大鼠半节段骨干缺损模型，用于评估承重区域骨替代表现

摘要

本研究建立了大鼠股骨半节缺损模型，用于评估骨替代材料在无内固定或外固定的情况下承重条件下的机械和骨生成性能。

摘要

对骨替代材料的准确临床前评估需要模型，不仅支持组织再生，还要反映生理负重条件的机械挑战。然而，大多数传统动物骨缺陷模型在这方面都不足。例如，虽然广泛使用，但标变量缺陷模型多用于非承载区域。同样，长骨中的钻孔或部分缺损主要关注局部愈合，缺乏足够的载荷传递以评估机械支撑。本研究建立了一个标准化的半节段骨干缺损模型，用于评估骨替代材料在承重环境中的机械和生物学性能，且不使用固定装置。利用高速手部和专用圆柱形牙科刺，在股骨外侧中轴形成了一个半圆柱形缺损，长度为4毫米，半径为1.5毫米。植入了两种具有不同性质的代表性材料——明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶和3D打印聚甲基丙烯酸甲酯（3DP-PMMA）——以验证模型区分材料机械性能的能力。植入后4周进行的X光、组织学和免疫荧光分析显示，由于机械支撑不足，GelMA植入导致错位，纤维组织为主，骨整合有限。相比之下，3DP-PMMA促进了新骨形成、骨膜连续性以及压电型机敏离子通道1表达（Piezo1⁺）和瘦素受体表达（^LepR+）细胞的招募。该模型为评估生物材料的承重能力、骨诱导性和骨整合潜力提供了实用且可重复的平台。它可以作为筛选骨科候选材料的宝贵工具，如长骨重建或骨折修复。

引言

在生理条件下，骨骼在维持身体结构完整性和机械功能方面起着核心作用。它能支撑体重，促进活动，并保护内脏。当骨骼因外伤、肿瘤切除或感染而受损，尤其是在承重区域时，机械连续性会被中断。这种破坏常常导致骨形变形、活动能力下降、肢体不稳定、慢性疼痛，甚至严重骨折和出血等危及生命的问题^1,2。如今，骨移植和生物材料等骨骼替代疗法已被临床应用，用于替换严重损伤的骨组织或修复大规模骨缺损。同样，植入骨替代物的机械性能受损可能导致植入失败，导致缺^损部位不愈合甚至灾难性骨折^3,4。为了恢复结构和功能，骨骼替代材料不仅要促进骨骼再生，还必须具备足够的机械强度以承受生理负荷⁵。

临床转化前的关键一步是现实评估生物材料一旦体内植入，是否能满足承重骨区结构支撑所需的机械需求。尽管许多生物材料在体外或小型非承重模型中展现出潜力，但其临床转化常因缺乏可靠的临床前模型而受阻，无法模拟体内机械状况。目前用于骨缺损研究的动物模型包括下颌缺损⁶、颅骨缺损⁷、长骨钻孔缺损⁸、拔牙后牙槽⁹等。这些模型主要评估材料的成骨能力，重点关注组织学或放射学再生终点^10,11。然而，考虑到这些部位要么是非承重的，要么是机械保护的，因此无法复制长骨中遇到的动态应力^条件。即使通过体外技术如压缩强度或拉伸强度分析进行机械性能测试，这些方法也无法复制体内环境中固有的动态载荷和宿主组织相互作用¹³。

临床前研究的一个主要空白是缺乏标准化且可重复的动物模型，无法在承重条件下对骨骼替代物进行体内机械评估。为此，本研究建立了大鼠半节段骨干缺损模型。该模型在承重区域提供一个稳定且可重复的缺损位点，便于直接评估骨替代材料在生理负荷下的机械支撑能力，同时也支持评估骨生成结果。此外，该模型可应用于多种动物物种，缺陷大小和位置可根据所用动物进行调整。然而，它并不能完全复制人类骨骼复杂的生物力学环境，对于仅聚焦于非承重缺损、颅骨愈合或非常大型结构植入物的研究，替代模型可能更为合适。

方案

本研究中所有动物作均获得四川大学华西口腔医学院伦理委员会（WCHSIRB-AT-2025-342）的批准。从商业来源获得雄性Sprague-Dawley大鼠（每只180克），并根据植入材料随机分配到两组（每组n=6只）。试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 术前准备

1. 外科手术项目
   1. 准备与 图1A对应的编号标签的手术器械，顺序如下：弯曲产钳、一次性无菌手术刀、直剪刀、骨膜升降机、冲洗针、专用牙科金刚石钻头（见 图1B的放大图）、高速手枪、游标卡尺、手术马达、单丝缝线（4-0）和针架。
   2. 准备0.9%无菌生理盐水用于灌溉。
2. 消毒与消毒
   1. 对能承受高压消毒的手术器械进行消毒，包括弯曲产钳、剪刀、骨膜升降机、牙科钻石钻头、高速手持器和针架。
      注意：仪器应用医用非纺布包裹，并用高压灭菌胶带密封，在121-134°C下进行蒸汽消毒20-25分钟。
   2. 对于热敏仪器，如游标卡尺和手术用马达，应将其暴露在紫外线下至少30分钟进行消毒。一次性物品，如一次性无菌手术刀、冲洗针和缝线，应保持在原包装中密封，直到使用。
   3. 确保手术环境无菌且温度受控。用75%乙醇擦拭手术台及周围表面。使用无菌的医用级无纺布覆盖手术台。
      注意：乙醇是易燃的;远离点火源，存放在密封容器中。将乙醇废弃物收集到指定的化学废弃物容器中，以便妥善处理。请佩戴适当的个人防护装备，包括手套、实验服和安全护目镜。
3. 麻醉
   1. 称重大鼠并计算麻醉剂量（100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg的赛拉嗪，腹腔内注射）。
   2. 手术前20分钟诱导麻醉（遵循机构认可的方案），并通过检查脚趾夹压是否无反应及失去正直反射来确认麻醉深度。
   3. 在手术过程中，双眼涂抹眼药膏以防止角膜干燥。

2. 手术程序

1. 场地准备
   1. 将大鼠侧卧在无菌手术台上。刮除与股骨突出相对应的大腿侧侧区域，并用2%碘酊剂消毒皮肤，随后涂抹75%乙醇（见图2B）。
      注意：碘酊剂易燃且具有刺激性。在通风良好的环境中进行作，佩戴手套、实验服和安全护目镜。根据机构安全规定，将用过的湿巾和溶液丢弃在指定的化学废物容器中。
   2. 用无菌的带孔布覆盖手术部位以维持无菌。
2. 手术部位开放
   1. 使用弯曲产钳协助稳定组织，固定肌肉，并在整个手术过程中轻柔固定股骨（见图2Bb-h）。
   2. 用直剪刀在大腿侧切开2-3厘米纵向皮肤切口，露出下方肌肉（见图2Bb）。
   3. 识别股直肌和股外肌，并用直剪刀（图2Bc）沿可见的白色筋膜（图2Bb中黄色箭头表示）小心分离。
   4. 定位并暴露股骨外侧表面的肌肉附着部分（见图2Bd）。
   5. 用一次性无菌手术刀沿肌肉附着处纵切口，以进入股骨表面（见图2Be）。
      注意：在进行软组织分离的锐利解剖（使用剪刀或手术刀）时，请注意不要损伤下方的血管和神经。如果不熟悉解剖结构，可以使用细尖镊子和骨膜升降机进行钝性剥离。
   6. 使用骨膜升降机进行钝性清扫，以脱离肌肉附着物，完全暴露股骨中骨干（见图2Bf）。
   7. 进一步将股骨与周围肌肉分离，并用弯曲的镊子固定股骨中轴（见图2Bg）。
3. 半节骨干缺损模型建立
   1. 将扁头圆柱形专用牙科金刚石（图1B）连接到由手术马达驱动的高速手持装置上。将手术马达调到35,000转/分钟。
   2. 在直接观察下，将股骨中轴的最高点视为缺损形成的解剖中心。此时用钻头垂直向下钻孔，直到发现阻力突然丧失，缺损处出现血渗，表明皮层已完全穿透并进入髓质腔（见图2Bh）。
      注意：鉴于皮层厚度在动物间存在差异，建议操作员熟悉股骨解剖学，并进行实验前培训以规范这一步骤。
   3. 通过围绕初始穿透点施加受控的水平推拉运动来扩大缺陷。沿股骨轴纵向延伸，沿股骨直径向侧延伸，逐渐形成标准化的半圆柱形缺损，长度4毫米，半径1.5毫米（图2Bi，缺损形态和位置见 图2A ）。
      注意：一旦中心点确定，使用游标卡尺辅助逐步扩大缺陷，确保所有试样尺寸均匀。专用齿钻的扁平圆柱形设计与半圆柱形缺陷相匹配，使制备高效且可重复。
   4. 使用冲洗针持续用无菌生理盐水冲洗手术部位，以防止骨切时发生热坏死。
4. 骨替代植入
   1. 轻柔地清除骨头残渣并灌溉部位以清除残留颗粒。
   2. 将非承重明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶（见 材料表）或承重3D打印聚甲基丙烯酸甲酯（3DP-PMMA）植入缺陷部位，用于机械性能测试，确保紧密贴合（图2Bj）。
      注意：这里使用的两种生物材料是有意选择以代表对比的机械和生物性能：GelMA水凝胶作为软质、非承重材料，具有有限的骨生成潜力，而3DP-PMMA则作为刚性、承重的支架，能够有效传递应力并支持骨骼形成¹⁴ （见图2A）。).这一对比凸显了模型评估机械强度和生物性能范围广泛的植入物的能力，实际上缺陷模型可用于测试具有机械性能的其他候选材料。
5. 手术部位关闭
   1. 使用4-0单丝缝线和针夹缝合肌肉层，注意避免过度张力（见图2Bk）。
   2. 采用间断缝线进行皮肤闭合，并使用2%碘蛋白溶液消毒手术部位（见图2Bl）。

3. 术后护理

1. 将大鼠转移到消毒过的恒温加热垫（37°C）上，以便术后恢复。
2. 术后给予适当的镇痛药（例如，每12小时皮下注射0.03毫克/公斤的丁丙诺啡，持续48-72小时）。
3. 老鼠恢复意识后，将它们放入干净的笼子，配备柔软的垫料，并方便获取食物和水。
4. 每天监测手术部位是否有感染、裂开或异常肿胀的迹象。观察大鼠的行为、体重和活动能力，至少7天内，以确保恢复并评估其健康状况。

4. 样本采集与数据收集

1. 样本采集
   1. 先吸入二氧化碳安乐死大鼠，随后进行二次确认（遵循机构批准的方案）。
   2. 在植入后4周采集股骨标本，动物最初随机分为两组（每组n=6个），以评估材料的机械性能。
      注：在GelMA组中，三只动物在手术后不久发生完全骨折并被排除，留下三件样本供后续分析。
   3. 将股骨标本固定在4%的对甲醛中，48小时，温度为4°C。
      注意：对甲醛有毒，应在认证的排气柜中处理。请佩戴手套、实验服和护目镜或面罩。将废弃物溶液收集到标有标签的危险化学废物容器中进行处置。
2. 微型计算机断层扫描（μCT）评估
   1. 对植入后4周采集的股骨标本进行μCT扫描，扫描参数如下：X光管电位70 kVp;X射线强度0.2毫安;滤光片，AL 0.5毫米;积分时间，1 x 300毫秒;体素尺寸为17微米。
   2. 使用μCT机器软件中预定义的脚本进行三维重建。使用专用图像处理软件的重切功能生成缺陷部位的横断面图像。请按照相关软件手册中描述的标准工作流程作。
3. 组织学染色
   1. 在4°C下用12%乙二胺四乙酸（EDTA）（pH值7.2）在摇床上脱钙6周。
      注意：每两天更换一次EDTA溶液。定期检查脱钙进展。脱钙完成时，样品在压力下具有柔韧性或通过针头。
      注意：按照水性化学废物的机构指南处置EDTA溶液。受污染的生物材料应作为生物危害废物处理。
   2. 将样品进行分级乙醇稀释脱水，然后嵌入石蜡中。
   3. 将石蜡嵌入样品矢状切成6微米厚的片。
      注意：确保切片中包含植入物与宿主组织之间的界面。
   4. 使用市售试剂盒进行赤木精-伊苏木素（H&E）和马森三色染色（见 材料表）。严格按照制造商的标准流程执行所有程序，绝无任何偏差。通过组织病理学观察缺损部位愈合。
      注意：按照机构生物安全和有害废弃物处置规范，处理染色溶液和受污染消耗品。
4. 免疫荧光（IF）染色
   1. 使用一系列二甲苯和分级乙醇溶液脱水并水合厚度为6微米的石蜡切片。
      注意：二甲苯易燃且有毒。在排气柜内佩戴手套、白大褂和安全护目镜时，处理二甲苯。将废弃溶剂单独收集到化学废物容器中以便妥善处理。
   2. 通过将切片置于柠檬酸缓冲液（pH值6.0）中，在95-100°C培养15-20分钟进行抗原回收。让玻片自然冷却至室温。
   3. 用磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）清洗切片5分钟，并用0.1% Triton X-100 PBS溶液处理20分钟，以促进抗体穿透。然后在室温下用5%牛血清白蛋白（BSA）在PBS中阻断非特异性结合位点1小时。
      注意：Triton X-100 是个刺激因素;在通风良好的区域内，戴手套、实验服和安全护目镜。将特里顿X-100溶液作为化学废弃物，存放在指定容器中。对于所有程序，接触组织切片的溶液，如BSA和PBS，应被视为生物废弃物，必须按照机构生物安全规范收集和处置。
   4. 将切片与原抗抗体（抗压电型机敏离子通道组分1（Piezo1，稀释1：200）;抗瘦素受体（LepR，稀释1：50））一起在抗体稀释缓冲液中孵育。在每个切片上涂抹50微升稀释抗体溶液，并在加湿腔室内以4°C的黑暗环境培养12-18小时。
   5. 用PBS洗涤载玻片（3×5分钟），然后用荧光团结合的二级抗体（稀释1：200）培养。在每个切片上涂抹50微升稀释抗体溶液，并在室温、加湿室中黑暗中培养2小时。
   6. 再次用PBS冲洗玻片（3×5分钟），然后用4'6-二酰胺-2-苯吲哆酮（DAPI）（稀释1：50）对核进行反染5分钟。
   7. 用防褪色安装介质安装各段，并用盖片覆盖。
   8. 使用激光扫描共焦显微镜配合适当的滤光片设置，进行图像可视化和捕捉。

结果

本研究通过在股骨中段钻孔，在股骨中轴钻孔，形成半节状骨干骨缺损模型，并用扁平的圆柱形特定齿钻钻（见图2A）。为展示模型测试材料机械和生物性能的能力，我们设置了两个对比组，缺陷植入GelMA水凝胶或3DP-PMMA（图3、图4和图5）。GelMA水凝胶的机械强度较差且骨生成能力不理想，而3DP-PMMA被认为具有可靠的承重能力和有效的应力传递特性（^15,16）。在GelMA组中，一半动物在手术后不久发生完全骨折，排除了进一步分析，而剩余三只则持续表现出骨愈合不良且骨愈合不正常。相比之下，3DP-PMMA组的六个动物均存活并实现稳定结合，未观察到骨折或错位。

在材料植...

讨论

除了广为强调的骨诱导、骨整合和生物相容性5^外，骨骼替代物的机械响应性和承重能力同样重要，尤其是在修复承重骨缺陷方面²²。传统的机械性能评估通常依赖体外方法，如通用测试机、压缩测试或抗拉强度分析23,24,25。虽然这些方法具有信息量，但未能捕捉植入材料与宿主组织在生理条件下复杂的机械相互作用²⁶。为了弥合这一差距，模拟承重环境中机械刺激的体内模型对于评估骨骼替代物的真实结构性能至关重要。在现有的骨缺损模型中，头骨缺损设计用于研究膜内骨化，提供一个适合研究骨质成因和细胞群体的可预测细胞环境²⁷。然而，作为非承重型号，它在评估材料在实际中的机械性能...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2%碘伏溶液	成都金山化工试剂有限公司	没有
3D打印聚甲基丙烯酸甲酯（3DP-PMMA）	由四川大学高分子科学与工程学院友好提供	没有
4% 对甲醛	生物锐利	BL539A
75% 乙醇	成都金山化工试剂有限公司	没有
棉球	海石海诺集团有限公司，nbsp;有限公司。	没有
棉棒	拉孔医疗器械有限公司	没有
DAPI染色溶液	Beyotime	猫#C1005
一次性无菌手术刀	杭州华为医疗用品有限公司	20100227
明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶	由四川大学高分子科学与工程学院友好提供	没有
GelMA 20%	Cellink	IKG125000005
山羊抗老鼠IgG H&L（Alexa Fluor ®594）	阿布卡姆	AB150116
山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor等;488）	阿布卡姆	AB150077
血液素和嗜氨酸染色套件	生物锐利	C1005
高速握手	佛山SCS医疗器械有限公司	9018499000
灌溉针	四川新世纪医用高分子制品有限公司	没有
马松三色染色套件	太阳生物	G1340
医用无纺布	河南亚度工业有限公司及nbsp;	没有
医用无纺布	河南亚度工业有限公司及nbsp;	没有
微型计算机断层扫描（和micro;CT）	Scanco医疗股份公司	μCT 45
模拟20.0用于横截面图像（重切片功能）	实体化	没有
针架	成都石风有限公司	没有
OB-R/瘦素受体抗体（B-3）	圣克鲁斯	SC-8391
奥林巴斯研究级全片扫描系统VS200	成都知识科技有限公司	VS200
骨膜升降机	成都石风有限公司	没有
PIEZO1抗体	诺瓦斯	NBP1-78446
生理盐水溶液	四川科伦制药有限公司	没有
Scanco 三维图像重建医疗可视化软件（预定义脚本）	Scanco医疗股份公司	没有
特定牙科金刚石钻头（TF-22/170-021m/845-021m）	电通牙科材料公司	没有
斯普雷格-道利鼠及nbsp;	伯尼斯·韦尔生物技术有限公司	没有
直剪刀	成都石风有限公司	没有
手术运动	马拉松	N3-140232
外科缝线（4-0单丝）	杭州华为医疗用品有限公司	没有
游标卡钳	熟食店	DL91150