CLCF1运动诱导肌因子研究方案：探究绝经后骨质疏松中RANKL/OPG骨保护机制

Houling Zhao; Hongfei Li; Yanbin Sun

doi:10.3791/69172

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方法文章

CLCF1运动诱导肌因子研究方案：探究绝经后骨质疏松中RANKL/OPG骨保护机制

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DOI：

10.3791/69172

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2025年11月7日

Houling Zhao¹ , Hongfei Li¹ , Yanbin Sun¹

¹Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

本文内容

摘要

本文介绍了一项全面的实验方案，旨在研究运动诱导产生的类心肌营养素细胞因子1（CLCF1）通过调节绝经后骨质疏松症中RANKL/OPG轴发挥骨保护作用的机制。

摘要

近期研究发现，类心肌营养素细胞因子因子1（CLCF1）是一种由运动诱导的“青春分子”，可介导肌肉骨骼系统的益处，但其水平随年龄增长而下降。本方案描述了一种系统性方法，用于探究CLCF1在运动介导的骨保护中的调控作用。通过免疫-骨相互作用机制。该方法包括临床样本分析、分子表征技术和功能检测，以阐明CLCF1对核因子-κB配体受体激活剂（RANKL）κB配体（RANKL）/骨保护素（OPG）信号轴。通过定量聚合酶链式反应（qPCR）、蛋白质印迹（western blotting）、CRISPR/Cas9基因编辑和共培养系统，本方案展示了CLCF1的双重骨保护作用通过 STAT1介导的破骨细胞抑制和STAT3介导的成骨细胞促进作用。所述方法可全面评估CLCF1的表达模式，分析其与骨密度参数的相关性，并对潜在的模拟运动治疗干预措施进行机制评价。与主要靶向破骨细胞的传统抗骨吸收疗法不同，基于CLCF1的干预可能具有独特优势，即在抑制骨吸收的同时促进骨形成。本方案为研究人员提供了标准化操作流程，用于探究运动诱导的细胞因子介导的骨代谢调控机制，并推动针对年龄相关性骨病的靶向治疗干预措施的开发。

引言

绝经后骨质疏松症（PMOP）是与年龄相关的肌肉骨骼系统退变的一个典型范例，其特征是免疫系统失调引发病理性骨丢失¹^,²^,³。尽管运动被广泛认为是预防年龄相关性骨退变最有效的非药物干预手段，但运动诱导骨保护作用的精确分子机制直到最近才逐渐明确⁴。当前对骨代谢的理解已超越传统的内分泌调控框架，扩展至复杂的骨免疫相互作用以及运动诱导产生的肌因子对骨骼稳态的调控作用⁵。

近期研究发现，心肌营养素样细胞因子1（cardiotrophin-like cytokine factor 1, CLCF1）是一种由运动诱导、可对抗年龄相关肌肉骨骼衰退的因子，这一发现标志着人们对骨-肌交互作用的理解发生了范式转变⁶。这项突破性发现通过一种此前未知的分子机制，解释了运动对骨骼保护作用的明确效应，确立了CLCF1在运动诱导成骨过程中的关键介导作用⁷。与野生型对照小鼠相比，CLCF1过表达的转基因小鼠表现出更强的骨形成能力、改善的葡萄糖耐受性以及更优异的运动表现⁶，提示CLCF1补充可能在久坐或行动能力受限人群中模拟运动带来的益处。

运动模拟治疗是指通过药物干预模拟运动诱导的CLCF1动力学，经由分子通路提供与体力活动相似的治疗益处⁸。心肌营养素样细胞因子1（CLCF1），又称为神经营养因子-1（NNT-1）或B细胞刺激因子-3（BSF-3），属于白细胞介素-6（IL-6）细胞因子超家族，具有多种生物学功能⁸。CLCF1最初因其在脊髓运动神经元存活与发育中的神经营养特性而被鉴定，而其作为运动诱导肌细胞因子的作用近年来已成为重要的研究领域。近期的临床研究已证实CLCF1是骨健康状态的生物标志物，显示骨质疏松症绝经后女性外周血单个核细胞中的CLCF1蛋白水平显著低于健康对照组⁹。这些研究发现CLCF1表达水平与多个骨骼部位的骨密度之间存在正相关关系，为CLCF1靶向治疗干预的转化潜力提供了临床验证。

细胞因子通过异源受体复合物发挥作用，这些复合物包括可溶性睫状神经营养因子受体（sCNTFR）和细胞因子受体样因子-1（CRLF-1），以协调多种细胞反应¹⁰^,¹¹。近期的机制研究表明，CLCF1通过双重信号模式同时抑制骨吸收并促进骨形成²^,⁶^,⁷^,⁹。这种双重作用通过差异性激活信号转导子和转录激活子（STAT）通路实现：STAT1的磷酸化通过干扰核因子-κB配体（RANKL）诱导的核因子-κB（NF-κB）信号通路来介导破骨细胞的抑制；而STAT3在成骨细胞中的激活则促进骨形成标志物的表达，包括碱性磷酸酶和骨钙素。

阐明急性运动反应如何转化为慢性骨适应对于治疗策略的开发至关重要¹³。尽管单次运动后CLCF1的急性升高可提供机制性见解，但数周至数月内反复的急性反应可能通过累积性信号传导和细胞适应，产生持续的骨保护效应¹⁴。

研究CLCF1在骨免疫病理生理学中作用的依据源于其在B淋巴细胞调控中的已知功能，以及B细胞是核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）和骨保护素（OPG）的重要产生细胞这一认识¹²^,¹³。核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）/骨保护素（OPG）轴是破骨细胞分化和骨吸收的核心调控机制¹⁴^,¹⁵。与其他通过调节骨重建来控制骨骼稳态的IL-6家族成员不同，CLCF1具有独特的双重骨保护机制，因而展现出更优越的治疗潜力¹⁶^,¹⁷^,¹⁸。

与现有方法相比，本方案的优势在于其对运动骨免疫研究的全面性，结合了临床相关性分析和机制性细胞研究，为CLCF1介导的骨代谢调控提供了转化医学层面的深入见解。随着越来越多的证据表明CLCF1水平可通过生活方式干预进行调节，本方案的临床相关性进一步增强，使其成为治疗年龄相关性骨病的可操作治疗靶点。

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方案

本方案已获得机构研究伦理委员会批准（方案编号 #2024-CHSD-0156），并遵循《赫尔辛基宣言》原则。所有动物实验均符合机构动物护理和使用委员会的指南（方案编号 #2024-037）。所有参与者均签署了书面知情同意书。

1. 临床样本采集与运动干预评估

受试者招募与运动史评估
1. 招募年龄在55至75岁之间、绝经时间不少于1年的绝经后女性。
2. 使用标准化体力活动问卷评估过去6个月内详细的运动史，包括运动频率、强度、类型和持续时间。
3. 将参与者分为久坐不动组（< 150 分钟/周）、中等活动量（150–300 分钟/周）和高活动量（> 根据世界卫生组织（WHO）运动指南分为每周300分钟组。
4. 进行全面的病史评估和体格检查，包括药物使用审查和合并症筛查。
5. 使用Hologic Discovery A型骨密度仪配合APEX软件v4.5获取双能X线吸收测定法（DXA）测量结果。每日使用脊柱体模进行仪器校准。根据国际临床骨密度学会（ISCD）指南，将患者取仰卧位，双腿抬高置于定位垫块上。
6. 根据世界卫生组织骨质疏松症标准（T值 ≤ -2.5 SD）对参与者进行分类。
7. 应用排除标准：12个月内曾接受抗骨质疏松治疗、免疫抑制治疗、代谢性骨病、继发性骨质疏松或存在运动试验禁忌证。
运动诱导的CLCF1反应评估
1. 在早晨8:00至10:00之间，于隔夜空腹12小时后采集EDTA抗凝管中的基线血液样本。
2. 实施标准化的急性运动方案：以最大心率的65-70%进行45分钟中等强度步行。使用卡沃南公式（220－年龄）计算最大心率¹⁹在配备连续心率监测的电动跑步机上进行运动通过佩戴胸带式心率监测器。通过调节坡度，将步行速度保持在3.5–4.5 km/h，以达到目标心率。
3. 在运动后1小时、4小时和24小时采集血液样本，以评估CLCF1的动力学特征，并保持采集条件一致。
4. 将血清分装样品储存于 -80 °C 用于后续 CLCF1 定量。使用检测范围为 31.2–2000 pg/mL 的人 CLCF1 ELISA 试剂盒。用检测稀释液将样本稀释 1:2。采用 2 倍倍比稀释法配制 7 个浓度点的标准曲线。样本重复检测两次。在 450 nm 波长下读板，并以 540 nm 波长进行校正。接受变异系数（CV） < 重复样本间差异为20%。
纵向运动干预方案
1. 设计一个为期12周、每周三次的渐进式锻炼方案。
2. 在基线、4周、8周和12周采集血液样本，用于CLCF1变化轨迹分析。
3. 使用 VO2 max 测试评估基线和终点时的体能改善情况。
4. 将CLCF1的变化与12周时通过DXA测量的骨密度改善情况进行关联分析。
5. 记录训练适应情况，包括运动耐受性和恢复模式。

2. 外周血单个核细胞（PBMC）分离与处理的优化

用于 CLCF1 分析的优化外周血单个核细胞（PBMC）分离
1. 在无菌条件下，使用含 EDTA 的试管（每管含 5 mL EDTA）采集 20 mL 静脉血样本。
2. 采集后 2 小时内处理样本，以确保最佳细胞活力并维持 CLCF1 表达。
  1. 在室温下以 1:1 比例用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释血液样本。将 20 mL 血液与 20 mL PBS 混合。
  2. 将稀释后的血液小心铺于 50 mL 圆锥形离心管中的密度梯度介质上层。每 20 mL 稀释血液使用 15 mL 密度梯度介质（比例为 1:1.33）。
3. 在室温下以 400 × g 离心 30 分钟，离心过程中不启用刹车。
4. 使用无菌巴斯德吸管小心吸取血浆与菲可尔（Ficoll）界面处的 PBMC 层。
5. 用含 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 洗涤细胞两次，每次在 300 × g 条件下离心 10 分钟。
细胞活力评估与 CLCF1 基线水平测定
1. 采用台盼蓝排斥法测定细胞活力（目标细胞活力 > 95%）²⁰。
2. 分离后立即检测细胞内 CLCF1 的基础表达水平。
3. 将细胞浓度调整至 1 × 10⁶ 个细胞/mL，并置于适当培养基中。
4. 将细胞用于后续实验或储存于液氮中。使用含 90% FBS 和 10% DMSO 的冻存液进行 PBMC 冻存，采用程序降温盒以 -1 °C/min 速率降温至 -80 °C。每管分装 1 mL（每管含 5 × 10⁶ 个细胞），置于冻存管中保存。

3. 全面的定量基因表达分析

使用针对 CLCF1 的特定考虑进行 RNA 提取与纯化
1. 在分离后 1 小时内，将 1 × 10⁶ PBMCs 溶于 1 mL RNA 裂解试剂中。
2. 加入 200 µL 氯仿，剧烈涡旋振荡，并在室温下孵育 3 分钟。
3. 在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 15 分钟，实现相分离。
4. 将水相转移至新离心管中，加入等体积异丙醇。
5. 在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟，沉淀 RNA。
6. 用 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀，空气干燥后溶于无核酸酶水中。
7. 使用琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪评估 RNA 完整性（目标 RIN >7.0）。
使用更新引物组进行逆转录与定量 PCR
1. 采用分光光度法测定 RNA 浓度（目标 A260/A280 比值为 1.8–2.2）。
2. 使用逆转录试剂盒对 1 µg 总 RNA 进行逆转录反应。
3. 配制 qPCR 反应体系：每 20 µL 反应体系包含 10 µL 主混合液、0.8 µL 正向和反向引物（10 µM 储液，终浓度 400 nM）、2 µL cDNA 模板（50 ng）、6.4 µL 无核酸酶水。每个样本设三个复孔。使用实时 PCR 系统进行扩增。
4. 使用已验证的引物序列：
  1. CLCF1 正向引物：5'-CCTCCTGCTTCTTGCCTACC-3'，
    反向引物：5'-TGCCACCATGTTTGTTTCCT-3'
  2. CRLF1 正向引物：5'-TGAAGCTCATCCTGCAGTTC-3'，
    反向引物：5'-CAGCATCTCCTCCTTGATGC-3'
  3. STAT1 正向引物：5'-CAGCTTCAGCAGCTTGACTC-3'，
    反向引物：5'-AAGGTCAGCGATGTCTTCAG-3'
  4. STAT3 正向引物：5'-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3'，
    反向引物：5'-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3'
5. 执行 qPCR 程序：95 °C 预变性 10 分钟，随后进行 40 个循环（95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火延伸 1 分钟）。
6. 采用 2^(-ΔΔCt) 法分析结果，并以 β-actin 进行归一化²¹。
运动响应基因面板分析
1. 包含运动响应性基因：IL-6、TNF-α、IL-1β、BDNF、IGF-1 和肌抑素（myostatin）。
2. 使用已验证的引物序列：
  1. IL-6 正向引物：5'-AGCCACTCACCTCTTCAGAAC-3'，
    反向引物：5'-GCCTCTTTGCTGCTTTCACAC-3'；
  2. TNF-α 正向引物：5'-CCCAGGGACCTCTCTCTAATC-3'，
    反向引物：5'-ATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3'；
  3. IL-1β 正向引物：5'-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA-3'，
    反向引物：5'-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3'；
  4. BDNF 正向引物：5'-TAACATGGCTGCGCGTGTGT-3'，
    反向引物：5'-CGAGTGGGTCACAGCGGCAG-3'；
  5. IGF-1 正向引物：5'-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3'，
    反向引物：5'-GCCTCCTTAGATCACAGCTCC-3'；
  6. 肌抑素（myostatin）正向引物：5'-AGTGACGGGCTCTTTGGAAGA-3'，
    反向引物：5'-GTTTCAGAGGCCGGTCAAGT-3'。
3. 将运动诱导的 CLCF1 变化与其他肌因子表达模式进行相关性分析。
4. 评估 CLCF1/CRLF1 共表达比率，作为功能性细胞因子复合物形成的指标。

4. 以 STAT 通路为重点的蛋白质表达增强分析

用于 STAT 分析的蛋白质提取与定量
1. 在裂解缓冲液（150 mM NaCl，1% NP-40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS，50 mM Tris-HCl pH 8.0）中裂解外周血单个核细胞（PBMCs），该缓冲液需添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。
2. 使用前立即加入特异性磷酸酶抑制剂：正钒酸钠（1 mM）和氟化钠（50 mM）。
3. 将裂解液置于冰上孵育30分钟，每隔10分钟以中等速度涡旋振荡一次。
4. 在 12,000 离心 × g 15分钟 4 °C 以去除细胞碎片。
5. 使用Bradford法或BCA法测定蛋白浓度²².
6. 调整蛋白质浓度至 2 µg/µL 在样品缓冲液中并于-80℃保存80 °C 用于后续的蛋白质印迹分析。
聚焦 STAT 信号通路的全面蛋白质印迹分析
1. 使用标准的丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液制备10 mL的10% SDS-PAGE凝胶。
2. 加载 20 µg 每泳道上样等量蛋白质，同时加入预染分子量标记物，在120 V电压下电泳90分钟。
3. 在4°C条件下，以100 V电压将蛋白质转移至PVDF膜上，持续2小时 4 °C 使用转移缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，20% 甲醇）。
4. 用含 0.1% Tween-20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）配制的 5% 脱脂奶粉溶液 50 mL 封闭膜。
5. 4 °C，孵育一抗过夜 4 °C：抗CLCF1（1:1,000）；抗CRLF1（1:1,000）；抗OPG（1:1,000）；抗RANKL（1:1,000）；抗JAK2（1:1,000）；抗磷酸化JAK2（Tyr1007/1008，1:1,000）；抗STAT1（1:1,000）；抗磷酸化STAT1（Tyr701，1:1,000）；抗STAT3（1:1,000）；抗磷酸化STAT3（Tyr705，1:1,000）；抗-β-肌动蛋白（1:1,000）
6. 用15 mL TBST 洗涤膜3次，每次10分钟。室温下与适当的二抗孵育1小时。
7. 使用增强型化学发光底物检测蛋白条带。采用具有自动曝光优化功能的化学发光成像系统进行成像。使用 ImageJ v1.53 软件的凝胶分析工具进行密度分析定量。
STAT1/STAT3 双通路分析
1. 使用 ImageJ/Fiji 软件 1.54f 版本计算磷酸化 STAT1/总 STAT1 和磷酸化 STAT3/总 STAT3 的比值。
2. 以STAT1/STAT3激活平衡评估CLCF1功能活性。
3. 将 STAT 激活模式与 RANKL/OPG 表达比率进行关联分析。
4. 评估 STAT1/STAT3 磷酸化水平通过 CLCF1处理后0、15、30、60、120和240分钟进行Western blot检测。通过密度测定法将磷酸化蛋白水平归一化至总蛋白水平。

5. 基于CRISPR/Cas9的高级基因敲除及验证

增强型慢病毒载体构建
1. 设计靶向 CLCF1 基因序列的单导向RNA（sgRNA）：
  TTGAAGTCTGGCTCGTTGAA-3'
2. 为提高敲除效率，加入额外的sgRNA序列：
  GCTTGAACGAGCCAGACTTC-3'
3. 使用标准的分子克隆技术将sgRNA克隆至慢病毒载体中。
4. 通过DNA测序分析验证构建体的完整性。
5. 使用T7内切酶I检测评估sgRNA切割效率²³.
6. 使用抑制剂进行通路特异性验证：AG490（JAK2， 50 µM），氟达拉滨（STAT1， 10 µM）和 Stattic（STAT3， 5 µM).
7. 使用组成型激活的 STAT 载体进行挽救实验，以验证通路的必要性。
优化的慢病毒转导方案
1. 在 RPMI-1640 培养基（500 mL）中培养 Raji 细胞，添加 10% 胎牛血清（FBS）。所有细胞培养均维持于 37 °C 在含5% CO₂的湿润化培养箱中₂使用前将培养基预平衡至少30分钟。
2. 用聚比伦预处理细胞（8 µg/mL以提高转导效率。
3. 使用包装质粒和包膜质粒在 HEK293T 细胞中生产慢病毒通过磷酸钙转染。通过p24 ELISA测定滴度（> 10⁸ TU/mL 所需）。遵循 BSL-2 生物安全防护程序²³.
4. 以感染复数（MOI）为100的慢病毒感染细胞。感染后24小时更换培养基。使用嘌呤霉素筛选感染后的细胞。4 µg/mL) 中培养 7 天，然后使用以下 PCR 条件扩增跨越靶位点的 500 bp 区域：初始变性条件为 95 °C 3分钟，随后进行35个循环的变性步骤，变性温度为 95 °C 30秒，退火于 60 °C 30 秒，以及延伸阶段 72 °C 30秒，最后延伸阶段在 72 °C 5分钟。对于T7核酸酶检测，将PCR产物变性并重新退火后，加入T7E1核酸酶在30分钟内消化 37 °C，然后在2%琼脂糖凝胶上分析产物。
5. 通过蛋白质印迹法和Sanger测序验证基因敲除效率²⁴^,²⁵.
6. 使用 GUIDE-seq 或类似方法进行脱靶分析²⁶.
  注意：近期证据表明，CLCF1 的分泌效率依赖于与伴侣蛋白 CRLF1 的共表达。为实现完全的功能缺失，应考虑采用双基因敲除策略。²⁷.

6. 含运动模拟物的综合性共培养系统

注意：为进行转化验证，可通过给予去卵巢小鼠模型 rhCLCF1 进行适应 10 µg/kg 腹腔注射，每日一次，持续4周，评估骨密度通过微计算机断层扫描

Raji-MG-63 高级共培养体系的建立
1. 在24孔板下室中以每平方厘米2 × 10⁴个细胞的密度接种MG-63成骨样细胞 × 10⁴ 细胞/孔，在湿润的培养箱中于 37 °C 含5% CO₂ 和95%湿度。使用前将培养基在培养箱中预平衡30分钟。为增强翻译效果，可替换为原代人成骨细胞（密度1 × 10⁴/孔）来自商业来源。
2. 放置 0.4 µm 孔径膜插件置于含有 MG-63 细胞的孔中。
3. 将Raji细胞（野生型、CLCF1敲除型或CLCF1过表达型）以1×10⁵个/mL的密度接种于上室 × 10⁵ 细胞/孔
4. 在指定的实验周期（7、14、21天）内，将共培养体系置于完全RPMI-1640培养基中培养（下室2 mL，上室1.5 mL），于 37 °C 5% CO₂条件下₂.
5. 设置重组CLCF1（5-10 ng/mL）处理组，以评估剂量-反应关系。
运动模拟型CLCF1治疗方案
1. 根据运动诱导水平，用生理浓度的重组CLCF1（5-10 ng/mL）处理共培养系统。
2. 应用脉冲式CLCF1处理方案：在第1天的0、8和16小时分别进行每次2小时的CLCF1脉冲处理，随后持续暴露24小时，然后重复该循环。总处理时间为7天，共9次脉冲。
3. 在处理后1小时、4小时、24小时和7天评估时间依赖性效应。
4. 监测两种细胞群体中 STAT1/STAT3 的磷酸化动力学通过 0、15、30、60 分钟进行 Western 印迹。用裂解缓冲液裂解细胞（500 µL）与抑制剂处理，以总STAT1/3为内参进行归一化 β-actin
增强的成骨分化评估
1. 使用含有抗坏血酸的标准成骨诱导培养基诱导成骨分化50 µg/mL), β-甘油磷酸钠（10 mM）和地塞米松（10 nM）。每3天更换一次成骨培养基（下室2 mL，上室1.5 mL）；每次换液时均需配制新鲜的抗坏血酸溶液； β-甘油磷酸盐和地塞米松保持稳定。
2. 在第7、14和21天采用比色酶法测定碱性磷酸酶（ALP）活性²⁸使用 500 µL 提取体积的测定。在405 nm处读数。以总蛋白含量归一化。预期颜色范围：浅黄色（低）至深黄色（高）。
3. 通过茜素红S染色及第21天的定量分析评估钙沉积。提取 500 µL 氯化十六烷基吡啶，于540 nm处读数，预期颜色范围：浅粉色（矿化程度低）至深红色（矿化程度高）。
4. 通过十六烷基吡啶氯化物提取后，在540 nm处测定吸光度以定量矿化程度。
5. 采用第3.2步所述qPCR方案分析成骨基因表达：RUNX2、ALP、COL1A1、OCN和OPG。
6. 检测MG-63细胞中破骨细胞相关标志物：TRAP、组织蛋白酶K和RANKL。

7. 高级统计分析与数据解释

全面的统计学方法
1. 对所有连续变量使用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验²⁹. 当正态性假设不成立时（p < 0.05).
2. 对组间非参数比较采用 Mann-Whitney U 检验³⁰.
3. 对CLCF1水平与临床参数之间的关联性进行Spearman相关性分析³¹.
4. 进行多元回归分析以评估骨密度的独立预测因子。
5. 使用重复测量方差分析进行运动干预时间过程分析³².
6. 对多重比较进行邦弗罗尼校正³³.
7. 设定统计学显著性阈值为 p < 所有分析的显著性水平均为 0.05。
增强的数据展示与分析
1. 将连续数据以均值表示 ± 标准差或带有四分位距的中位数
2. 使用 GraphPad Prism v9 进行统计分析，ImageJ v1.53 进行密度测定，绘制 CLCF1 表达水平与骨密度（BMD）、淋巴细胞计数及运动参数的相关性图谱。无需使用自定义脚本。生成 ROC 曲线通过 Prism 内置工具；相关性分析通过 Prism 中的 Spearman 检验。
3. 生成运动诱导的CLCF1反应动力学的时间进程图。
4. 为CLCF1作为骨质疏松症生物标志物绘制受试者工作特征（ROC）曲线。
  注：代表性蛋白印迹图像通过定量密度分析生成。

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结果

通过多种实验方法实施本方案，成功证实了CLCF1在免疫介导的骨代谢中的调控作用。临床验证研究显示，与健康对照组相比，原发性骨质疏松症（PMOP）患者中CLCF1的表达显著下调，如图1A所示。对外周血单个核细胞进行的定量PCR分析表明，PMOP组（n = 109）的相对CLCF1 mRNA水平较健康绝经后对照组（n = 94）明显降低，表达量约减少40%（p < 0.001）。该结果在蛋白水平上得到进一步验证，Western blot分析显示PMOP患者体内CLCF1蛋白（35 kDa）表达减少，密度测定定量结果显示其表达量较对照组约降低25%（p < 0.001；图1B）。

为了确定CLCF1表达降低的临床相关性，我们分析了CLCF1蛋白水平与多种临床参数之间的相关性。图2A

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讨论

本方案提供了一个全面的方法学框架，通过系统分析RANKL/OPG轴，研究CLCF1作为运动诱导的骨保护介质的作用。近期突破性研究已鉴定出CLCF1是一种由运动诱导的因子，可对抗与年龄相关的肌肉骨骼衰退，使其成为运动诱导骨保护的核心介质³⁴^,³⁵^,³⁶。该优化方案通过提供标准化的方法学，研究一种新发现的具有双重骨保护作用的运动模拟因子，填补了骨免疫学领域的一项关键知识空白。

通过近期技术进步所确定的关键步骤强调，需精心设计运动干预方案以优化CLCF1的响应动力学，样品处理过程中应谨慎保留STAT磷酸化状态，并采用标准化的共培养条件以评估骨-免疫相互作用。研究表明，CLCF1的分泌效率依赖于与CRLF1分子伴侣蛋白的共表达，因此必须严格验证基因敲除效率，并考虑双靶点干预策略。⁷^,⁹

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

作者感谢参与本研究的志愿者，以及山东第一医科大学附属中心医院的临床工作人员在患者招募和样本采集方面提供的协助。我们感谢实验室技术人员在细胞培养和分子生物学实验中给予的支持。H.Z. 构思并设计了本研究，进行了实验，分析了数据，并撰写了论文。H.L. 参与了实验设计、数据收集和论文修改。Y.S. 监督了项目进展，提供了关键性意见，并对论文进行了编辑。所有作者均审阅并批准了最终稿件的提交。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养基 & 试剂
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650	目的与应用：冻存培养基组分规格_备注：分子生物学级别，无菌过滤
DMEM 培养基	Thermo Fisher Scientific	11965092	用途与应用 MG-63 成骨细胞培养基规格_备注：含L-谷氨酰胺的高糖配方
胎牛血清（FBS）	Thermo Fisher Scientific	16000044	用途与应用细胞培养补充剂（热灭活）规格_备注：56℃热灭活Â°C 30 分钟
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技	15140122	目的与应用无菌培养用抗生素添加剂规格_说明：100倍浓缩液，终浓度为1%
Polybrene（Hexadimethrine bromide）	Santa Cruz Biotechnology	sc-134220	用途与应用慢病毒转导增强剂规格_备注：8 Î¼g/mL 工作浓度
嘌呤霉素二盐酸盐	InvivoGen	抗破骨细胞生成实验方案-1	用途与应用转导细胞的筛选抗生素规格_备注：4 Î¼7 天，g/mL 筛选浓度
RPMI-1640 培养基	Thermo Fisher Scientific	11875093	目的与应用： Raji B淋巴细胞培养基规格_备注：含 L-谷氨酰胺，建议不含酚红
台盼蓝溶液	Thermo Fisher Scientific	15250061	用途与应用细胞活力评估排除试验用 0.4% 溶液
程序降温盒	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	用途与应用程序降温细胞冻存（-1Â°C/分钟 Specifications_Comments: Mr. Frosty 或同等设备用于 -1Â°C/分钟冷却
EDTA 血液采集管	BD Biosciences	366643	用途与应用使用抗凝剂进行静脉采血规格_备注：10–20 mL 容量，紫色管帽试管
Ficoll-Paque PLUS 密度梯度	Cytiva (GE Healthcare)	17144003	用途与应用通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞规格_备注：无菌，经内毒素检测，适用于细胞分离
磷酸盐缓冲液（PBS）	赛默飞世尔科技	14190144	用途与应用细胞洗涤与稀释缓冲液无菌，细胞培养级
RNA提取 & qPCR
氯仿（ACS级）	Sigma-Aldrich	C2432	用途与应用 RNA提取中的相分离规格_说明：ACS试剂级， â‰¥99% 纯度
乙醇（75%，分子级）	Sigma-Aldrich	E7023	用途与应用 RNA沉淀洗涤规格_说明：分子生物学级别，现配现用
异丙醇（分子生物学级）	Sigma-Aldrich	I9516	用途与应用 RNA 沉淀规格_备注：分子生物学级别， â‰¥99.5% 纯度
无核酸酶水	Thermo Fisher Scientific	AM9930	用途与应用： PCR反应体系的配制规格_备注：无DNase/RNase，经PCR应用测试
光学胶膜	Thermo Fisher Scientific	4311971	用途与应用 qPCR板的光学密封规格_备注：适用于 qPCR 应用的光学质量
PCR板（96孔）	Thermo Fisher Scientific	N8010560	用途与应用 96孔板高通量qPCR格式规格_备注：白色，透明底，适用于光学检测
PCR管条	Thermo Fisher Scientific	AB0451	用途与应用小体积PCR反应 8联管条，带独立管盖
PrimeScript RT 试剂盒	Takara Bio	RR037A	用途与应用 RNA逆转录为cDNA 规格_说明：含gDNA Eraser用于基因组DNA去除
SYBR Green Master Mix	应用生物系统公司	4309155	用途与应用实时 PCR 扩增与检测规格_备注：含用于归一化的 ROX 参比染料
TRIzol试剂（RNA裂解）	赛默飞世尔科技	15596026	用途与应用细胞裂解与RNA提取储存条件：4℃保存Â°C，6 个月内使用
蛋白质分析 - 蛋白质印迹法
丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）	伯乐（Bio-Rad）	1610146	用途与应用 SDS-PAGE 凝胶聚合规格_备注：30% 丙烯酰胺贮存液
BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23225	用途与应用：蛋白质浓度定量规格_说明：适用于还原性条件以实现准确定量
增强型化学发光底物	Thermo Fisher Scientific	32106	用途与应用化学发光蛋白质检测灵敏度检测：飞克级
脱脂奶粉	实验室科学	170-6404	用途与应用 Western blot 封闭剂规格_说明：封闭等级，低背景
磷酸酶抑制剂混合物	罗氏应用科学	4906845001	用途与应用防止蛋白质去磷酸化规格_说明：包含冈田酸和海绵念珠菌素A
预染蛋白质分子量标准	Bio-Rad	1610394	用途与应用分子量参考标准规格_备注：10–250 kDa 范围，共11条带
蛋白酶抑制剂混合物	罗氏应用科学	11697498001	用途与应用在裂解过程中防止蛋白质降解规格_说明：不含EDTA，适用于金属依赖性磷酸酶
PVDF 膜（0.45 Î¼m)	Millipore Sigma	IPVH00010	用途与应用蛋白转印膜（0.45 Î¼m孔规格_备注：低荧光背景
RIPA裂解缓冲液	Cell Signaling Technology	9806S	目的与应用：全细胞蛋白提取规格_备注：含去垢剂的即用型裂解缓冲液
上样缓冲液（4X）	Bio-Rad	1610747	用途与应用用于 SDS-PAGE 的蛋白质样品制备上样缓冲液含 Î²-巯基乙醇
SDS-PAGE电泳缓冲液	Bio-Rad	1610732	用途与应用：蛋白质电泳 Tris-甘氨酸-SDS 缓冲系统
氟化钠	Sigma-Aldrich	201154	用途与应用：额外的磷酸酶抑制工作浓度：50 mM
原钒酸钠	Sigma-Aldrich	S6508	用途与应用： JAK2/STAT 磷酸化保留工作浓度：1 mM，现用现配
转移缓冲液浓缩液	Bio-Rad	1704156	目的与应用：半干式蛋白转印规格_说明：10倍浓缩液，使用前需稀释
含吐温-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（TBST）	Cell Signaling Technology	9997S	用途与应用膜洗涤与抗体稀释 0.1% 吐温-20，pH 7.6
CRISPR/基因编辑
磷酸钙转染试剂盒	Promega	E1200	用途与应用将DNA转染至包装细胞规格_备注：用于慢病毒生产的高转染效率
DNA凝胶回收试剂盒	Qiagen	28706	用途与应用用于测序的PCR产物纯化基于柱的纯化系统
GV371 慢病毒载体	GeneChem Co., Ltd	GV371	用途与应用 CRISPR/Cas9 表达用于基因敲除规格_说明：即用型 CRISPR/Cas9 慢病毒系统
HEK293T细胞系	ATCC	CRL-3216	目的与应用慢病毒包装细胞系规格_说明：高转染效率的包装细胞系
Sanger 测序服务	Macrogen Inc.	定制	用途与应用：基因敲除验证与脱靶效应分析规格_备注：使用定制引物的标准测序
T7 内切酶 I	New England Biolabs	M0302S	用途与应用 CRISPR 切割效率验证规格_说明：用于CRISPR验证的错配特异性核酸酶
ELISA & 免疫测定法
ELISA 板（96 孔，平底）	康宁	3590	目的与应用： ELISA底物反应规格_备注：高结合力，平底，适用于ELISA
人CLCF1 DuoSet ELISA	R&D 系统	DY1234	用途与应用 CLCF1 蛋白定量（31.2–2000 pg/mL）规格_备注：检测范围：31.2–2000 pg/mL，CV & 10%
p24 ELISA 试剂盒（慢病毒滴度）	ZeptoMetrix Corporation	801111	用途与应用慢病毒滴度测定规格_备注：用于慢病毒滴度测定（>10â¸ TU/mL
功能实验
茜素红 S 染色试剂盒	Sigma-Aldrich	A5533	用途与应用：钙沉积可视化规格_说明：蒸馏水中2%溶液，pH值4.1–4.3
碱性磷酸酶活性检测试剂盒	Abcam	ab83369	用途与应用 ALP 酶活性测定规格_说明：比色法检测，405 nm 处读数
抗坏血酸（L-抗坏血酸）	Sigma-Aldrich	A4544	用途与应用成骨培养基组分规格_备注：50 Î¼g/mL 终浓度
氯化十六烷基吡啶	Sigma-Aldrich	C9002	目的与应用：茜素红S提取定量法规格_备注：用于染料提取的10%溶液
地塞米松	Sigma-Aldrich	D4902	用途与应用成骨培养基组分终浓度：10 nM
Î²甘油磷酸盐	Sigma-Aldrich	G9422	目的与应用：成骨培养基组分终浓度：10 mM
成骨分化培养基	PromoCell	C-28010	用途与应用：成骨细胞分化诱导规格_备注：即用型完全成骨培养基
Transwell 细胞培养小室（0.4 Î¼m)	康宁	3470	目的与应用： 0.4 μm 转孔共培养系统 Î¼m 分离规格_备注：聚对苯二甲酸乙二醇酯膜，无菌
设备——主要仪器
离心机（高速，制冷型）	Eppendorf	5430R	用途与应用样品处理与细胞分离规格_备注：冷藏，最高30,000 x g
化学发光成像系统	伯乐实验室	12003154	目的与应用： Western blot成像与定量规格说明：凝胶成像与蛋白质印迹成像
CO2 培养箱（带湿度控制）	Thermo Fisher Scientific	51030287	用途与应用细胞培养维持（37Â°C，5% CO₂ 三气（CO2/O2/N2）控制，湿度调节
心率监测器（胸带）	Polar Electro	H10	用途与应用持续心率监测规格_备注：蓝牙连接， Â±1 bpm 精度
Hologic Discovery A DXA 扫描仪	Hologic Inc.	发现 A	用途与应用骨密度测量规格说明：使用 APEX 软件 v4.5 时，需进行每日质量控制
酶标仪（多功能）	BioTek Instruments	Synergy H1	用途与应用 ELISA板读数与吸光度测定紫外-可见光、荧光、化学发光检测
电动跑步机	力健	95Ti	用途与应用：标准化运动干预规格说明：变频速度 0-16 km/h，坡度 0-15%
实时荧光定量PCR系统（CFX96或同等型号）	伯乐实验室	1855195	用途与应用实时荧光定量PCR扩增与检测规格_备注：96孔板，可进行梯度扩增
软件 & 分析工具
APEX 软件 v4.5（DXA 分析）	Hologic Inc.	v4.5	用途与应用 DXA 扫描分析与骨密度计算规格_说明：参考数据库的骨密度分析
Bio-Rad CFX Maestro	伯乐实验室	CFX Maestro	用途与应用 qPCR 数据分析与 Ct 值确定规格_说明：实时 PCR 分析与数据导出
GraphPad Prism v9.0	GraphPad Software	v9.0	目的与应用：统计分析与图表生成规格说明：具备图表生成功能的统计软件
ImageJ/Fiji v1.53	美国国立卫生研究院	v1.53	用途与应用 Western blot 蛋白质印迹密度测定与图像分析规格_说明：使用测量工具进行图像分析
Microsoft Excel 365	Microsoft Corporation	365	用途与应用数据整理与基础计算规格说明：数据组织与基础统计功能
耗材 & 塑料器皿
1.5 mL 微量离心管	Eppendorf	22363204	用途与应用小体积样本的保存与处理规格_备注：无 DNase/RNase，低吸附
15 mL 圆锥形离心管	康宁	430766	目的与应用：中等体积样本处理规格_备注：聚丙烯，带刻度，带盖
24孔细胞培养板	康宁	3524	用途与应用共培养与功能实验设置规格_备注：经组织培养处理，平底
50 mL 离心管	康宁	430829	用途与应用大体积样本采集与处理规格_备注：聚丙烯，带刻度，带盖
冻存管（1 mL）	Thermo Fisher Scientific	375418	用途与应用长期细胞与样本在 -80 ℃ 的保存Â°C 规格_备注：外螺纹，O型圈密封，-196Â°C 评分
巴斯德吸管（无菌）	Fisher Scientific	13-678-20A	目的与应用：无菌样本采集与转运规格_备注：独立包装，无菌

参考文献

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CLCF1运动诱导肌因子研究方案：探究绝经后骨质疏松中RANKL/OPG骨保护机制

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