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研究文章

大鼠急性力竭运动导致肌腱-骨连接处微损伤：超微结构改变及机制

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DOI：

10.3791/69184

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2025年11月14日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation, Sichuan college of traditional Chinese medicine, 2Department of Rehabilitation, Mian-yang Orthopedic hospital, 3Sports Medicine Center, West China Hospital, Sichuan University, 4Department of Orthopedics and Orthopedic Research Institute, West China Hospital, 5Department of Geriatric Medicine, Mian-yang hospital of traditional Chinese medicine, 6Department of Rehabilitation Medicine, Sichuan Provincial Orthopedic Hospital

本文内容

摘要

本研究旨在探讨急性力竭性运动导致的肌腱-骨连接处超微结构变化及其作用机制。急性力竭性运动可在肌腱-骨连接处诱发微损伤，并短暂激活内质网应激及其介导的凋亡信号通路。然而，这些微损伤和内质网应激在运动后可逐渐恢复。

摘要

运动引起的肌腱-骨连接处（附着点）微损伤可能导致肌腱病。研究急性力竭性运动后附着点内部的超微结构变化及其机制，有助于加深对肌腱病的理解，并为临床治疗提供指导。本研究将36只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为两组：对照组和力竭性运动组。力竭性运动组根据运动后时间进一步细分为五个亚组：0 h、6 h、12 h、24 h和48 h。采用苏木精-伊红染色和电子显微镜技术观察跟腱-骨连接处的组织变化。通过免疫组织化学（IHC）方法定量检测附着点处内质网应激（ERS）相关蛋白GRP78、CHOP和Caspase-12的表达水平。急性力竭性运动后，进行力竭运动的大鼠肌腱-骨连接处出现显著的结构改变。软骨细胞和胶原纤维表现出明显的超微结构变化，提示存在内质网应激。ERS相关蛋白水平在运动后立即升高，并在6 h达到峰值；随后在12 h开始下降，至48 h恢复至基线水平。综上所述，急性力竭性运动可在大鼠肌腱-骨连接处诱发微损伤及内质网应激，但未导致不可逆损伤。及时治疗和修复这些微损伤可防止过度损伤及肌腱病的发生。

引言

跟腱病是一种由踝关节频繁过度使用损伤引起的常见临床病症。该疾病以肌腱肿胀、疼痛和功能障碍为特征。在老年人和运动员中更为常见，尤其是跑步者和跳跃者。跟腱病可分为非插入性跟腱病和插入性跟腱病。非插入性跟腱病影响肌腱在骨性附着点上方2至6厘米的区域，而插入性跟腱病则影响肌腱与骨骼的连接处1。此外，非插入性跟腱病多见于超重、年长且活动较少的人群，而插入性跟腱病则更倾向于发生在活动量较大的人群中1。

肌腱-骨连接处是指肌腱插入骨骼的部位，其组织结构从肌腱组织逐渐过渡到骨组织，包括未钙化的纤维软骨和钙化的纤维软骨2。这种过渡实现了由柔软且富有弹性的肌腱组织向坚硬骨组织的转变。从工程学角度来看，该区域起到锚定点的作用，传递肌肉力量以促进关节运动3,4。因此，该区域是应力集中的部位，在运动中常因过度使用而发生损伤。

临床研究主要集中在非插入性肌腱病，而对肌腱-骨连接处的插入性肌腱病关注较少2。研究表明，过度使用负荷会导致肌腱内胶原结构紊乱和断裂、脂肪组织浸润以及新生血管形成。同时还会引起未钙化和钙化纤维软骨区域的纤维软骨细胞增生、软骨内骨化以及骨赘形成5。然而，近期研究提示，在插入性肌腱病中，肌肉收缩模式可能比运动量具有更重要的作用6,7。因此，需要进一步研究以明确过度使用对肌腱-骨连接处的影响。以往研究已探讨了长期跳跃或跑步等过度使用行为对这些连接处的作用，但极少研究关注急性力竭性运动的影响。最近一项研究表明，急性运动可诱导大鼠肾脏内质网应激，表现为IL-6信号通路和热休克蛋白（HSPs）上调，以及线粒体呼吸链复合物mRNA水平下降8。然而，此类变化是否在肌腱-骨连接处发生尚无报道。本研究聚焦于肌腱-骨连接（附着点），旨在阐明急性力竭性运动所诱导的变化及其潜在机制。研究结果有望为插入性肌腱病的预防策略提供理论依据。

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方案

所有动物实验均按照四川中医药高等专科学校科学技术部门制定的实验动物伦理标准进行（批准号：2023DS01）。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 实验设计与操作步骤

  1. 动物
    三十六只12周龄雄性CD-Sprague-Dawley大鼠被饲养并提供 随意摄取 在整个实验期间持续喂养。环境温度维持在20-25 °C，相对湿度保持在50%-60%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。
  2. 组设计
    经过一周的适应性喂养后，将大鼠随机分为对照组（Con，n = 6）和力竭运动组（EE，n = 30）。EE组大鼠在坡度为10度的跑台上以10 m/min的速度进行为期三天、每天15分钟的适应性训练。完成适应性训练后，EE组进一步分为五个时间亚组：力竭运动后0 h、6 h、12 h、24 h和48 h。
  3. 干预步骤
    对照组大鼠不进行运动，而丰富环境组大鼠在坡度为10度的跑步机上进行 exhaustive running（力竭性跑）图1A）。遵循 Bedford 方案9，运动负荷分为三个等级：第一级为10 m/min，持续15分钟；第二级为15 m/min，持续15分钟；第三级为20 m/min，直至力竭（图1B力竭的判定标准为：大鼠无法继续奔跑，并在不到1分钟的时间内连续三次停留在跑台上。10尽管反复给予低强度电刺激（150 V，0.5 mA 交流电）和声音刺激（70 dB）。

大鼠被处死 通过 在规定时间点（力竭运动后0 h、6 h、12 h、24 h和48 h）经腹腔注射过量3%戊巴比妥钠（200 mg/kg）。仔细分离跟骨处的皮肤及皮下组织，使用眼科剪在距跟骨上方2 cm处切断跟腱。右侧跟骨（包含附着的跟腱）保存于4%多聚甲醛中，用于组织病理学检查和免疫组织化学检测。此外，左侧随机选取三个样本，置于2%多聚甲醛-2.5%戊二醛溶液中固定，用于透射电子显微镜观察超微结构变化。 图1C).

2. 肌腱-骨连接处组织学

样本用4%多聚甲醛固定48小时，随后在室温（20–25 °C）下用15% EDTA脱钙4周，每天更换溶液。当骨组织可被针头无阻力轻松刺穿时，表明脱钙过程完成。脱钙后，样本经梯度乙醇和二甲苯进行自动化脱水处理，随后用PBS洗涤三次。样本以矢状面方向包埋于石蜡中，并切成5 µm厚的切片。按照标准流程进行苏木精-伊红染色，并使用Panthera数字三目显微摄像系统在20×和40×放大倍数下采集图像。

3. 电子显微镜扫描

左侧样本用2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定48小时，随后经一系列丙酮溶液脱水，用环氧树脂包埋剂渗透并进行矢状面包埋。半薄切片采用亚甲蓝染色以确定肌腱-骨连接区域。超薄切片厚度约为60–90 nm，使用金刚石刀切片。切片先用醋酸铀染色10–15分钟，再用柠檬酸铅染色1–2分钟。切片在透射电子显微镜下观察，放大倍数分别为6000×、12000×和25000×。

4. 免疫组织化学检测

肌腱-骨连接组织按先前所述方法进行常规脱钙和切片。切片经柠檬酸盐缓冲液抗原修复溶液中孵育10分钟后，使用3% H2O2处理10分钟以阻断内源性过氧化物酶活性，随后在25 °C下用正常山羊血清封闭20分钟。切片于4 °C下与一抗（包括GRP78（1:100）、CHOP（1:100）和Caspase-12（1:100））孵育过夜。随后，样本在25 °C下与二抗孵育2小时。在25 °C下使用DAB显色8分钟，产生棕黄色阳性信号。细胞核用苏木精复染3分钟。采用Image-Pro Plus 6.0软件分析平均密度。选取肌腱-骨连接区域的三个感兴趣区域（肌腱、纤维软骨和矿化纤维软游戏副本）进行分析，并计算其平均值。

5. 统计分析

使用 GraphPad Prism 8 对数据进行分析并生成图表。所有数据均以均值 ± 标准差表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对不同组之间进行比较，组间两两比较则使用最小显著差异（Least Significant Difference, LSD）检验。P 值 < 0.05 被认为具有统计学意义。

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结果

如图2A所示，在对照组中，肌腱-骨连接处的软骨细胞和胶原纤维细胞排列规则，纤维软骨与矿化纤维软骨之间存在一条平滑的蓝色分界线，称为潮线（黄色箭头）。在力竭运动组中，肌腱-骨连接处发生了超微结构改变，表现为软骨细胞增多（绿色圆圈）、胶原纤维变薄和断裂（蓝色箭头），以及潮线的形态改变，呈现为抬高或不规则的蓝色线条，形似“火焰”或闭合环状结构（红色箭头）。这些变化在运动后0 h和6 h最为明显（图2B、C）。然而，在恢复期（运动后12 h、24 h和48 h）这些超微结构改变逐渐恢复（图2D-F）。

如图所示 图3A 和 ...

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讨论

肌腱-骨连接处，也称为附着点或附着部位，允许肌腱插入骨骼，是韧带和肌腱附着于骨骼时应力集中的部位4。作为锚定点，它促进踝关节运动，将小腿肌肉收缩产生的力传递至足部的韧带和肌腱，并参与踝关节和足部的运动2。肌腱-骨连接处由四个连续区域组成：肌腱、纤维软骨、矿化纤维软骨和骨骼2,3。在纤维软骨向矿化纤维软骨过渡的区域，存在一条被称为潮线（tidemark）的蓝色线条4,11,12,13。过度使用损伤、反复的机械刺激以及累积性微损伤可损害肌腱-骨连接处，导致附着点病（enthesopathies）。在附着点病中，潮线明显上移，变得隆起且不规则；肌腱纤维发生扭曲，软骨细胞积聚，细胞...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此衷心感谢自然科学基金（项目编号：23ZRYB03）、研究与创新团队项目（TD-2022-04）、四川中医药高等专科学校临床医学科教创新团队，以及四川省中医药管理局资助的2025年研究项目（25MSZX329）所提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2% 多聚甲醛-2.5% 戊二醛溶液中国MKBioMM1515 电子显微镜扫描
抗Caspase-12抗体杭州华安生物技术有限公司HA500144免疫组织化学检测
抗CHOP抗体杭州华安生物技术有限公司ET1703-05免疫组织化学检测
抗GRP78抗体杭州华安生物技术有限公司ER1706-50免疫组织化学检测
生物显微镜检查Motic Industrial Group Co., Ltd. 中国BA210Digital用于肌腱-骨连接组织学的生物显微镜检查 免疫组织化学检测
CD-斯普拉-道利大鼠北京维通利华实验动物技术有限公司SCXK2021-0007 CD
柠檬酸缓冲液抗原修复溶液中杉金桥-生物，中国ZLI-9065 免疫组织化学检测
DAB  中杉金桥-生物，中国ZLI-9018 免疫组织化学检测
EDTA国药集团化学试剂有限公司10009717苏木精-伊红染色 
Epox 812国药集团化学试剂有限公司XW00000020电子显微镜扫描
乙醇 国药集团化学试剂有限公司10009218苏木精-伊红染色 
GraphPad Prism 8 GraphPad Software, Inc. GraphPad Prism 8 统计分析
H2O2 国药集团化学试剂有限公司011092708免疫组织化学检测
Image-Pro Plus 6.0Media Cybernetics Co., Ltd. USAImage-Pro Plus 6.0免疫组织化学检测
多聚甲醛 国药集团化学试剂有限公司20230408苏木精-伊红染色  免疫组织化学检测
PBS中杉金桥-生物，中国ZLI-9062电子显微镜扫描
透射电子显微镜日本电子光学实验室有限公司JEM-1400Flash，日本电子显微镜扫描
大鼠跑步机 &和小鼠BioMed Easy Technologies Co., Ltd  中国SA101在跑步机上进行力竭性运动
二甲苯国药集团化学试剂有限公司10023418苏木精-伊红染色 

参考文献

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