型髓鞘再生的影响，并验证神经调节蛋白1（NRG1）-ErbB4信号通路是否参与该过程。
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研究文章
* These authors contributed equally
本研究旨在探讨电针刺激对脊髓损伤大鼠模型髓鞘再生的影响，并验证神经调节蛋白1（NRG1）-ErbB4信号通路是否参与该过程。
脊髓损伤（SCI）常导致严重的神经功能障碍，而髓鞘修复是神经功能恢复的关键步骤。电针（EA）是一种将传统针灸与电刺激相结合的治疗方法，已广泛应用于神经修复领域。然而，电针作用所涉及的具体信号通路尚未完全阐明。本研究旨在探讨电针对SCI大鼠髓鞘再生的影响，并验证Neuregulin1（NRG1）-ErbB4信号通路是否参与该过程。通过在T10脊髓节段使用动脉瘤夹损伤法建立SCI大鼠模型。在L5-6椎间隙的椎管内植入一根聚乙烯（PE）导管，并皮下固定，以建立长期药物递送系统。每隔一天通过PE导管给予外源性NRG1及其拮抗剂，每次注射体积为20 µL。电针治疗每隔一天进行一次，刺激大椎（GV14）和命门（GV4）穴位，每次持续30分钟，连续治疗4周。结果显示，电针治疗显著促进了脊髓组织中髓鞘碱性蛋白（MBP）的表达，并改善了大鼠后肢的运动功能。此外，外源性NRG1产生的效应与电针类似。综上所述，NRG1-ErbB4信号通路在电针诱导的SCI大鼠髓鞘再生过程中发挥重要作用。
脊髓损伤（SCI）是一种创伤性疾病，可导致严重的神经功能缺损，通常表现为运动障碍、感觉丧失和自主神经功能障碍，全球每年的发病率为每百万人中约40-80例1,2。损伤后，轴突断裂和髓鞘丢失是阻碍神经信号传导的主要病理特征3。髓鞘由中枢神经系统（CNS）中的少突胶质细胞和周围神经系统（PNS）中的施万细胞形成，其完整性对神经冲动的快速传导至关重要4。然而，SCI后局部微环境中的炎症反应、氧化应激以及胶质瘢痕的形成显著抑制了髓鞘再生，导致慢性神经功能障碍5。同时，SCI后少突胶质细胞（OLs）的死亡会导致轴突脱髓鞘，这一过程呈慢性且持续发展。研究表明，在人类和动物模型中，轴突脱髓鞘可通过髓鞘再生得到有效修复6。因此，探索促进髓鞘修复的策略是SCI治疗的关键方向之一。
针灸作为一种古老的中国传统医疗技术，已在包括中国、韩国和日本在内的多个国家的临床实践中广泛应用7,8电针（EA）结合了传统针灸与电刺激，已在临床实践中广泛应用。越来越多的证据表明，EA对多种疾病具有治疗作用，尤其在促进脊髓损伤后的髓鞘再生方面效果显著。在EA治疗过程中，穴位的选择至关重要，例如督脉14穴（GV14）和督脉4穴（GV4）。9. GV14 位于第7棘突下方th 颈椎，靠近脊柱中线，而GV4位于第2棘突间隙之间nd 和 3rd 腰椎椎骨。先前的研究表明，炎症信号通路、氧化应激、神经营养因子和自噬在电针诱导的髓鞘修复中发挥作用。10,11,12此外，越来越多的证据表明，在电针治疗过程中，特定的穴位（如督脉14穴和督脉4穴）在促进髓鞘再生方面发挥着积极作用。13,14,15然而，电针（EA）调控脊髓损伤后髓鞘再生的分子机制尚未完全阐明。
NRG1 是表皮生长因子家族的一员，根据其氨基末端区域，可分为六种类型（I-VI）16。NRG1 及其受体家族 ErbB（ErbB1/2/3/4）在神经系统的发育与修复过程中发挥重要作用，包括神经元迁移、分化、再髓鞘化以及突触形成等过程。在周围神经系统（PNS）发育过程中，施万细胞（SCs）沿着神经元轴突增殖并迁移以形成髓鞘，其中 NRG1-ErbB4 信号通路在 PNS 施万前体细胞的成熟过程中起关键作用17,18。既往研究表明，NRG1 信号通路参与神经干细胞向施万细胞的分化，并促进脊髓损伤（SCI）后神经细胞的髓鞘修复19。此外，有研究显示，在脊髓损伤后，NRG1-ErbB4 信号通路可促进少突胶质前体细胞（OPCs）转化为具有再髓鞘化潜能的类施万细胞20。Alex 等人构建了人诱导多能干细胞来源的感觉神经元与大鼠施万细胞的共培养体系，发现使用药物阻断 NRG1-ErbB 信号通路会显著抑制神经元的髓鞘化，为该通路在促进人类感觉轴突髓鞘化中的作用提供了直接证据21。另一项研究也表明，电针（EA）治疗可上调脊髓中 NRG1 的表达，并缓解炎症性疼痛22。
关于电针（EA）对脊髓损伤（SCI）中NRG1-ErbB4信号通路影响的研究较为有限，其潜在机制尚不明确。本研究旨在探讨在GV14和GV4穴位进行电针刺激是否能够调节NRG1-ErbB4信号转导，并进一步探索其在促进SCI大鼠髓鞘再生及神经功能恢复中的潜在作用。这是首次研究NRG1-ErbB4信号通路与电针诱导的SCI大鼠髓鞘再生之间关系的实验，为开发新型且有效的脊髓损伤治疗策略提供了实验依据。
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实验过程中严格遵守伦理准则，以尽量减少动物痛苦。实验方案与设计经昆明医科大学动物实验伦理委员会批准（批准号：KMMU2021051），并依照该校动物研究指南进行。成年雄性Sprague-Dawley大鼠（8周龄，体重250–270 g，n = 60）购自昆明医科大学（中国云南）。
动物准备
动物饲养在湿度恒定、温度适中的环境中，并维持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。动物被随机分配至11个组：假手术组（S，n = 6）、脊髓损伤组（M，n = 6）、脊髓损伤联合电针治疗组（M + EA，n = 6）、脊髓损伤联合NRG-1β治疗组（M + NRG-1β，n = 6）、脊髓损伤联合5% DMSO溶剂组（M + D，n = 6）、脊髓损伤联合PD158780抑制剂与NRG-1β治疗组（M + PD+NRG-1β，n = 6）、脊髓损伤联合PD158780抑制剂与电针治疗组（M + EA + PD，n = 6）、脊髓损伤联合溶剂与电针治疗组（M + EA + D，n = 6）、脊髓损伤联合shRNA与电针治疗组（M + EA + shRNA，n = 6）、脊髓损伤联合含非靶向shRNA的慢病毒与电针治疗组（M + EA + NC，n = 6）、脊髓损伤联合shRNA治疗组（M + shRNA，n = 6）。本研究的样本量是基于我们以往使用类似模型和干预措施的经验确定的，此类实验在此样本量下始终显示出显著效应。此外，尽管样本量有限，我们在关键结局指标中仍观察到具有统计学显著性和稳健性的差异，这增强了对所报告结果的信心。
SCI 大鼠模型
采用 Yasargil 动脉瘤夹（钛合金材质，标准闭合力为 70 g）通过夹闭法建立大鼠脊髓损伤（SCI）模型（图 1A）。大鼠以 2% 戊巴比妥钠（30 mg/kg，腹腔注射）麻醉后置于手术台上。于背部皮肤做 3–4 cm 切口，逐层分离皮下组织和肌肉，暴露 T9–11 胸椎棘突及椎板。使用血管夹去除 T10 胸椎棘突和椎板，充分暴露脊髓。将 Yasargil 动脉瘤夹垂直置于整个 T10 节段，在夹闭 60 秒后迅速松开。若出现以下两项或以上表现，则视为造模成功：（1）全身痉挛性震颤，（2）尾巴摆动反射，（3）脊髓表面可见黑色夹痕。确认止血充分后，对切口进行消毒并缝合。假手术组大鼠接受相同手术操作，但不夹闭脊髓。术后，大鼠每日两次（早晚各一次）腹腔注射生理盐水（3 mL）以补充水分，并连续 3 天每日两次腹腔注射青霉素（10 万单位）以预防感染。在自主排尿功能恢复前，每日两次人工辅助排尿。
大鼠鞘内导管植入与药物递送
根据 Storkson 等人23的方法，在诱导 SCI 模型前 1 周，将导管植入大鼠的蛛网膜下腔。麻醉后，将大鼠固定于手术台上，暴露 L5-6 椎间隙。使用 19G 针头垂直穿刺硬脑膜和蛛网膜，推进约 1–2 mm，突破蛛网膜后可感到空虚感，并有清晰的脑脊液流出，提示穿刺成功。沿穿刺针将一根 PE-10 导管（聚乙烯，内径 0.38 mm，外径 1.09 mm）插入蛛网膜下腔，推进至约 3 cm 深度，使导管尖端位于 L3 椎体附近。插入过程中，观察到大鼠出现尾部抽动和后肢抽搐，且脑脊液从导管流出，证实导管已正确置于蛛网膜下腔。
NRG-1β 和 PD158780 均用二甲基亚砜（DMSO）溶解，随后用人工脑脊液（ACSF）稀释，确保最终 DMSO 浓度低于 0.5%。NRG-1β 的最终工作浓度为 20 nM，PD158780 为 20 µM24。脊髓损伤后第 2 天，M + NRG-1β 组大鼠每隔一天接受一次 20 µL NRG-1β 的鞘内注射。M + EA + PD 组大鼠在电针治疗前 2 小时，接受 20 µL PD158780 的鞘内注射25。
电针治疗
第3天rd 术后第1天，将大鼠固定于治疗台上，进行电针（EA）治疗，针刺穴位为GV14和GV4图1B）。将两根针灸针（0.25 mm × 13 mm）插入上述穴位，进针深度为3–4 mm。采用电针仪进行电针治疗，使用疏密波模式（疏波频率为2 Hz，密波频率为10 Hz，频率比为1:5）。26输出强度设置为5（约0.5 mA），每隔一天处理一次，每次持续30分钟。
行为学评估
使用Basso、Beattie和Bresnahan（BBB）评分量表27评估运动功能，该量表在术后0、3、7、14、21和28天时间点评估肢体运动、步态、协调性及足底放置情况（图2D）。BBB评分范围为0（代表完全瘫痪）至21（表示正常步态）。所有评估均由两名研究人员独立完成，且其对实验分组情况设盲。
样品采集
实验结束后，将麻醉的大鼠固定在解剖平台上以采集组织。打开腹腔充分暴露膈肌，并使用虹膜剪小心切开，避免损伤血管。随后沿两侧肋缘剪开胸廓以暴露心脏，将针头插入心尖处的左心室，快速灌注约300–400 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS），以清除全身血液，直至右心房流出澄清液体。对于分子蛋白分析，此时停止灌注，并解剖脊柱。去除邻近的肋骨和肌肉以暴露椎体，定位T10节段，使用虹膜剪采集T10上下各约1 cm的脊髓节段，立即在液氮中速冻，随后于-80 °C保存。对于形态学检查，在PBS灌注后改用4%多聚甲醛进行灌注，固定成功的标志为肌肉收缩及躯干僵硬。随后小心解剖相同脊髓节段以保持组织结构完整，并在4 °C条件下用4%多聚甲醛后固定48小时。
苏木精-伊红染色
将脊髓石蜡切片置于60 °C烘箱中预热30分钟。脱蜡：二甲苯I中处理15分钟，随后在二甲苯II中处理15分钟。水化：依次用100%乙醇处理2分钟、95%乙醇处理2分钟、80%乙醇处理2分钟、70%乙醇处理2分钟，最后用蒸馏水处理5分钟。苏木精染色7分钟，随后用蒸馏水冲洗以去除残留染液。在1%盐酸酒精中分化3秒，再用蒸馏水冲洗以去除残留染液。用5%氨水返蓝2分钟，随后洗去残留返蓝液。伊红染色30秒，随后用蒸馏水冲洗以去除残留染液。脱水：依次用70%乙醇处理10秒、80%乙醇处理10秒，最后用100%乙醇处理30秒。透明：用二甲苯处理5分钟。封片后自然晾干，待干燥后采集图像。
劳氏快蓝染色
切片用二甲苯脱蜡2次，每次10分钟，然后用LFB髓鞘染色液染色，并在37 °C下孵育过夜。次日，用90%乙醇去除多余的染色液。切片在Luxol分化液（C0631S）中分化10秒，随后浸入75%乙醇30秒，直至灰质清晰可见。最后，切片用伊红染色液复染1分钟。
蛋白质印迹
将蛋白质样品在沸水中煮沸5分钟。首先在电泳凝胶中加入5 µL蛋白质标记物，随后依次加入待测蛋白质样品。以80 V电压开始电泳，直至标记条带清晰分离，然后将电压升至130 V并维持至电泳完成。将预裁的PVDF膜在甲醇中活化1分钟，取出后置于滤纸上，并与制备好的凝胶叠放。以300 mA恒定电流进行蛋白转膜，转膜时间根据蛋白分子量调整（±10分钟）。转膜完成后，将PVDF膜放入孵育盒中，用TBST缓冲液冲洗5分钟，然后在摇床上于室温下用5%脱脂牛奶封闭2小时。封闭后，用TBST缓冲液洗涤3次，每次5分钟，随后加入一抗进行孵育，包括GAPDH（1:2000）、Tubulin（1:2000）、NRG1（1:1000）、ErbB4（1:1000）和MBP（1:1000），在4 °C轻轻振荡孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤3次，每次5分钟，然后在摇床上于室温下加入二抗——山羊抗兔IgG（1:4000），孵育2小时。用TBST缓冲液洗涤后，通过化学发光法显影蛋白条带。将Western blot图像导入ImageJ软件，使用50像素的滚动球半径进行背景扣除。对于倾斜的条带，使用“分段线”工具将其拉直。使用“矩形”工具选择目标条带，并通过选择Plot Lanes生成密度分布图，以显示条带的灰度值。使用“魔棒”工具分割峰形并提取灰度值。保存数据后，使用GraphPad Prism软件绘制柱状图。
免疫荧光
石蜡切片用二甲苯脱蜡两次，每次10分钟，然后通过梯度乙醇溶液进行复水。抗原修复采用在5%柠檬酸溶液中煮沸切片15分钟的方法，随后用10%山羊血清封闭2小时。切片再与以下一抗在4 °C孵育过夜：小鼠单克隆NRG-1（1:200）、兔单克隆ErbB4（1:300）和人单克隆MBP（1:300）。用含0.1% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤三次，每次10分钟，然后在避光条件下加入以下二抗室温孵育1小时：FITC标记的山羊抗小鼠IgG（1:500）、FITC标记的山羊抗兔IgG（1:500）和FITC标记的山羊抗人IgG（1:500）。切片再用PBST洗涤三次，每次10分钟，然后用抗荧光淬灭封片剂固定并封片以保存荧光信号。载玻片置于4 °C避光保存。在荧光显微镜下先用10倍物镜定位目标细胞，再切换至40倍物镜采集荧光图像。
实时聚合酶链式反应（RT-PCR）
使用 NCBI 网站设计 ErbB4 和内参基因 GAPDH 的引物。引物序列如下：ErbB4 正向引物：ACAGCCCTCCTCCTGCCTAC；ErbB4 反向引物：ATCTCAGCCGTTGCACCCT；GAPDH 正向引物：CCCAGCTTAGGTTCATCATCAGGT；GAPDH 反向引物：TACGCCAAATCCGTTCACA。取约黄豆大小的脊髓组织，置于 1.5 mL 离心管中，加入 600 µL 总 RNA 提取试剂。充分匀浆后，冰上孵育 5 分钟，随后在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 5 分钟。将上清液转移至新的 1.5 mL 管中，加入 400 µL 氯仿，充分混匀后，在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 5 分钟。再次将上清液转移至新管，加入 400 µL 异丙醇，室温孵育 10 分钟，随后以 12,000 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，用 400 µL 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀。在 4 °C 条件下以 7,500 × g 离心 5 分钟后，弃去上清液，将离心管倒置于洁净表面晾干。将 RNA 沉淀溶解于 60 µL 无 RNA 酶的水中，充分混匀后测定 RNA 浓度。通过测定 260 nm 和 280 nm 处的吸光度记录 RNA 纯度和浓度，确保 260/280 比值约为 2.0。进行 cDNA 合成时，将反应 1（含基因组 DNA 去除酶等）与反应 2（含逆转录酶等）充分混合，在 95 °C 孵育 15 分钟。根据 cDNA 合成试剂盒说明书配制荧光 PCR 反应体系。取 2 µL 样品加入 23 µL PCR 反应混合液中，按照荧光定量 PCR 试剂盒的操作程序进行扩增。退火温度设定为 60 °C，扩增条件如下：预变性：95 °C 30 秒，1 个循环；PCR 反应：95 °C 3 秒，60 °C 30 秒，共 40 个循环；溶解曲线分析步骤如下：95 °C 5 秒，60 °C 30 秒，随后温度从 60 °C 逐步升至 95 °C，同时连续采集荧光信号。Ct 值由 Bio-Rad 计算机软件测定并计算，相对 mRNA 水平采用 2-ΔΔCt 法确定。
安全与操作指南
多聚甲醛固定：务必在通风良好的通风橱中使用多聚甲醛。始终佩戴适当的个人防护装备（PPE），包括口罩、手套、实验服和护目镜。将多聚甲醛溶液储存在密封严密的容器中，远离直射阳光和热源。按照昆明医科大学的实验室安全指南，将废弃的多聚甲醛放入危险废物容器中进行处理。
DMSO 溶液：DMSO 可通过皮肤吸收并进入体内。操作时应穿戴适当的个人防护装备，包括手套和护目镜。将 DMSO 储存在密封容器中，于室温下避离强氧化剂保存。废弃的 DMSO 应按照昆明医科大学实验室安全指南，置于危险废物容器中进行处置。
戊巴比妥麻醉：戊巴比妥属于管制药品，仅可由经授权的人员操作。操作过程中应避免意外暴露，使用时需确保环境通风良好，并穿戴适当的防护装备。戊巴比妥应存放于室温下上锁的柜子中，并由经授权的人员负责监管。戊巴比妥废弃物的处置必须遵守昆明医科大学关于管制药品的管理指南，确保具备合法使用许可，并严格执行废弃物处理程序。
一般废弃物处理：所有危险化学品和试剂必须根据昆明医科大学的实验室管理指南进行处置。确保所有废弃物均被正确标记，并放置于合适的容器中，以确保安全处理。
统计分析
所有实验均至少重复三次。目标蛋白条带密度值经对照组标准化后，用于组间比较。数据以中位数（四分位间距）或均值±标准差表示，其中n代表大鼠数量。对于正态分布的数据，采用单因素方差分析（ANOVA）评估组间差异的显著性；对于非正态分布的数据，则采用Kruskal-Wallis H检验进行组间比较。统计学显著性水平设定为p < 0.05。
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H&E染色和BBB评分显示电针治疗对脊髓损伤大鼠的保护作用
采用苏木精-伊红（H&E）染色法观察脊髓后角细胞的形态与结构（图2D）。H&E染色结果显示，在S组中，后角细胞排列整齐，细胞轮廓清晰，细胞核位于中央。相比之下，M组后角细胞数量减少，细胞排列紊乱，并出现空泡形成、胶质细胞增生及脊髓空洞。与M组相比，M + EA组和M + EA + D组的后角形态损伤和空洞化显著减轻。然而，在M + EA + PD组中，与M + EA组相比，损伤后后角空洞未见明显改善，其形态学损伤程度与M组相似。
脊髓损伤（SCI）后大鼠尿潴留的恢复情况根据自主排尿时间进行评估。SCI 后大鼠出现严重的尿潴留。M 组大鼠平均在 20 天后恢复自主排尿。相比之下，M + EA 组大鼠平均在 13 天后恢复自主排尿，差异具有统计学意义（p < 0.05）。M + EA + PD 组大鼠平均在 25 天后恢复自主排尿，...
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本研究表明，电针治疗可减轻脊髓损伤后脊髓空洞形成和脱髓鞘，通过上调MBP蛋白表达促进再髓鞘化，从而改善大鼠后肢运动功能。此外，我们发现NRG-1/ErbB4信号通路是神经元再髓鞘化的重要介导通路，也是电针促进脊髓损伤大鼠再髓鞘化及后肢运动功能恢复的潜在治疗机制。
脊髓损伤（SCI）后，神经传导受到多种因素影响而中断，导致损伤部位出现神经功能障碍28。SCI后关键的病理改变，如神经元坏死、脱髓鞘、再髓鞘化及炎症反应，均会促成神经功能缺损29,30。再髓鞘化是SCI后期神经功能恢复的关键因素，且与大鼠后肢运动功能评分密切相关31。研究表明，SCI大鼠模型能较好地模拟人类肢体运动障碍，具有变异度低、稳定性好、可靠性高的特点32,33。本研究中，SCI大鼠表现出明...
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作者声明不存在任何竞争性经济利益。
感谢作者们对本研究的贡献。本研究由国家自然科学基金（NSFC 81960817，82260387）和云南省科学技术厅科技计划基础研究专项（202301AS070020）提供经费支持。川北医学院科研开发项目（CBY22-QNA20）
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BCA 蛋白检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0012S | 定量蛋白分析 |
| 电针仪 | Huatuo 电针仪，SDZ-V，苏州 | — | 治疗设备 |
| FITC 标记的山羊抗人 IgG | Beyotime | A0556 | 荧光二抗 |
| FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG | Beyotime | A0568 | 荧光二抗 |
| FITC 标记的山羊抗兔 IgG | Beyotime | A0562 | 荧光二抗 |
| 荧光显微镜 | Olympus | — | — |
| 人源单克隆 MBP | Abcam | ab209328 | 特异性抗体 |
| LFB 髓鞘染色液 | Solarbio | G3240 | 髓鞘染色 |
| Millipore ECL | Millipore | WBKLS0100 | 检测试剂 |
| 鼠源单克隆 NRG-1 | Santa Cruz | SC-57384 | 特异性抗体 |
| Nanodrop ND-1000 | LabTech | — | |
| NRG1-1 beta | Novoprotein 技术有限公司 | C753 | 重组人 NRG1-1 beta |
| PD158780 | GlpBio 技术公司 | GC15925 | 表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂 |
| PE-10 导管 | 贝克顿·迪金森公司 | 427401 | 鞘内注射 |
| 注射用青霉素钠 | 哈尔滨中精生物技术有限公司 | 80451182 | 术后抗感染治疗 |
| 兔源单克隆 ErbB4 | Abcam | ab109273 | 特异性抗体 |
| RNAiso Plus 试剂盒 | Takara | 9109 | RT-PCR 试剂 |
| RT 试剂盒 | Takara | RR037A | RT-PCR 试剂 |
| 二抗 | Beyotime Biotechnology | — | 特异性抗体 |
| 戊巴比妥钠 | Sigma-Aldrich | 69020100 | 动物麻醉 |
| Yasargil 动脉瘤夹 | Rebstock Instruments GmbH | — | 大鼠脊髓损伤模型构建 |
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