本文介绍了一种评估γ-分泌酶抑制剂LY900009对RANKL诱导的骨髓来源巨噬细胞破骨细胞生成抑制作用的实验方案。该方案包括细胞毒性评估、功能实验、分子分析以及 体内 在小鼠溶骨模型中的验证及其在溶骨性疾病治疗开发中的应用
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本文介绍了一种评估γ-分泌酶抑制剂LY900009对RANKL诱导的骨髓来源巨噬细胞破骨细胞生成抑制作用的实验方案。该方案包括细胞毒性评估、功能实验、分子分析以及 体内 在小鼠溶骨模型中的验证及其在溶骨性疾病治疗开发中的应用
破骨细胞活性失调在溶骨性疾病进展中起着重要作用，然而现有治疗手段的应用受限于其不良反应。本研究探讨了γ-分泌酶抑制剂LY900009通过调控Notch信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞生成的能力。利用骨髓来源的巨噬细胞，我们进行了全面的 体外 细胞毒性、分化及功能检测的评估。采用qPCR和Western印迹法进行基因和蛋白表达分析，以阐明其潜在的分子机制。 体内 使用小鼠脂多糖诱导的骨吸收模型验证了疗效。LY900009以剂量依赖性方式抑制RANKL诱导的破骨细胞形成及其吸收功能，在治疗浓度下无细胞毒性。该处理显著减少了TRAP阳性破骨细胞数量，损害了肌动蛋白环的形成，并抑制了骨基质降解。破骨细胞标志物（包括NFATc1、c-Fos、组织蛋白酶K和TRAP）的表达显著下调。作用机制上，LY900009干扰了Notch信号通路及其下游的MAPK/Akt通路。 体内 给药显著减轻了LPS诱导的骨破坏，改善了骨参数并减少了破骨细胞数量。这些结果表明，LY900009通过调控Notch/MAPK/Akt信号轴，有效抑制破骨细胞生成和骨吸收，具有成为溶骨性疾病治疗药物的潜力。
骨稳态是脊椎动物体内一种高度协调的生理范式，由成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞驱动的骨吸收之间的精细平衡所调控1。这种复杂的平衡在整个生命周期中维持着骨骼的完整性、生物力学韧性及代谢准确性，并动态响应机械负荷、内分泌变化以及病理挑战2。骨重建循环包括激活、吸收、转换、形成和终止等相继阶段，每个阶段均由复杂的分子级联反应调控，以确保细胞活动在时间和空间上的同步3。
这一稳态机制的破坏，尤其是破骨细胞活性过度或成骨细胞功能不足，会引发病理性骨丢失，这是多种溶骨性疾病的典型特征4,5。这些疾病涵盖广泛的病理类型，包括绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症、类风湿关节炎、炎症性关节炎、肿瘤性骨侵犯、佩吉特病（Paget's disease）以及牙周疾病6。过度骨吸收的临床表现包括骨折风险升高、骨骼畸形、慢性疼痛、功能障碍以及巨大的医疗负担6,7。当前流行病学数据显示，仅骨质疏松症就影响全球超过2亿人，相关骨折导致显著的发病率、死亡率以及每年超过数百亿美元的经济成本
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所有动物实验均按照机构指南进行，并经山东第一医科大学附属中心医院动物护理与使用委员会批准（批准号：IACUC-2024-015）。本研究遵循既定的动物研究伦理原则及ARRIVE指南，包括将动物饲养于标准笼具中（每笼5只小鼠，12小时明/暗循环， 随意摄取 食物/水）及随机分组
1. 骨髓来源巨噬细胞的分离与培养
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本方案的成功实施表明，LY900009 通过多种相互关联的机制，对破骨细胞的形成和功能发挥出显著的抑制作用。对骨髓来源巨噬细胞进行的初步细胞毒性评估显示，毒性随时间呈依赖性增加，在 24 h、48 h 和 96 h 的 IC50 值分别为 4.44 µM、3.66 µM 和 2.93 µM（图 1A、B）。重要的是，这些产生细胞毒性的浓度明显高于治疗有效剂量，表明其具有良好的治疗窗口。LY900009 的分子结构如 图 1C 所示。TRAP 染色分析显示，LY900009 以剂量依赖方式抑制 RANKL 诱导的破骨细胞形成，在 100 至 400 nM 浓度范围内，破骨细胞数量和大小均显著减少（图 1D–F）。利用羟基磷灰石包被表面进行的功能评估表明，骨吸收活性相应受损，吸收陷窝的形成及总吸收面积均明显下降（图 2A
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本研究提供了有力证据，表明LY900009通过强效且选择性地抑制破骨细胞生成，有望成为治疗溶骨性疾病的潜在治疗剂，这与当前γ-分泌酶抑制剂在骨相关疾病领域日益增长的研究兴趣相一致14,20,21研究结果表明，该γ-分泌酶抑制剂通过协调抑制包括Notch、MAPK、PI3K/Akt和NF-κB在内的多个关键信号通路，有效抑制RANKL诱导的破骨细胞形成及其骨吸收功能。这些结果的治疗意义不仅限于机制层面的理解，还体现在该化合物可有效预防脂多糖（LPS）诱导的骨丢失。 体内，表明其在治疗炎症性和代谢性骨病方面具有重要的临床潜力7,8,19,25在有效浓度（0.1–0.4 µM）与细胞毒性.......
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作者声明不存在竞争性财务利益或利益冲突。任何作者均与本研究中提及的商业实体无财务关系。所有作者均已填写国际医学期刊编辑委员会（ICMJE）的披露表格。
作者谨此感谢山东第一医科大学附属中心医院和肥城市人民医院的工作人员在本研究过程中提供的技术支持与帮助。我们 также感谢实验室同事在动物实验中给予的宝贵讨论和协助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔细胞培养板 | Corning | 3524 | 免疫荧光显微镜 |
| 6孔细胞培养板 | Corning | 3516 | 细胞培养与蛋白质印迹 |
| 70% 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | 灭菌与消毒 |
| 75% 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7148 | RNA洗涤缓冲液 |
| 96孔细胞培养板 | Corning | 3596 | 细胞培养与检测 |
| 铝滤膜（0.5 mm） | Bruker | N/A | 微型CT扫描滤波器 |
| 抗CD11b-FITC抗体 | BioLegend | 101206 | 流式细胞术 - 巨噬细胞标记物 |
| 抗裂解Notch1抗体（兔单克隆） | Cell Signaling Technology | 4147S | 蛋白质印迹 - Notch信号通路 |
| 抗F4/80-PE抗体 | BioLegend | 123108 | 流式细胞术 - 巨噬细胞标记物 |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1000 | 荧光显微镜封片 |
| 抗Hes1抗体（兔单克隆） | Cell Signaling Technology | 11988S | 蛋白质印迹 - Notch下游靶标 |
| 抗NFATc1抗体（鼠单克隆） | Santa Cruz Biotechnology | sc-7294 | 蛋白质印迹 - 破骨细胞主调控因子 |
| 抗磷酸化Akt（Ser473）抗体 | Cell Signaling Technology | 4060S | 蛋白质印迹 - PI3K/Akt信号通路 |
| 抗磷酸化ERK1/2（Thr202/Tyr204）抗体 | Cell Signaling Technology | 4370S | 蛋白质印迹 - MAPK信号通路 |
| 抗磷酸化NF-κB p65（Ser536）抗体 | Cell Signaling Technology | 3033S | 蛋白质印迹 - NF-κB信号通路 |
| 抗磷酸化p38 MAPK（Thr180/Tyr182）抗体 | Cell Signaling Technology | 4511S | 蛋白质印迹 - p38 MAPK信号通路 |
| 抗-β-肌动蛋白抗体（鼠单克隆） | Cell Signaling Technology | 4970S | 蛋白质印迹上样对照 |
| 自动成像读取仪 | Molecular Devices | ImageXpress Micro | 骨吸收陷窝定量分析 |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Pierce/Thermo Fisher | 23225 | 蛋白浓度测定 |
| 漂白剂（10%次氯酸钠） | Sigma-Aldrich | 425044 | 从骨吸收板上清除细胞 |
| BSA（牛血清白蛋白） | Sigma-Aldrich | A7906 | 免疫荧光封闭缓冲液 |
| C57BL/6小鼠（雄性，5-8周龄） | Charles River Laboratories | 27 | 体外BMM分离与体内研究 |
| 草酸钙测试试剂 | Sigma-Aldrich | C0350 | 脱钙完成检测 |
| CCK-8试剂（细胞计数试剂盒-8） | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | 细胞活力评估 |
| 细胞筛（70 μm） | BD Falcon | 352350 | 骨髓细胞过滤 |
| 离心机（带制冷） | Eppendorf | 5424R | 细胞与样品制备 |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | C2432 | RNA提取相分离 |
| CO2室 | Euthanex Corp | EX-075 | 动物安乐死 |
| CTAn软件 | Bruker | 版本1.20 | 微型CT图像分析 |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚） | Sigma-Aldrich | D9542 | 细胞核复染 |
| 二甲基甲酰胺（DMF） | Sigma-Aldrich | D4551 | TRAP染色溶剂 |
| DMSO（二甲基亚砜） | Sigma-Aldrich | D2650 | 溶剂对照制备 |
| ECL蛋白质印迹底物 | Pierce/Thermo Fisher | 32106 | 蛋白质印迹中的蛋白检测 |
| EDTA（10%，pH 7.4） | Sigma-Aldrich | E6758 | 脱钙溶液 |
| 伊红Y | Sigma-Aldrich | E4009 | H&E组织学染色 |
| 快红紫红LB盐 | Sigma-Aldrich | F3381 | TRAP染色显色剂 |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco/Thermo Fisher | 16140-071 | 细胞培养补充物 |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | FACSCalibur | BMM表征 |
| 荧光显微镜 | Olympus | IX73 | 免疫荧光成像 |
| G*Power软件 | 海因里希·海涅大学 | 版本3.1 | 统计功效分析 |
| 玻璃盖玻片（22 × 22 mm） | Fisher Scientific | 12-541-B | 免疫荧光显微镜 |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | 版本9.0 | IC50计算与作图 |
| 苏木精 | Sigma-Aldrich | H3136 | H&E组织学染色 |
| 血细胞计数板 | Hausser Scientific | 3200 | 细胞计数 |
| 高容量cDNA反转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 | 从RNA合成cDNA |
| HRP标记抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 7076S | 蛋白质印迹二抗 |
| HRP标记抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 7074S | 蛋白质印迹二抗 |
| 羟基磷灰石包被96孔板 | Corning BioCoat | 354651 | 骨吸收功能检测 |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院（NIH） | 版本1.53e | 图像分析与定量 |
| 培养箱（CO2） | Thermo Fisher | 51033058 | 细胞培养维持 |
| 红外成像系统 | Bio-Rad | ChemiDoc MP | 蛋白质印迹检测 |
| 倒置显微镜 | Olympus | CKX41 | 细胞培养监测、TRAP计数 |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich | I9516 | RNA沉淀 |
| LPS（来自大肠杆菌的脂多糖） | Sigma-Aldrich | L4391 | 体内炎症性骨吸收 |
| LY900009（γ-分泌酶抑制剂） | Selleck Chemicals | S7999 | 测试化合物 - 破骨细胞抑制剂 |
| M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子） | R&D Systems | 416-ML-010 | 巨噬细胞存活与破骨细胞分化 |
| 微型CT扫描仪 | Bruker | SkyScan 1272 | 骨微结构分析 |
| 微孔板读取仪 | BioTek | Synergy H1 | 吸光度测量（CCK-8） |
| 切片机 | Leica | RM2255 | 组织切片 |
| 萘酚AS-MX磷酸盐 | Sigma-Aldrich | N5000 | TRAP染色底物 |
| 针头（25G，27G） | BD | 305122, 305109 | 骨髓冲洗、注射 |
| NRecon软件 | Bruker | 版本1.7 | 微型CT图像重建 |
| 石蜡 | Sigma-Aldrich | P3683 | 组织包埋 |
| 多聚甲醛（4%） | Sigma-Aldrich | P6148 | 细胞与组织固定 |
| PBS（磷酸盐缓冲盐水） | Gibco/Thermo Fisher | 14190-144 | 细胞洗涤与缓冲液制备 |
| 戊巴比妥钠 | Sigma-Aldrich | P3761 | 动物麻醉与安乐死 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | 4906837001 | 磷酸化状态保护 |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25742 | 定量实时PCR |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11697498001 | 防止蛋白质降解 |
| PVDF膜（0.45 μm） | Bio-Rad | 1620177 | 蛋白质印迹蛋白转膜 |
| RANKL（NF-κB受体活化因子配体） | R&D Systems | 462-TEC-010 | 诱导破骨细胞分化 |
| 实时PCR系统 | Applied Biosystems | 7500 Fast | 定量基因表达分析 |
| 罗丹明-鬼笔环肽 | Invitrogen/Thermo Fisher | R415 | F-肌动蛋白可视化 |
| RIPA缓冲液 | Cell Signaling Technology | 9806S | 蛋白提取 |
| 无RNase水 | Ambion/Thermo Fisher | AM9937 | RNA溶解与PCR |
| SDS-PAGE凝胶（10%） | Bio-Rad | 4561036 | 蛋白质印迹蛋白分离 |
| 脱脂奶粉 | Bio-Rad | 1706404 | 蛋白质印迹封闭 |
| 醋酸钠缓冲液（0.1 M，pH 5.0） | Sigma-Aldrich | S2889 | TRAP染色缓冲液 |
| 酒石酸钠（50 mM） | Sigma-Aldrich | S4297 | TRAP染色特异性 |
| 分光光度计 | Thermo Fisher | NanoDrop 2000 | RNA/蛋白浓度测定 |
| SPSS | IBM Corporation | 版本28.0 | 统计分析 |
| 注射器（1 mL，10 mL） | BD | 309659, 309604 | 骨髓冲洗、注射 |
| T75细胞培养瓶 | Corning | 430641 | 原代BMM培养 |
| TBST（含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水） | Bio-Rad | 1706531 | 蛋白质印迹洗涤缓冲液 |
| 转膜缓冲液 | Bio-Rad | 1704270 | 蛋白质印迹蛋白转膜 |
| 吐温X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 细胞通透化 |
| TRIzol试剂 | Invitrogen/Thermo Fisher | 15596026 | 总RNA提取 |
| 台盼蓝（0.4%） | Sigma-Aldrich | T8154 | 细胞活力评估 |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | Gibco/Thermo Fisher | 25200-056 | 细胞收获与解离 |
| 蛋白质印迹转膜系统 | Bio-Rad | Trans-Blot Turbo | 蛋白转移至膜上 |
| 二甲苯 | Sigma-Aldrich | X3750 | 组织处理与透明化 |
| α-MEM（α-最低必需培养基） | Gibco/Thermo Fisher | 12561-056 | 细胞培养基 |
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