用于评估承重区域骨替代材料性能的大鼠半节段性骨干骨缺损模型

摘要

本研究建立了一种大鼠股骨半节段性缺损模型，用于评估骨替代材料在无内固定或外固定条件下承受负荷时的力学性能和成骨性能。

摘要

准确评估骨替代材料的临床前性能需要建立既能支持组织再生、又能反映生理承重条件下机械挑战的模型。然而，大多数传统的动物骨缺损模型在这方面存在不足。例如，尽管颅骨缺损模型被广泛使用，但其建立于非承重区域。类似地，长骨中的钻孔或部分缺损主要关注局部愈合过程，缺乏足够的负荷传递，难以评估材料的机械支撑能力。本研究建立了一种标准化的大鼠股骨中段半节段性骨缺损模型，用于在无需固定装置的情况下，评估骨替代材料在承重环境中的力学与生物学性能。通过高速手机配合特制的圆柱形牙科钻头，在股骨外侧中段制备一个长4 mm、半径1.5 mm的半圆柱形缺损。植入两种具有不同特性的代表性材料——甲基丙烯酰化明胶（Gelatin methacryloyl, GelMA）水凝胶和3D打印聚甲基丙烯酸甲酯（3D-printed polymethyl methacrylate, 3DP-PMMA）——以验证该模型区分材料力学性能的能力。术后4周进行的放射学、组织学和免疫荧光分析显示，由于机械支撑不足，GelMA植入导致骨畸形愈合，纤维组织占主导，骨整合有限。相比之下，3DP-PMMA促进了新骨形成、骨膜连续性的恢复，以及表达Piezo型机械敏感离子通道组分1（Piezo1⁺）和表达瘦素受体（LepR⁺）细胞的募集。该模型为评估生物材料的承重能力、骨诱导性及骨整合潜力提供了一个实用且可重复的平台，可作为筛选适用于骨科应用（如长骨重建或骨折修复）候选材料的重要工具。

引言

在生理条件下，骨在维持身体结构完整性和机械功能方面起着核心作用。它支撑体重、实现运动，并保护内脏器官。当骨因创伤、肿瘤切除或感染而受损，尤其是在承重区域时，其机械连续性会被中断。这种中断常导致骨骼畸形、活动能力下降、肢体不稳、慢性疼痛，以及由严重骨折和出血引发的危及生命的问题^1,2。目前，临床上已应用骨移植材料和生物材料等骨替代物来替换严重受损的骨组织或修复大范围骨缺损。同样，植入的骨替代物若机械性能不足，可能导致植入失败，造成骨不连，甚至在缺损部位发生灾难性骨折^3,4。为了恢复骨的结构与功能，骨替代材料不仅需要促进骨再生，还必须具备足够的机械强度以承受生理载荷⁵。

在临床转化之前的一个关键步骤是，对生物材料植入后是否能够 体内，能够满足承重骨区域结构支撑所需的力学要求。尽管许多生物材料已显示出良好的应用前景 体外 或在小型非承重模型中，其向临床应用的转化常常受到缺乏可模拟的可靠临床前模型的阻碍 体内 机械条件。目前用于骨缺损研究的动物模型包括下颌骨缺损⁶，颅骨缺损

方案

本研究中所有动物实验均获得四川大学华西口腔医学院伦理委员会（WCHSIRB-AT-2025-342）的批准。雄性Sprague-Dawley大鼠（每只180 g）购自商业来源，并根据植入材料的不同随机分为两组（每组n = 6）。所用试剂和设备详见材料表。

1. 术前准备

1. 手术物品
   1. 参照图1A准备手术器械，图中编号标签对应的器械按以下顺序排列：弯头镊子、一次性无菌手术刀、直剪刀、骨膜剥离器、冲洗针头、特定牙科金刚砂钻头（参见图1B的放大图）、高速手机、游标卡尺、外科电机、单丝缝线（4-0）和持针器。
   2. 准备0.9%无菌生理盐水用于冲洗。
2. 灭菌与消毒
   1. 对可耐受高压灭菌的手术器械进行灭菌，包括弯头镊子、剪刀、骨膜剥离器、牙科金刚砂钻头、高速手机和持针器。
      注：器械应使用医用无纺布包裹，并用高压灭菌胶带密封，在121–134 °C条件下进行蒸汽灭菌20–25分钟。
   2. 对于热敏感器械，如游标卡尺和外科电机，应暴露于紫外线下至少30分钟以进行消毒。一次性物品，如一次性无菌手术刀、冲洗针头和缝线，应保持密封在原始无菌包装内直至使用。....

结果

本研究通过使用平头圆柱形专用牙科金刚砂钻头在大鼠股骨中段钻取一个长度为 4 mm、半径为 1.5 mm 的半节段性骨干骨缺损，建立了半节段性骨干骨缺损模型（图 2A）。为了验证该模型在评估材料力学性能和生物学性能方面的能力，我们设置了两个对照组，分别在骨缺损处植入 GelMA 水凝胶或 3DP-PMMA（图 3、图 4 和 图 5）。GelMA 水凝胶具有较差的机械强度和次优的成骨能力，而 3DP-PMMA 则被假设具有可靠的承重能力和有效的应力传递特性^15,16。在 GelMA 组中，半数动物在术后不久即发生完全性骨折，被排除于后续分析之外，其余三只动物均持续表现为骨不连，未出现正常骨愈合。相比之下，3DP-PMMA 组的全部六只动物均存活，并实现了稳定的骨性愈合，未观察到骨折或骨不.......

讨论

除了广泛强调的成骨诱导性、骨整合性和生物相容性外⁵，骨替代材料的力学响应性和承载能力同样至关重要，尤其在修复承重骨缺损时²²传统的机械性能评估通常依赖于 体外 方法，例如万能试验机、压缩测试或拉伸强度分析^23,24,25然而，这些方法虽具信息性，却无法在生理条件下捕捉植入材料与宿主组织之间复杂的力学相互作用²⁶为弥补这一差距， 体内 用于模拟承重环境中机械刺激的模型对于评估骨替代材料的真实结构性能至关重要。在现有的骨缺损模型中，颅骨缺损模型旨在研究膜内成骨过程，可提供可预测的细胞环境，适用于考察成骨相关因子及细胞群体²⁷然而，作为一种非承重模型，其在评估材料力学性能方面存在固有的局限性 体内同样，其他常用的模型.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2% 碘伏溶液	成都金山化学试剂有限公司	无
3D打印聚甲基丙烯酸甲酯（3DP-PMMA）	由四川大学高分子科学与工程学院惠赠	无
4% 多聚甲醛	Biosharp	BL539A
75% 乙醇	成都金山化学试剂有限公司	无
棉球	海氏海诺集团有限公司	无
棉签	拉康医疗器械有限公司	无
DAPI染色液	Beyotime	货号 C1005
一次性无菌手术刀	杭州华为医疗用品有限公司	20100227
甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶	由四川大学高分子科学与工程学院惠赠	无
20% GelMA	Cellink	IKG125000005
山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor® 594）	Abcam	ab150116
山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor® 488）	Abcam	ab150077
苏木精-伊红染色试剂盒	Biosharp	C1005
高速手机	佛山SCS医疗仪器有限公司	9018499000
冲洗针头	四川新世纪医用高分子制品有限公司	无
Masson’三色染色试剂盒	Solarbio	G1340
医用无纺布	河南亚都实业有限公司	无
医用无纺布	河南亚都实业有限公司	无
微型计算机断层扫描（µCT）	Scanco Medical AG	μCT 45
用于横截面图像（重切片功能）的Mimics 20.0软件	Materialise	无
持针器	成都狮峰有限公司	无
Ob-R/瘦素受体抗体（B-3）	Santa Cruz	sc-8391
Olympus研究级全片扫描系统VS200	成都知识科技有限公司	VS200
骨膜剥离器	成都狮峰有限公司	无
PIEZO1抗体	Novus	NBP1-78446
生理盐水溶液	四川科伦药业股份有限公司	无
用于3D图像重建的Scanco Medical可视化软件（预设脚本）	Scanco Medical AG	无
专用牙科金刚砂车针（TF-22/170-021m/845-021m）	典通 dental 材料公司	无
Sprague-Dawley大鼠	Byrness Weil Biotech Ltd	无
直剪刀	成都狮峰有限公司	无
外科电动马达	MARATHON	N3-140232
外科缝线（4-0单股）	杭州华为医疗用品有限公司	无
游标卡尺	Deli	DL91150