用于评估承重区域骨替代材料性能的大鼠半节段性骨干骨缺损模型

摘要

本研究建立了一种大鼠股骨半节段性缺损模型，用于评估骨替代材料在无内固定或外固定条件下承受负荷时的力学性能和成骨性能。

摘要

准确评估骨替代材料的临床前性能需要建立既能支持组织再生、又能反映生理承重条件下机械挑战的模型。然而，大多数传统的动物骨缺损模型在这方面存在不足。例如，尽管颅骨缺损模型被广泛使用，但其建立于非承重区域。类似地，长骨中的钻孔或部分缺损主要关注局部愈合过程，缺乏足够的负荷传递，难以评估材料的机械支撑能力。本研究建立了一种标准化的大鼠股骨中段半节段性骨缺损模型，用于在无需固定装置的情况下，评估骨替代材料在承重环境中的力学与生物学性能。通过高速手机配合特制的圆柱形牙科钻头，在股骨外侧中段制备一个长4 mm、半径1.5 mm的半圆柱形缺损。植入两种具有不同特性的代表性材料——甲基丙烯酰化明胶（Gelatin methacryloyl, GelMA）水凝胶和3D打印聚甲基丙烯酸甲酯（3D-printed polymethyl methacrylate, 3DP-PMMA）——以验证该模型区分材料力学性能的能力。术后4周进行的放射学、组织学和免疫荧光分析显示，由于机械支撑不足，GelMA植入导致骨畸形愈合，纤维组织占主导，骨整合有限。相比之下，3DP-PMMA促进了新骨形成、骨膜连续性的恢复，以及表达Piezo型机械敏感离子通道组分1（Piezo1⁺）和表达瘦素受体（LepR⁺）细胞的募集。该模型为评估生物材料的承重能力、骨诱导性及骨整合潜力提供了一个实用且可重复的平台，可作为筛选适用于骨科应用（如长骨重建或骨折修复）候选材料的重要工具。

引言

在生理条件下，骨在维持身体结构完整性和机械功能方面起着核心作用。它支撑体重、实现运动，并保护内脏器官。当骨因创伤、肿瘤切除或感染而受损，尤其是在承重区域时，其机械连续性会被中断。这种中断常导致骨骼畸形、活动能力下降、肢体不稳、慢性疼痛，以及由严重骨折和出血引发的危及生命的问题^1,2。目前，临床上已应用骨移植材料和生物材料等骨替代物来替换严重受损的骨组织或修复大范围骨缺损。同样，植入的骨替代物若机械性能不足，可能导致植入失败，造成骨不连，甚至在缺损部位发生灾难性骨折^3,4。为了恢复骨的结构与功能，骨替代材料不仅需要促进骨再生，还必须具备足够的机械强度以承受生理载荷⁵。

在临床转化之前的一个关键步骤是，对生物材料植入后是否能够 体内，能够满足承重骨区域结构支撑所需的力学要求。尽管许多生物材料已显示出良好的应用前景 体外 或在小型非承重模型中，其向临床应用的转化常常受到缺乏可模拟的可靠临床前模型的阻碍 体内 机械条件。目前用于骨缺损研究的动物模型包括下颌骨缺损⁶，颅骨缺损⁷，钻孔 长骨缺陷⁸, 拔牙后牙槽窝⁹，等等。这些模型主要评估材料的成骨能力，并侧重于组织学或放射影像学再生终点^10,11然而，考虑到这些部位要么是非承重区域，要么受到机械保护，因此无法模拟长骨所经历的动态应力条件¹²即使机械性能是通过 体外 诸如压缩或拉伸强度检测等技术无法模拟体内环境中固有的动态载荷与宿主组织相互作用¹³.

在临床前研究中，一个主要的空白在于缺乏一种标准化且可重复的动物模型，该模型能够在承重条件下对骨替代材料进行体内力学评估。为解决这一问题，本研究建立了一种大鼠股骨中段节段性骨缺损模型。该模型可在承重区域提供稳定且可重复的缺损部位，不仅能够直接评估骨替代材料在生理载荷下的力学支撑能力，还可同时评价成骨效果。此外，该模型可应用于多种动物物种，缺损的大小和位置可根据所使用的具体动物进行调整。然而，该模型并不能完全模拟人类骨骼复杂的生物力学环境；对于仅专注于非承重性缺损、颅骨愈合或大尺寸结构植入物的研究，其他模型可能更为合适。

方案

本研究中所有动物实验均获得四川大学华西口腔医学院伦理委员会（WCHSIRB-AT-2025-342）的批准。雄性Sprague-Dawley大鼠（每只180 g）购自商业来源，并根据植入材料的不同随机分为两组（每组n = 6）。所用试剂和设备详见材料表。

1. 术前准备

1. 手术物品
   1. 参照图1A准备手术器械，图中编号标签对应的器械按以下顺序排列：弯头镊子、一次性无菌手术刀、直剪刀、骨膜剥离器、冲洗针头、特定牙科金刚砂钻头（参见图1B的放大图）、高速手机、游标卡尺、外科电机、单丝缝线（4-0）和持针器。
   2. 准备0.9%无菌生理盐水用于冲洗。
2. 灭菌与消毒
   1. 对可耐受高压灭菌的手术器械进行灭菌，包括弯头镊子、剪刀、骨膜剥离器、牙科金刚砂钻头、高速手机和持针器。
      注：器械应使用医用无纺布包裹，并用高压灭菌胶带密封，在121–134 °C条件下进行蒸汽灭菌20–25分钟。
   2. 对于热敏感器械，如游标卡尺和外科电机，应暴露于紫外线下至少30分钟以进行消毒。一次性物品，如一次性无菌手术刀、冲洗针头和缝线，应保持密封在原始无菌包装内直至使用。
   3. 确保手术环境无菌且温度可控。使用75%乙醇擦拭手术台及周围表面。使用无菌医用级无纺布覆盖手术台。
      警告：乙醇易燃；操作时应远离点火源，并储存在密闭容器中。乙醇废弃物应收集于指定的化学废液容器中，进行妥善处理。操作时应佩戴适当个人防护装备，包括手套、实验服和护目镜。
3. 麻醉
   1. 称量大鼠体重，并计算麻醉剂剂量（氯胺酮100 mg/kg，赛拉嗪10 mg/kg，腹腔注射）。
   2. 在手术前20分钟诱导麻醉（遵循机构批准的方案），并通过检测足趾夹捏无反应及翻正反射消失来确认麻醉深度。
   3. 在双眼涂抹眼用软膏，以防止手术过程中角膜干燥。

2. 手术步骤

1. 手术部位准备
   1. 将大鼠置于无菌手术台上，呈侧卧位。剃除对应股骨投影区域的股外侧皮肤毛发，先用2%碘酊消毒，再用75%乙醇脱碘（图2Ba）。
      注意：碘酊易燃且具刺激性。操作时应佩戴手套、实验服和护目镜，并在通风良好的环境中进行。使用后的擦拭材料和废液应根据机构安全规定，丢弃至指定的化学废弃物容器中。
   2. 更换为新的无菌手套，用无菌带孔洞巾覆盖手术区域，以维持无菌环境。
2. 切开手术部位
   1. 使用弯头镊子辅助固定组织，夹持肌肉，并在手术过程中轻柔固定股骨（图2Bb-h）。
   2. 用无菌手术刀片在大腿外侧做一长度为2–3 cm的纵向皮肤切口，以暴露皮下肌肉组织（图2Bb）。
   3. 辨认股直肌和股外侧肌，使用直剪刀沿可见的白色筋膜（图2Bb中黄色箭头所示）小心分离两块肌肉（图2Bc）。
   4. 定位并暴露股骨外侧面的肌肉附着点（图2Bd）。
   5. 使用一次性无菌手术刀沿肌肉附着处做纵向切口，以暴露股骨表面（图2Be）。
      注意：进行锐性分离（使用剪刀或手术刀）软组织时，应避免损伤下方的血管和神经。若对解剖结构不熟悉，建议使用尖头镊子和骨膜剥离器进行钝性分离。
   6. 使用骨膜剥离器进行钝性分离，剥离肌肉附着点，充分暴露股骨中段骨干（图2Bf）。
   7. 进一步将股骨与周围肌肉分离，并用弯头镊子夹持股骨中段（图2Bg）。
3. 半节段性骨干骨缺损模型建立
   1. 将平头圆柱形专用牙科金刚砂钻头（图1B）安装至由手术电机驱动的高速手机上，设定手术电机转速为35,000 rpm。
   2. 在直视下确定股骨中段最高点为缺损形成的解剖中心。在此处垂直向下钻孔，直至阻力突然消失，并可见缺损内出现血液渗出，提示已完全穿透皮质骨并进入髓腔（图2Bh）。
      注意：由于个体间皮质骨厚度存在差异，建议操作者熟悉股骨解剖结构，并在正式实验前进行预实验训练，以标准化该操作步骤。
   3. 以初始穿孔点为中心，施加可控的水平推拉动作扩大缺损。沿股骨长轴方向（纵向）和股骨直径方向（横向）逐步扩展，形成一个标准化的半圆柱形缺损，尺寸为长4 mm、半径1.5 mm（图2Bi，缺损形态与位置参见图2A）。
      注意：确定中心点后，可使用游标卡尺辅助逐步扩大缺损，确保所有样本缺损尺寸一致。专用牙科钻头的平头圆柱设计与半圆柱形缺损匹配，可实现高效且可重复的制备。
   4. 使用冲洗针持续以无菌生理盐水冲洗手术区域，防止骨切割过程中产生热坏死。
4. 骨替代材料植入
   1. 轻柔清除骨碎屑，并冲洗手术区域以去除残留颗粒。
   2. 将非承重型明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）水凝胶（参见材料表）或用于力学性能测试的承重型3D打印聚甲基丙烯酸甲酯（3DP-PMMA）植入缺损部位，确保植入物紧密贴合（图2Bj）。
      注意：本研究选用的两种生物材料具有显著不同的力学与生物学特性：GelMA水凝胶为柔软、非承重材料，成骨潜力有限；而3DP-PMMA为刚性、可承重支架，具备有效传递应力并支持骨形成的能力¹⁴（图2A）。这种对比突显了该模型在评估具有广泛力学强度和生物学性能的植入物方面的适用性。在实际应用中，该缺损模型亦可用于测试其他具有不同力学特性的候选材料。
5. 关闭手术部位
   1. 使用4-0单股缝线和持针器缝合肌肉层，注意避免过度张力（图2Bk）。
   2. 采用间断缝合法关闭皮肤，并用2%碘伏溶液对术区进行消毒（图2Bl）。

3. 术后护理

1. 将大鼠转移至已消毒的恒温加热垫（37 °C）上，以促进术后恢复。
2. 给予适当的术后镇痛处理（例如，每12小时皮下注射一次0.03 mg/kg的丁丙诺啡，持续48–72小时）。
3. 待大鼠恢复意识后，将其置于铺有柔软垫料的清洁笼具中，并确保食物和水易于获取。
4. 每天检查手术部位是否有感染、切口裂开或异常肿胀的迹象。术后至少连续7天观察大鼠的行为、体重和活动能力，以确保其顺利恢复并评估其福利状况。

4. 样品采集与数据收集

1. 样本采集
   1. 采用二氧化碳吸入法处死大鼠，并进行二次确认（遵循机构批准的方案）。
   2. 在植入后4周采集股骨样本，动物最初被随机分为两组材料组（每组 n = 6），以评估材料的力学性能。
      注意：在 GelMA 组中，有三只动物在手术后不久发生完全性骨折，被排除在外，最终每组仅剩三个样本可用于后续分析。
   3. 将股骨样本置于4%多聚甲醛中，4 °C固定48小时。
      注意：多聚甲醛具有毒性，应在经认证的通风橱中操作。佩戴手套、实验服及护目镜或面罩。将废液收集至贴有标签的危险化学品废物容器中，按规定处置。
2. 显微计算机断层扫描（µCT）评估
   1. 对植入后4周采集的股骨样本进行µCT扫描，扫描参数如下：X射线管电压70 kVp；X射线电流0.2 mA；滤光片AL 0.5 mm；积分时间1 × 300 ms；体素尺寸17 µm。
   2. 使用µCT设备软件中预设的脚本进行三维重建。利用专用图像处理软件的重切片功能生成缺损部位的横截面图像。遵循相应软件手册中描述的标准工作流程。
3. 组织学染色
   1. 在4 °C条件下，使用12%乙二胺四乙酸（EDTA）（pH 7.2）在摇床上对样本脱钙6周。
      注意：每2天更换一次EDTA溶液。定期检查脱钙进展。当样本在压力下变柔软或可被针穿透时，表明脱钙完成。
      注意：根据机构关于水溶性化学废液的指南处置EDTA溶液。受污染的生物材料应作为生物危害废物处理。
   2. 将样本依次经梯度乙醇溶液脱水，随后包埋于石蜡中。
   3. 将石蜡包埋的样本矢状面切片，厚度为6 µm。
      注意：确保切片包含植入材料与宿主组织之间的界面。
   4. 使用市售试剂盒进行苏木精-伊红（H&E）和马松三色染色（见材料表）。严格按照制造商的标准方案执行所有步骤，不得有任何偏差。通过组织病理学观察缺损部位的愈合情况。
      注意：染色液及受污染的一次性耗材应根据机构生物安全和危险废物处置规程进行收集和处置。
4. 免疫荧光（IF）染色
   1. 使用二甲苯及梯度乙醇溶液系列对6 µm厚的石蜡切片进行脱蜡和复水。
      注意：二甲苯易燃且有毒。应在通风橱中操作，佩戴手套、实验服和护目镜。将废溶剂单独收集至化学废物容器中，按规定处置。
   2. 将切片置于柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中，在95–100 °C孵育15–20分钟进行抗原修复。随后让切片自然冷却至室温。
   3. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤切片5分钟，然后用含0.1% Triton X-100的PBS处理20分钟，以促进抗体渗透。接着在室温下用含5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS封闭非特异性结合位点1小时。
      注意：Triton X-100具有刺激性，应在通风区域佩戴手套、实验服和护目镜操作。Triton X-100溶液应作为化学废物收集至指定容器中处置。所有与组织切片接触过的溶液（如BSA和PBS）均应视为生物废物，并按照机构生物安全规程收集和处置。
   4. 将切片与一抗（抗Piezo型机械敏感离子通道组分1（Piezo1），稀释比例1:200；抗瘦素受体（LepR），稀释比例1:50）在抗体稀释缓冲液中孵育。每张切片加入50 µL稀释后的抗体溶液，在湿盒中4 °C避光孵育12–18小时。
   5. 用PBS洗涤切片（3次 × 5分钟），然后与荧光标记的二抗（稀释比例1:200）孵育。每张切片加入50 µL稀释后的二抗溶液，在湿盒中室温避光孵育2小时。
   6. 再次用PBS冲洗切片（3次 × 5分钟），然后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（稀释比例1:50）复染细胞核5分钟。
   7. 使用抗荧光淬灭封片剂封片，并加盖盖玻片。
   8. 使用激光共聚焦显微镜，选择适当的滤光片设置进行成像和图像采集。

结果

本研究通过使用平头圆柱形专用牙科金刚砂钻头在大鼠股骨中段钻取一个长度为 4 mm、半径为 1.5 mm 的半节段性骨干骨缺损，建立了半节段性骨干骨缺损模型（图 2A）。为了验证该模型在评估材料力学性能和生物学性能方面的能力，我们设置了两个对照组，分别在骨缺损处植入 GelMA 水凝胶或 3DP-PMMA（图 3、图 4 和 图 5）。GelMA 水凝胶具有较差的机械强度和次优的成骨能力，而 3DP-PMMA 则被假设具有可靠的承重能力和有效的应力传递特性^15,16。在 GelMA 组中，半数动物在术后不久即发生完全性骨折，被排除于后续分析之外，其余三只动物均持续表现为骨不连，未出现正常骨愈合。相比之下，3DP-PMMA 组的全部六只动物均存活，并实现了稳定的骨性愈合，未观察到骨折或骨不...

讨论

除了广泛强调的成骨诱导性、骨整合性和生物相容性外⁵，骨替代材料的力学响应性和承载能力同样至关重要，尤其在修复承重骨缺损时²²传统的机械性能评估通常依赖于 体外 方法，例如万能试验机、压缩测试或拉伸强度分析^23,24,25然而，这些方法虽具信息性，却无法在生理条件下捕捉植入材料与宿主组织之间复杂的力学相互作用²⁶为弥补这一差距， 体内 用于模拟承重环境中机械刺激的模型对于评估骨替代材料的真实结构性能至关重要。在现有的骨缺损模型中，颅骨缺损模型旨在研究膜内成骨过程，可提供可预测的细胞环境，适用于考察成骨相关因子及细胞群体²⁷然而，作为一种非承重模型，其在评估材料力学性能方面存在固有的局限性 体内同样，其他常用的模型...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2% 碘伏溶液	成都金山化学试剂有限公司	无
3D打印聚甲基丙烯酸甲酯（3DP-PMMA）	由四川大学高分子科学与工程学院惠赠	无
4% 多聚甲醛	Biosharp	BL539A
75% 乙醇	成都金山化学试剂有限公司	无
棉球	海氏海诺集团有限公司	无
棉签	拉康医疗器械有限公司	无
DAPI染色液	Beyotime	货号 C1005
一次性无菌手术刀	杭州华为医疗用品有限公司	20100227
甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶	由四川大学高分子科学与工程学院惠赠	无
20% GelMA	Cellink	IKG125000005
山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor® 594）	Abcam	ab150116
山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor® 488）	Abcam	ab150077
苏木精-伊红染色试剂盒	Biosharp	C1005
高速手机	佛山SCS医疗仪器有限公司	9018499000
冲洗针头	四川新世纪医用高分子制品有限公司	无
Masson’三色染色试剂盒	Solarbio	G1340
医用无纺布	河南亚都实业有限公司	无
医用无纺布	河南亚都实业有限公司	无
微型计算机断层扫描（µCT）	Scanco Medical AG	μCT 45
用于横截面图像（重切片功能）的Mimics 20.0软件	Materialise	无
持针器	成都狮峰有限公司	无
Ob-R/瘦素受体抗体（B-3）	Santa Cruz	sc-8391
Olympus研究级全片扫描系统VS200	成都知识科技有限公司	VS200
骨膜剥离器	成都狮峰有限公司	无
PIEZO1抗体	Novus	NBP1-78446
生理盐水溶液	四川科伦药业股份有限公司	无
用于3D图像重建的Scanco Medical可视化软件（预设脚本）	Scanco Medical AG	无
专用牙科金刚砂车针（TF-22/170-021m/845-021m）	典通 dental 材料公司	无
Sprague-Dawley大鼠	Byrness Weil Biotech Ltd	无
直剪刀	成都狮峰有限公司	无
外科电动马达	MARATHON	N3-140232
外科缝线（4-0单股）	杭州华为医疗用品有限公司	无
游标卡尺	Deli	DL91150