Shrinky-Dink悬滴法：一种简单形成与培养类胚体的方法

摘要

我们展示了一种简单且快速的方法，可将预定义数量的细胞加载到微加工孔中，并维持其进行胚状体发育。

摘要

类胚体（EB）是胚胎干细胞的聚集体。生成这些聚集体最常用的方法是悬滴法，即通过移液将任意数量的细胞滴加到孔板中，该方法操作繁琐。将干细胞强制性地置于紧密相邻的位置，可促进类胚体的形成。由于每个孔中的培养基都需每天手动更换，因此该方法需要大量人工操作。

此外，由于环境参数（包括细胞-细胞相互作用、细胞-可溶性因子相互作用、pH值和氧气供应）可能受类胚体（EB）大小的影响，即使在相同培养条件下，传统悬滴法获得的细胞群体也可能存在显著差异。近期研究确实表明，形成聚集体的初始细胞数量对干细胞分化具有重要影响。我们开发了一种简单、快速且可放大的培养方法，可将预定义数量的细胞加载至微加工微孔中，并维持其进行类胚体发育。最后，这些细胞易于获取，可用于进一步分析和实验。该方法适用于任何实验室，且无需专用设备。我们通过使用一种红色荧光小鼠细胞系（129S6B6-F1）生成类胚体来演示此方法。

方案

1. 制作 Shrinky-Dink 模具

1. 使用高分辨率打印机将所需图案打印在缩水片（shrinky-dink sheet）上。
2. 在 163°C 下烘烤缩水片约 10 分钟，或直至其完全收缩并形成规则形状。
3. 待缩水模具冷却后，将其浸入异丙醇浴中，直至整个表面刚好被覆盖。
4. 小心地向模具表面喷洒少量丙酮，并轻轻摇晃容器数次。加入更多异丙醇以洗去多余的丙酮，并重复此步骤数次，直至缩水模具表面看起来洁净。
5. 将模具浸入蒸馏水中 10 分钟，以去除任何残留的有机溶剂。
6. 用空气吹干缩水模具。再于 163°C 下加热约 5 分钟，以固化油墨并蒸发任何残留溶剂。

2. 制备PDMS微孔

1. 制备10:1的PDMS/固化剂混合物，并剧烈搅拌几分钟。
2. 将Shrinky-Dink模具放入一个小培养皿中。倒入PDMS混合物，使其覆盖模具表面约1/2 cm。
3. 将培养皿置于真空钟罩下，以去除PDMS混合物中的所有气泡。
4. 将培养皿放入70°C烘箱中，过夜固化。
5. 将固化的PDMS从模具上剥离，并通过施加压力将其键合到玻璃载玻片上。
6. 弃去第一个微孔芯片，因其PDMS之间残留有油墨。
7. 重复此步骤制备第二个芯片，确保无油墨残留且形状更清晰。
8. 使用70%乙醇溶液清洗微孔芯片。将其置于紫外光源下照射10分钟以灭菌。

3. 在微孔中捕获细胞

1. 计数细胞，并用培养基将其稀释至所需浓度（根据希望每孔中初始细胞数量而定）。例如，若希望每孔约有10–15个细胞（平均值 = 11，标准差 = 5.4，上样率 = 93%），我们使用了8×10⁴ 个细胞/mL的浓度。当细胞浓度为17×10⁴ 个细胞/mL时，可稳定获得每孔25–35个细胞（平均值 = 27.17857，标准差 = 7.7，上样率 = 100%）。
2. 小心将微孔芯片放入含有固化PDMS基底的50 mL离心管中。
3. 加入约2JDP mL细胞悬液。
4. 在4°C条件下，以760 rpm离心5分钟。
5. 用移液器吸除多余液体，并用1× PBS溶液小心清洗微孔芯片。
6. 将微孔芯片转移至小型培养皿中，从离心管中取出芯片时需格外小心。
7. 使用1× PBS溶液洗去多余的细胞。
8. 将微孔芯片置于倒置显微镜下，以确认每孔中的细胞数量是否符合预期。
9. 将含有细胞的微孔芯片置于标准条件下孵育。
   
   

4. 细胞孵育

1. 按照实验室常规 EB 方案操作。
2. 从培养 chamber 的侧边缓慢更换培养基；避免扰动微孔中的细胞。

讨论

我们开发了一种简单、快速且可扩展的培养方法，可将预定义数量的细胞加载到微加工孔（由Shrinky-Dinks材料模制而成）中，并维持其进行类胚体发育。最终，这些细胞可方便地用于后续分析和实验。该方法适用于任何实验室，且无需专用设备，因为我们避免了对光刻技术的需求。我们可调节微孔的尺寸以及每孔细胞的浓度，从而改变类胚体的数量和大小。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料名称	类型	公司	目录编号
Shrink-Dink 薄膜	材料	K&B Innovations	D300-10A
PDMS	材料	Dow Corning	Sylgard 184
丙酮	试剂	Fisher Scientific	A16P-4
乙醇	试剂	Fisher Scientific	A405P-4
PBS	试剂	Sigma	P4417
BMP-4	试剂	R and D Systems	314-BP-010
Knock-Out DMEM（KO DMEM）	试剂	Invitrogen	10829
KnockOut 血清替代物（KSR）	试剂	Invitrogen	10828
青霉素-链霉素（Penn-Strep）	试剂	Invitrogen	15070-063
L-谷氨酰胺	试剂	Invitrogen	25030-081
非必需氨基酸（NEAA）	试剂	Invitrogen	11140
β-巯基乙醇（BME）	试剂	Calbiochem	444203
白血病抑制因子（LIF）{ESGRO 106 单位}	试剂	Chemicon	ESG1106
打印机	工具	HP	Laser Jet 2420d
烘箱	工具	Yamato Scientific	DP-22
小鼠胚胎干细胞培养基（mESC 培养基，McCloskey 实验室方案）：（配制总体积：50 ml；100 ml）KO DMEM：40.8 ml；81.6 ml 15% KSR：7.5 ml；15 ml 1× 青霉素-链霉素：0.5 ml；1 ml 2 mM L-谷氨酰胺：0.5 ml；1 ml NEAA：0.5 ml；1 ml LIF：100 μl；200 μl BMP-4（10 ng/ml）：50 μl；100 μl 稀释后的 BME：50 μl；100 μl（将 35 μl 无菌过滤的 BME 加入 5 ml PBS 中，用注射器滤器再次过滤除菌。两周后弃用。溶液中最终浓度为 0.1 mM）