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方法文章

LY90009通过调控Notch信号通路在溶骨性疾病模型中抑制破骨细胞生成

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DOI：

10.3791/69178

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2025年10月7日

 ,  , 
1Department of Rheumatology, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University, 2Department of Geriatrics, Feicheng People's Hospital, 3Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

本文内容

摘要

本文介绍了一种评估γ-分泌酶抑制剂LY900009对RANKL诱导的骨髓来源巨噬细胞破骨细胞生成抑制作用的实验方案。该方案包括细胞毒性评估、功能实验、分子分析以及 体内 在小鼠溶骨模型中的验证及其在溶骨性疾病治疗开发中的应用

摘要

破骨细胞活性失调在溶骨性疾病进展中起着重要作用，然而现有治疗手段的应用受限于其不良反应。本研究探讨了γ-分泌酶抑制剂LY900009通过调控Notch信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞生成的能力。利用骨髓来源的巨噬细胞，我们进行了全面的 体外 细胞毒性、分化及功能检测的评估。采用qPCR和Western印迹法进行基因和蛋白表达分析，以阐明其潜在的分子机制。 体内 使用小鼠脂多糖诱导的骨吸收模型验证了疗效。LY900009以剂量依赖性方式抑制RANKL诱导的破骨细胞形成及其吸收功能，在治疗浓度下无细胞毒性。该处理显著减少了TRAP阳性破骨细胞数量，损害了肌动蛋白环的形成，并抑制了骨基质降解。破骨细胞标志物（包括NFATc1、c-Fos、组织蛋白酶K和TRAP）的表达显著下调。作用机制上，LY900009干扰了Notch信号通路及其下游的MAPK/Akt通路。 体内 给药显著减轻了LPS诱导的骨破坏，改善了骨参数并减少了破骨细胞数量。这些结果表明，LY900009通过调控Notch/MAPK/Akt信号轴，有效抑制破骨细胞生成和骨吸收，具有成为溶骨性疾病治疗药物的潜力。

引言

骨稳态是脊椎动物体内一种高度协调的生理范式，由成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞驱动的骨吸收之间的精细平衡所调控1。这种复杂的平衡在整个生命周期中维持着骨骼的完整性、生物力学韧性及代谢准确性，并动态响应机械负荷、内分泌变化以及病理挑战2。骨重建循环包括激活、吸收、转换、形成和终止等相继阶段，每个阶段均由复杂的分子级联反应调控，以确保细胞活动在时间和空间上的同步3。

这一稳态机制的破坏，尤其是破骨细胞活性过度或成骨细胞功能不足，会引发病理性骨丢失，这是多种溶骨性疾病的典型特征4,5。这些疾病涵盖广泛的病理类型，包括绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症、类风湿关节炎、炎症性关节炎、肿瘤性骨侵犯、佩吉特病（Paget's disease）以及牙周疾病6。过度骨吸收的临床表现包括骨折风险升高、骨骼畸形、慢性疼痛、功能障碍以及巨大的医疗负担6,7。当前流行病学数据显示，仅骨质疏松症就影响全球超过2亿人，相关骨折导致显著的发病率、死亡率以及每年超过数百亿美元的经济成本7,8。

破骨细胞是一种高度特化的多核巨细胞，起源于单核吞噬细胞谱系的造血前体细胞，特别是骨髓来源的巨噬细胞9。其形成是一个复杂的多步骤过程，需要细胞外信号、细胞内信号级联反应以及转录程序的精确协调10。调控破骨细胞生成的关键细胞因子包括核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），它们分别与受体RANK和c-Fms结合，启动分化程序11。RANKL与RANK的相互作用可激活多种下游信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、核因子κB（NF-κB）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）以及钙/钙调磷酸酶通路，这些通路最终汇聚于活化T细胞核因子胞浆1（NFATc1），后者是破骨细胞生成的主要转录调控因子10,11,12。

在调控破骨细胞生物学的各种机制中，Notch信号通路作为一种具有复杂性和依赖于特定环境功能的关键调节因子逐渐受到关注13。Notch通路是一种进化上保守的细胞间通讯系统，参与调控多种组织和发育阶段中的细胞命运决定、分化、增殖以及凋亡14。在哺乳动物中，四种Notch受体（Notch1-4）与五种经典配体（Delta样蛋白1、3、4以及Jagged 1和2）相互作用，介导细胞间的信号传递。该通路的激活包括配体结合、构象变化，并由ADAM金属蛋白酶和γ-分泌酶复合物依次进行蛋白水解切割，最终释放Notch胞内结构域（NICD），使其转入细胞核并调控靶基因的转录，其中包括Hes和Hey基因家族14,15。Notch信号在破骨细胞生成中的作用仍存在争议，且表现出高度的环境依赖性；不同研究报道其既可发挥促进作用，也可产生抑制作用，具体效应取决于特定的受体亚型、配体可用性、细胞微环境及实验条件16,17,18。

目前针对溶骨性疾病的治疗策略主要集中于抗骨吸收，包括双膦酸盐、地诺单抗（RANKL抑制剂）、选择性雌激素受体调节剂和降钙素7,8,19。尽管这些治疗方法可有效减少骨吸收和骨折风险，但仍存在显著局限性，如胃肠道毒性、颌骨骨坏死、非典型骨折、感染风险增加以及对长期安全性的担忧。此外，这些药物可能过度抑制骨转换，从而潜在地损害骨质量和骨修复机制。因此，临床上迫切需要开发新型治疗药物，能够在选择性抑制病理性破骨细胞活性的同时，最大限度减少不良反应，并保留生理性骨重建能力8,14。

γ-分泌酶抑制剂是一类具有前景的化合物，可通过调控Notch信号通路在溶骨性疾病中发挥潜在应用作用14,20这些药物在肿瘤学和神经退行性疾病研究中已被广泛研究，其中多个化合物已进入针对阿尔茨海默病及多种癌症的临床试验。LY900009 是一种高效且选择性的 γ-分泌酶抑制剂，在初步研究中表现出良好的药理学特性，包括高特异性、生物利用度以及可控的安全性特征。21,22然而，LY900009 对 RANKL 诱导的破骨细胞生成的具体作用及其在溶骨性疾病中的潜在治疗价值仍缺乏充分表征。本研究旨在评估 LY900009 是否可通过干扰 Notch 信号通路抑制破骨细胞生成，从而为溶骨性疾病提供一种新的治疗策略。我们建立了全面的实验方案，以评估其对破骨细胞形成、骨吸收活性及信号通路的影响。 体内 在炎症性骨丢失模型中的疗效。

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方案

所有动物实验均按照机构指南进行，并经山东第一医科大学附属中心医院动物护理与使用委员会批准（批准号：IACUC-2024-015）。本研究遵循既定的动物研究伦理原则及ARRIVE指南，包括将动物饲养于标准笼具中（每笼5只小鼠，12小时明/暗循环， 随意摄取 食物/水）及随机分组

1. 骨髓来源巨噬细胞的分离与培养

  1. 将5周龄雄性C57BL/6小鼠（每批次分离使用n=5只）置于CO2吸入装置中，以每分钟30%腔室体积的流速持续5分钟实施安乐死。通过颈椎脱位确认动物死亡。
  2. 用70%乙醇喷洒小鼠体表。使用无菌剪刀从耻骨至胸骨沿中线剪开皮肤和腹壁。无菌条件下取出股骨和胫骨，并将其置于含冰预冷的无菌PBS中。
  3. 用无菌纱布清除骨骼表面的软组织。使用无菌剪刀剪去骨两端。每只小鼠使用25G针头以10 mL冷α-MEM冲洗骨髓腔。将细胞悬液通过70 µm细胞筛网过滤。
  4. 在4 °C条件下以300 x g离心5分钟。将沉淀重悬于含10%胎牛血清（FBS）和33.3 ng/mL M-CSF的α-MEM培养基中。使用血细胞计数板结合台盼蓝染色排除法计数细胞。以2 x 106 个细胞/mL的密度接种于T75培养瓶中。
  5. 将细胞培养物置于37 °C、5% CO2的恒温培养箱中培养，每48小时更换一次培养基。
  6. 收集1 x 106个细胞，用含2% FBS的PBS洗涤一次。在避光条件下，于4 °C用抗CD11b-FITC抗体（1:100）和抗F4/80-PE抗体（1:100）共同孵育30分钟。通过流式细胞术分析，采用以下设门策略：首先，根据前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）设门，排除碎片并选择活细胞；其次，在活细胞群体中圈选CD11b阳性细胞；第三，在CD11b阳性细胞中进一步圈选F4/80阳性细胞，以鉴定CD11b+/F4/80+双阳性巨噬细胞。设门依据未染色对照及单色对照进行。仅当>95%的细胞为CD11b+/F4/80+时，方可继续后续实验。

2. 细胞毒性评估

  1. 将骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）以每孔 1 × 104 个细胞的密度接种于 96 孔板中，每孔加入 100 µL 培养基，在 37 °C 下孵育 4 小时，使细胞贴壁。
  2. 用完全培养基配制 LY900009 的系列稀释液：0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 µM。吸除旧培养基，每孔加入 100 µL 处理用培养基，每个浓度设三个复孔。
  3. 分别孵育 24 小时、48 小时或 96 小时后，完全移除培养基，每孔加入含 10% CCK-8 试剂的新鲜培养基 100 µL（即 10 µL CCK-8 加入 90 µL 培养基中）。在 37 °C 下准确孵育 2 小时，使用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度，参考波长为 650 nm。
  4. 使用 GraphPad Prism 计算 IC50 值。打开软件，输入浓度（X 轴）和细胞活力百分比（Y 轴），选择 分析 > 非线性回归 > 剂量-反应 > 抑制 > log(抑制剂) 与反应关系（可变斜率）。设定约束条件：Bottom=0，Top=100。记录 IC50 值及其 95% 置信区间。

3. 破骨细胞分化及TRAP染色

  1. 将骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）以每孔 1 × 104 个细胞的密度接种于 96 孔板中。在含 10% 胎牛血清（FBS）和 33.3 ng/mL M-CSF 的 α-MEM 培养基中培养过夜。
  2. 更换为 100 µL 分化培养基：含 10% FBS、33.3 ng/mL M-CSF、100 ng/mL RANKL 和 LY900009（0、100、200、400 nM）的 α-MEM。每种条件设置四个复孔。
  3. 每 48 小时更换一次新鲜分化培养基，持续培养 6 天。每天在倒置显微镜下以 100 倍放大倍数观察破骨细胞的形成情况。
  4. 用移液器吸除全部培养基，加入 200 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。每孔加入 100 µL 含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，室温精确孵育 15 分钟。吸除固定液后，用 200 µL PBS 洗涤 3 次。
  5. 配制 TRAP 染色液：将 50 mL 0.1 M 醋酸钠缓冲液（pH 5.0）、10 mL 50 mM 酒石酸钠、1 mL 二甲基甲酰胺中溶解的 5 mg/mL 萘酚 AS-MX 磷酸盐溶液和 0.5 mL 11 mg/mL 快红紫 LB 盐溶液混合均匀。用 0.22 µm 滤膜过滤，每孔加入 200 µL 染色液，37 °C 避光孵育 30 分钟。用蒸馏水洗涤 3 次以终止反应。
  6. 将含有三个或以上细胞核的 TRAP 阳性细胞（呈紫色/红色）认定为破骨细胞。在倒置显微镜下以 100 倍放大倍数进行计数，每孔随机拍摄五个视野的照片。
  7. 使用 ImageJ 进行定量分析。依次点击 图像 > 转换为 8 位（Image > Type > 8-bit） > 设置阈值（Image > Adjust > Threshold） > 选择 TRAP 阳性区域 > 分析颗粒（Analyze > Analyze Particles：面积 100-Infinity µm2，圆度 0-1.0） > 将结果导出至 Excel 23。

4. 功能性骨吸收实验

  1. 将BMMs以每孔2 × 105 个细胞的密度接种于六孔板中，加入M-CSF培养24小时。随后加入RANKL（100 ng/mL）诱导前体破骨细胞形成，持续培养3天。
  2. 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C下消化5分钟收集细胞，用完全培养基中和。用台盼蓝计数法测定活细胞数量。
  3. 将1 × 104 个前体破骨细胞接种至羟基磷灰石包被的96孔板中，每孔接种一个样本，静置4小时使其贴壁。
  4. 加入M-CSF（33.3 ng/mL）、RANKL（100 ng/mL）以及LY900009（0、100、200、400 nM）处理4天，每2天更换一次培养基。
  5. 使用10%次氯酸钠溶液处理10分钟以去除细胞，用蒸馏水洗涤5次，然后完全空气干燥。
  6. 使用自动成像仪在4倍放大倍数下观察吸收陷窝，采集整个孔的图像区域。利用ImageJ软件将吸收区域占总面积的百分比进行定量分析。

5. 免疫荧光显微镜

  1. 按照步骤3所述，在24孔板中的玻璃盖玻片上培养破骨细胞5-7天。
  2. 用4%多聚甲醛固定15分钟，用含0.1% Triton X-100的PBS溶液透化处理10分钟，再用含1% BSA的PBS溶液在室温下封闭1小时。
  3. 在避光条件下，用封闭缓冲液稀释的罗丹明-鬼笔环肽（1:200）室温孵育45分钟，再用DAPI（1 µg/mL）复染细胞核10分钟。
  4. 用抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封片，于荧光显微镜下以200倍放大倍数观察，并使用ImageJ软件测量肌动蛋白环面积。

6. 定量实时 PCR 分析

  1. 使用RNA提取试剂从2 × 106个细胞中提取总RNA。通过移液器充分吹打使样品均质化。室温孵育5分钟。
  2. 加入200 µL氯仿，剧烈振荡15秒。孵育3分钟。在4 °C下以12,000 × g离心15分钟。
  3. 将水相转移至新离心管中。加入500 µL异丙醇，轻轻混匀。室温孵育10分钟。在4 °C下以12,000 × g离心10分钟。
  4. 用1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，室温晾干10分钟。加入30 µL无RNase的水溶解RNA。使用分光光度计测定浓度（要求A260/A280比值>1.8）。
  5. 按照逆转录试剂盒的制造商说明书，使用1 µg RNA合成cDNA。
  6. 配制qPCR反应体系：10 µL预混液（Master Mix），1 µL cDNA，每种引物（10 µM）各0.5 µL，8 µL水。在实时荧光定量PCR系统上运行程序：95 °C预变性10分钟，随后进行40个循环（95 °C变性15秒，60 °C退火延伸60秒）。以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

7. 蛋白质印迹分析

  1. 在冰上用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解缓冲液裂解细胞，孵育 30 分钟。4 °C 条件下以 14,000 × g 离心 15 分钟。
  2. 根据制造商说明书，使用 BCA 法测定蛋白浓度。将 30 µg 蛋白样品加入上样缓冲液中，煮沸 5 分钟。
  3. 将样品上样至 10% SDS-PAGE 凝胶，先以 80 V 电泳 30 分钟，再以 120 V 电泳 90 分钟。在低温转膜缓冲液中以 100 V 转膜 90 分钟至 PVDF 膜。
  4. 用含 0.1% Tween-20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）配制的 5% 脱脂牛奶室温封闭膜 1 小时，轻摇孵育。
  5. 按照 材料表 中列出的一抗（1:1000 稀释）在 4 °C 轻摇孵育过夜。用 TBST 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
  6. 加入 HRP 标记的二抗（1:5000 稀释），室温孵育 1 小时。用 TBST 洗涤 3 次。
  7. 根据制造商说明书使用 ECL 显色试剂检测，采用红外成像系统采集图像，并使用 ImageJ 软件定量分析条带强度。

8. 体内 LPS诱导的骨吸收模型

  1. 使用 G*Power 3.1 计算样本量（效应量=0.8，α=0.05，检验效能=0.80，得出每组样本量 n=5）。采用随机数字生成器将7至8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分配至各组。每笼饲养5只小鼠，维持12小时光照/12小时黑暗循环，温度22 ± 2 °C，相对湿度55% ± 10%。 随意摄取 可自由获取标准饲料和水。
  2. 使用戊巴比妥钠（50 mg/kg）经腹腔注射麻醉小鼠，通过脚趾夹捏反射确认麻醉效果。
  3. 制备对照溶剂：含1% DMSO的PBS。制备LY900009：低剂量（2.5 mg/kg）和高剂量（5 mg/kg），溶于对照溶剂中。使用27G针头，每日皮下注射100 µL至颅骨区域，持续14天。在第1天和第8天注射LPS（10 mg/kg）。
  4. 每天两次监测小鼠是否有痛苦迹象。设定人道终点标准：体重减轻 >20%的体重下降、无法行走、蜷缩姿势、理毛行为减少。若达到上述终点，应立即实施安乐死。
  5. 第15天使用戊巴比妥过量（100 mg/kg，腹腔注射）实施安乐死。取下颅盖骨，在4 °C条件下用4%多聚甲醛固定48小时。

9. 微型计算机断层扫描（Micro-CT）与组织学分析

  1. 使用以下参数通过显微CT扫描仪扫描固定的颅盖骨：70 kV，114 µA，0.5 mm铝滤膜，9 µm分辨率，180°旋转，步长0.4°。
  2. 使用NRecon软件重建图像，采用CTAn软件进行分析。将感兴趣区域定义为以矢状缝为中心的3 × 3 mm区域，计算骨密度（BMD）、骨体积/组织体积（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）。
  3. 将样本在10% EDTA（pH 7.4）中脱钙14天，每日更换溶液。使用草酸钙检测法测试脱钙是否完全24。
  4. 进行石蜡包埋处理：梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡浸润。使用切片机切取厚度为4 µm的切片。
  5. 确保盲法：使用随机三位数字对所有样本进行编码，由同事保管编码表。所有分析均在不知晓处理分组的情况下进行，仅在数据采集完成后解码。
  6. 进行H&E染色：脱蜡、水化，苏木精染色5分钟，酸性酒精分化，伊红染色2分钟，脱水并封片。
  7. 按照步骤3.5进行TRAP染色。沿骨表面计数TRAP阳性多核细胞，结果以每毫米骨周长的细胞数表示。

10. 统计分析

  1. 使用 G*Power 3.1 计算所需的样本量：输入效应量 f=0.8，α=0.05，检验效能=0.80，组数。记录每组所需的最小样本量 n。
  2. 在 SPSS 28.0 中使用 Shapiro-Wilk 检验测试正态性。若 p > 0.05，则视为符合正态分布。使用 Levene 检验测试方差齐性。若 p > 0.05，则视为方差齐。
  3. 根据数据分布选择适当的检验方法：对于满足正态性和方差齐性的数据，采用参数检验。对于两组比较，使用非配对 Student t 检验；对于多组比较，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）。
  4. 进行事后分析：若方差分析结果显著（p<0.05），对所有组间两两比较采用 Tukey 真实显著性差异检验。
  5. 对于非正态分布数据，使用非参数检验方法：两组比较采用 Mann-Whitney U 检验，多组比较采用 Kruskal-Wallis 检验并结合 Dunn 事后检验。
  6. 计算效应量：t 检验使用 Cohen's d，方差分析使用偏 eta 平方（partial eta squared）。
  7. 报告精确到三位小数的 p 值及 95% 置信区间。正态分布数据以均值 ± 标准差表示，非正态分布数据以中位数（四分位距）表示。
  8. 将 p < 0.05 视为具有统计学显著性。当进行多重比较时，应用 Bonferroni 校正。

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结果

本方案的成功实施表明，LY900009 通过多种相互关联的机制，对破骨细胞的形成和功能发挥出显著的抑制作用。对骨髓来源巨噬细胞进行的初步细胞毒性评估显示，毒性随时间呈依赖性增加，在 24 h、48 h 和 96 h 的 IC50 值分别为 4.44 µM、3.66 µM 和 2.93 µM（图 1A、B）。重要的是，这些产生细胞毒性的浓度明显高于治疗有效剂量，表明其具有良好的治疗窗口。LY900009 的分子结构如 图 1C 所示。TRAP 染色分析显示，LY900009 以剂量依赖方式抑制 RANKL 诱导的破骨细胞形成，在 100 至 400 nM 浓度范围内，破骨细胞数量和大小均显著减少（图 1D–F）。利用羟基磷灰石包被表面进行的功能评估表明，骨吸收活性相应受损，吸收陷窝的形成及总吸收面积均明显下降（图 2A

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讨论

本研究提供了有力证据，表明LY900009通过强效且选择性地抑制破骨细胞生成，有望成为治疗溶骨性疾病的潜在治疗剂，这与当前γ-分泌酶抑制剂在骨相关疾病领域日益增长的研究兴趣相一致14,20,21研究结果表明，该γ-分泌酶抑制剂通过协调抑制包括Notch、MAPK、PI3K/Akt和NF-κB在内的多个关键信号通路，有效抑制RANKL诱导的破骨细胞形成及其骨吸收功能。这些结果的治疗意义不仅限于机制层面的理解，还体现在该化合物可有效预防脂多糖（LPS）诱导的骨丢失。 体内，表明其在治疗炎症性和代谢性骨病方面具有重要的临床潜力7,8,19,25在有效浓度（0.1–0.4 µM）与细胞毒性...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益或利益冲突。任何作者均与本研究中提及的商业实体无财务关系。所有作者均已填写国际医学期刊编辑委员会（ICMJE）的披露表格。

致谢

作者谨此感谢山东第一医科大学附属中心医院和肥城市人民医院的工作人员在本研究过程中提供的技术支持与帮助。我们 также感谢实验室同事在动物实验中给予的宝贵讨论和协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔细胞培养板Corning3524免疫荧光显微镜
6孔细胞培养板Corning3516细胞培养与蛋白质印迹
70% 乙醇Sigma-AldrichE7023灭菌与消毒
75% 乙醇Sigma-AldrichE7148RNA洗涤缓冲液
96孔细胞培养板Corning3596细胞培养与检测
铝滤膜（0.5 mm）BrukerN/A微型CT扫描滤波器
抗CD11b-FITC抗体BioLegend101206流式细胞术 - 巨噬细胞标记物
抗裂解Notch1抗体（兔单克隆）Cell Signaling Technology4147S蛋白质印迹 - Notch信号通路
抗F4/80-PE抗体BioLegend123108流式细胞术 - 巨噬细胞标记物
抗荧光淬灭封片剂Vector LaboratoriesH-1000荧光显微镜封片
抗Hes1抗体（兔单克隆）Cell Signaling Technology11988S蛋白质印迹 - Notch下游靶标
抗NFATc1抗体（鼠单克隆）Santa Cruz Biotechnologysc-7294蛋白质印迹 - 破骨细胞主调控因子
抗磷酸化Akt（Ser473）抗体Cell Signaling Technology4060S蛋白质印迹 - PI3K/Akt信号通路
抗磷酸化ERK1/2（Thr202/Tyr204）抗体Cell Signaling Technology4370S蛋白质印迹 - MAPK信号通路
抗磷酸化NF-κB p65（Ser536）抗体Cell Signaling Technology3033S蛋白质印迹 - NF-κB信号通路
抗磷酸化p38 MAPK（Thr180/Tyr182）抗体Cell Signaling Technology4511S蛋白质印迹 - p38 MAPK信号通路
抗-β-肌动蛋白抗体（鼠单克隆）Cell Signaling Technology4970S蛋白质印迹上样对照
自动成像读取仪Molecular DevicesImageXpress Micro骨吸收陷窝定量分析
BCA蛋白检测试剂盒Pierce/Thermo Fisher23225蛋白浓度测定
漂白剂（10%次氯酸钠）Sigma-Aldrich425044从骨吸收板上清除细胞
BSA（牛血清白蛋白）Sigma-AldrichA7906免疫荧光封闭缓冲液
C57BL/6小鼠（雄性，5-8周龄）Charles River Laboratories27体外BMM分离与体内研究
草酸钙测试试剂Sigma-AldrichC0350脱钙完成检测
CCK-8试剂（细胞计数试剂盒-8）Dojindo Molecular TechnologiesCK04细胞活力评估
细胞筛（70 μm）BD Falcon352350骨髓细胞过滤
离心机（带制冷）Eppendorf5424R细胞与样品制备
氯仿Sigma-AldrichC2432RNA提取相分离
CO2室Euthanex CorpEX-075动物安乐死
CTAn软件Bruker版本1.20微型CT图像分析
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）Sigma-AldrichD9542细胞核复染
二甲基甲酰胺（DMF）Sigma-AldrichD4551TRAP染色溶剂
DMSO（二甲基亚砜）Sigma-AldrichD2650溶剂对照制备
ECL蛋白质印迹底物Pierce/Thermo Fisher32106蛋白质印迹中的蛋白检测
EDTA（10%，pH 7.4）Sigma-AldrichE6758脱钙溶液
伊红YSigma-AldrichE4009H&E组织学染色
快红紫红LB盐Sigma-AldrichF3381TRAP染色显色剂
胎牛血清（FBS）Gibco/Thermo Fisher16140-071细胞培养补充物
流式细胞仪BD BiosciencesFACSCaliburBMM表征
荧光显微镜OlympusIX73免疫荧光成像
G*Power软件海因里希·海涅大学版本3.1统计功效分析
玻璃盖玻片（22 × 22 mm）Fisher Scientific12-541-B免疫荧光显微镜
GraphPad PrismGraphPad Software版本9.0IC50计算与作图
苏木精Sigma-AldrichH3136H&E组织学染色
血细胞计数板Hausser Scientific3200细胞计数
高容量cDNA反转录试剂盒Applied Biosystems4368814从RNA合成cDNA
HRP标记抗小鼠IgGCell Signaling Technology7076S蛋白质印迹二抗
HRP标记抗兔IgGCell Signaling Technology7074S蛋白质印迹二抗
羟基磷灰石包被96孔板Corning BioCoat354651骨吸收功能检测
ImageJ美国国立卫生研究院（NIH）版本1.53e图像分析与定量
培养箱（CO2）Thermo Fisher51033058细胞培养维持
红外成像系统Bio-RadChemiDoc MP蛋白质印迹检测
倒置显微镜OlympusCKX41细胞培养监测、TRAP计数
异丙醇Sigma-AldrichI9516RNA沉淀
LPS（来自大肠杆菌的脂多糖）Sigma-AldrichL4391体内炎症性骨吸收
LY900009（γ-分泌酶抑制剂）Selleck ChemicalsS7999测试化合物 - 破骨细胞抑制剂
M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）R&D Systems416-ML-010巨噬细胞存活与破骨细胞分化
微型CT扫描仪BrukerSkyScan 1272骨微结构分析
微孔板读取仪BioTekSynergy H1吸光度测量（CCK-8）
切片机LeicaRM2255组织切片
萘酚AS-MX磷酸盐Sigma-AldrichN5000TRAP染色底物
针头（25G，27G）BD305122, 305109骨髓冲洗、注射
NRecon软件Bruker版本1.7微型CT图像重建
石蜡Sigma-AldrichP3683组织包埋
多聚甲醛（4%）Sigma-AldrichP6148细胞与组织固定
PBS（磷酸盐缓冲盐水）Gibco/Thermo Fisher14190-144细胞洗涤与缓冲液制备
戊巴比妥钠Sigma-AldrichP3761动物麻醉与安乐死
磷酸酶抑制剂混合物Roche4906837001磷酸化状态保护
PowerUp SYBR Green Master MixApplied BiosystemsA25742定量实时PCR
蛋白酶抑制剂混合物Roche11697498001防止蛋白质降解
PVDF膜（0.45 μm）Bio-Rad1620177蛋白质印迹蛋白转膜
RANKL（NF-κB受体活化因子配体）R&D Systems462-TEC-010诱导破骨细胞分化
实时PCR系统Applied Biosystems7500 Fast定量基因表达分析
罗丹明-鬼笔环肽Invitrogen/Thermo FisherR415F-肌动蛋白可视化
RIPA缓冲液Cell Signaling Technology9806S蛋白提取
无RNase水Ambion/Thermo FisherAM9937RNA溶解与PCR
SDS-PAGE凝胶（10%）Bio-Rad4561036蛋白质印迹蛋白分离
脱脂奶粉Bio-Rad1706404蛋白质印迹封闭
醋酸钠缓冲液（0.1 M，pH 5.0）Sigma-AldrichS2889TRAP染色缓冲液
酒石酸钠（50 mM）Sigma-AldrichS4297TRAP染色特异性
分光光度计Thermo FisherNanoDrop 2000RNA/蛋白浓度测定
SPSSIBM Corporation版本28.0统计分析
注射器（1 mL，10 mL）BD309659, 309604骨髓冲洗、注射
T75细胞培养瓶Corning430641原代BMM培养
TBST（含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水）Bio-Rad1706531蛋白质印迹洗涤缓冲液
转膜缓冲液Bio-Rad1704270蛋白质印迹蛋白转膜
吐温X-100Sigma-AldrichT8787细胞通透化
TRIzol试剂Invitrogen/Thermo Fisher15596026总RNA提取
台盼蓝（0.4%）Sigma-AldrichT8154细胞活力评估
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）Gibco/Thermo Fisher25200-056细胞收获与解离
蛋白质印迹转膜系统Bio-RadTrans-Blot Turbo蛋白转移至膜上
二甲苯Sigma-AldrichX3750组织处理与透明化
α-MEM（α-最低必需培养基）Gibco/Thermo Fisher12561-056细胞培养基

参考文献

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