我们展示了一种简单且快速的方法，可将预定义数量的细胞加载到微加工孔中，并维持其进行胚状体发育。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
类胚体（EB）是胚胎干细胞的聚集体。生成这些聚集体最常用的方法是悬滴法，即通过移液将任意数量的细胞滴加到孔板中，该方法操作繁琐。将干细胞强制性地置于紧密相邻的位置，可促进类胚体的形成。由于每个孔中的培养基都需每天手动更换，因此该方法需要大量人工操作。
此外，由于环境参数（包括细胞-细胞相互作用、细胞-可溶性因子相互作用、pH值和氧气供应）可能受类胚体（EB）大小的影响，即使在相同培养条件下，传统悬滴法获得的细胞群体也可能存在显著差异。近期研究确实表明，形成聚集体的初始细胞数量对干细胞分化具有重要影响。我们开发了一种简单、快速且可放大的培养方法，可将预定义数量的细胞加载至微加工微孔中，并维持其进行类胚体发育。最后，这些细胞易于获取，可用于进一步分析和实验。该方法适用于任何实验室，且无需专用设备。我们通过使用一种红色荧光小鼠细胞系（129S6B6-F1）生成类胚体来演示此方法。
方案
1. 制作 Shrinky-Dink 模具
- 使用高分辨率打印机将所需图案打印在缩水片（shrinky-dink sheet）上。
- 在 163°C 下烘烤缩水片约 10 分钟，或直至其完全收缩并形成规则形状。
- 待缩水模具冷却后，将其浸入异丙醇浴中，直至整个表面刚好被覆盖。
- 小心地向模具表面喷洒少量丙酮，并轻轻摇晃容器数次。加入更多异丙醇以洗去多余的丙酮，并重复此步骤数次，直至缩水模具表面看起来洁净。
- 将模具浸入蒸馏水中 10 分钟，以去除任何残留的有机溶剂。
- 用空气吹干缩水模具。再于 163°C 下加热约 5 分钟，以固化油墨并蒸发任何残留溶剂。
2. 制备PDMS微孔
- 制备10:1的PDMS/固化剂混合物，并剧烈搅拌几分钟。
- 将Shrinky-Dink模具放入一个小培养皿中。倒入PDMS混合物，使其覆盖模具表面约1/2 cm。
- 将培养皿置于真空钟罩下，以去除PDMS混合物中的所有气泡。
- 将培养皿放入70°C烘箱中，过夜固化。
- 将固化的PDMS从模具上剥离，并通过施加压力将其键合到玻璃载玻片上。
- 弃去第一个微孔芯片，因其PDMS之间残留有油墨。
- 重复此步骤制备第二个芯片，确保无油墨残留且形状更清晰。
- 使用70%乙....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
我们开发了一种简单、快速且可扩展的培养方法，可将预定义数量的细胞加载到微加工孔（由Shrinky-Dinks材料模制而成）中，并维持其进行类胚体发育。最终，这些细胞可方便地用于后续分析和实验。该方法适用于任何实验室，且无需专用设备，因为我们避免了对光刻技术的需求。我们可调节微孔的尺寸以及每孔细胞的浓度，从而改变类胚体的数量和大小。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
我们感谢CIRM对本工作的支持。该细胞系由加拿大多伦多安大略省西奈山医院的Dr. Andras Nagy慷慨捐赠。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料名称 | 类型 | 公司 | 目录编号 |
| Shrink-Dink 薄膜 | 材料 | K&B Innovations | D300-10A |
| PDMS | 材料 | Dow Corning | Sylgard 184 |
| 丙酮 | 试剂 | Fisher Scientific | A16P-4 |
| 乙醇 | 试剂 | Fisher Scientific | A405P-4 |
| PBS | 试剂 | Sigma | P4417 |
| BMP-4 | 试剂 | R and D Systems | 314-BP-010 |
| Knock-Out DMEM（KO DMEM） | 试剂 | Invitrogen | 10829 |
| KnockOut 血清替代物（KSR） | 试剂 | Invitrogen | 10828 |
| 青霉素-链霉素（Penn-Strep） | 试剂 | Invitrogen | 15070-063 |
| L-谷氨酰胺 | 试剂 | Invitrogen | 25030-081 |
| 非必需氨基酸（NEAA） | 试剂 | Invitrogen | 11140 |
| β-巯基乙醇（BME） | 试剂 | Calbiochem | 444203 |
| 白血病抑制因子（LIF）{ESGRO 106 单位} | 试剂 | Chemicon | ESG1106 |
| 打印机 | 工具 | HP | Laser Jet 2420d |
| 烘箱 | 工具 | Yamato Scientific | DP-22 |
| 小鼠胚胎干细胞培养基（mESC 培养基，McCloskey 实验室方案）：（配制总体积：50 ml；100 ml）KO DMEM：40.8 ml；81.6 ml 15% KSR：7.5 ml；15 ml 1× 青霉素-链霉素：0.5 ml；1 ml 2 mM L-谷氨酰胺：0.5 ml；1 ml NEAA：0.5 ml；1 ml LIF：100 μl；200 μl BMP-4（10 ng/ml）：50 μl；100 μl 稀释后的 BME：50 μl；100 μl（将 35 μl 无菌过滤的 BME 加入 5 ml PBS 中，用注射器滤器再次过滤除菌。两周后弃用。溶液中最终浓度为 0.1 mM） | |||
参考文献
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro de....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
