方法文章

采用怀化散对UPLC-Q-Orbitrap质谱技术中DDA与DIA采集模式的比较研究

DOI：

10.3791/69227

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2025年10月3日

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1School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacy, Shizuishan Maternal and Child Health Hospital, 3Department of Assets and Laboratory Management, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

本文内容

摘要

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本研究比较了数据依赖性采集（DDA）和数据非依赖性采集（DIA）模式（UPLC-QE-Orbitrap MS）在分析成分复杂的中药槐花散中的应用。建立了优化的DDA和DIA方法，并对化合物进行了鉴定 通过 Compound Discoverer。对其性能（化合物鉴定能力、重现性、谱图质量、灵敏度）进行了评估，为中药扫描模式的选择提供了实证指导。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究系统评估了两种质谱采集模式——数据依赖性采集（DDA）和数据非依赖性采集（DIA）——与超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）联用在复杂中药复方化学成分全面表征中的相对性能。以经典复方槐花散作为模型体系进行实证评估。分别建立了优化的DDA和DIA采集方法：DDA方法采用靶向前体离子选择策略并结合自定义的碎裂参数，而DIA方法则采用分段可变窗口策略覆盖目标 m/z 范围，对所有前体离子进行无偏碎裂。化合物鉴定通过Compound Discoverer软件完成。比较评估重点聚焦于两种采集模式的性能特征，包括鉴定化合物数量、重现性、MS/MS谱图质量以及对低丰度活性成分的检测灵敏度。结果表明，DDA模式检测到的化合物总数更高，而DIA模式获得的高置信度鉴定比例更大（谱图匹配得分 >0.8 的化合物占比达10.63%）。值得注意的是，在六种代表性化合物的保留时间和峰面积方面，DIA方法表现出显著更优的重现性，其中芦丁在两种采集模式间的保留时间相对标准偏差（RSD）相差 >3倍。然而，DDA产生的MS/MS谱图更干净，碎片离子特征更清晰，而DIA谱图则受到共洗脱离子干扰。与此同时，DIA能够有效检测到一些低丰度活性成分，这些成分的离子色谱图和MS/MS碎片在DDA模式下无法被提取。本研究为复杂中药复方研究中高分辨质谱采集模式的选择提供了关键实验依据和分析数据集。后续研究者可整合两种方法的互补优势，实现化合物全面表征的双重目标。

引言

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中药方剂具有复杂的化学体系，其成分浓度差异显著，尤其含有大量低丰度活性成分，这对分析技术提出了严峻挑战。槐花散是一种经典而著名的中药方剂，由四种药用植物组成：槐花（Sophora japonica）、侧柏叶（Platycladus orientalis leaves）、荆芥穗（Schizonepeta tenuifolia spikes）和枳壳（Citrus aurantium peel）。该方剂包含多种生物活性物质，如黄酮类、生物碱类和挥发油类，其浓度差异显著。因此，槐花散是研究中药方剂物质基础的典型复杂体系模型1。对其化学成分进行准确、全面且可靠的表征，是阐明其药效物质基础并提升质量控制标准的关键前提。

超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法（UPLC-QE-Orbitrap MS）因其卓越的分辨率、灵敏度和质量精度，已成为分析复杂中药体系中化学成分的核心平台。在数据采集策略方面，数据依赖性采集（Data-Dependent Acquisition, DDA）和数据非依赖性采集（Data-Independent Acquisition, DIA）是两种主流模式2,3,4（图1）。DDA模式根据预设规则（如前体离子强度阈值、动态排除）选择性触发高丰度离子的碎裂，从而获得针对目标物的高质量二级质谱（MS/MS）谱图，有助于结构解析。然而，该模式在覆盖低丰度离子方面存在局限性5,6,7,8。相比之下，DIA模式在特定质荷比范围内，采用连续或可变窗口对所有前体离子进行无歧视性碎裂。理论上，该模式可捕获所有可检测离子，显著提升检测的广度和重现性，尤其适用于非靶向的全局分析，但其产生的混合二级质谱图更为复杂，解析难度较高5,9。

目前，尽管数据依赖采集（DDA）和数据非依赖采集（DIA）技术已分别应用于中药分析，但在相同的复杂中药方剂体系（如槐花散）中，针对核心性能指标（如成分鉴定广度（尤其是低丰度成分）、MS/MS 谱图质量及检测灵敏度）的系统性、实证性对比研究仍显不足。明确这两种模式在复杂中药基质中的适用场景、优势与局限性，对于研究人员根据具体实验目标优化策略选择至关重要10。

本文总结了关键参数和局限性，以指导读者了解本方案的适用范围。该方法对复杂中药基质的分析非常有效，且已针对含有黄酮类和生物碱的体系优化了参数。经过实证测试，关键的DIA可变窗口设定为30 m/z；对于具有不同理化性质的样品，该参数需进行相应调整。该方法可稳定检测低丰度离子（峰面积约105），但需在正离子和负离子电离模式下分别采集数据，以确保数据质量。主要局限性在于DIA对谱图数据库和高级去卷积软件的依赖，以实现可靠的化合物鉴定，这会影响对计算资源的需求。

因此，本研究旨在以经典方剂槐花散为研究对象，对UPLC-QE-Orbitrap MS平台上DDA与DIA扫描模式的综合性能进行深入、系统的比较。将针对槐花散的分析需求，建立优化的DDA和DIA扫描方法，并采用Compound Discoverer软件进行数据处理，从以下四个方面对两种模式进行评估与比较：（1）鉴定化合物总数；（2）获取的MS/MS谱图质量；（3）代表性化合物峰面积与保留时间的重复性；（4）对低丰度活性成分的检测灵敏度。本研究有望为复杂中药体系研究中高分辨质谱扫描模式的选择提供坚实的实验依据和数据支持，并探索DDA与DIA互补优势的潜力，以实现对 "广度与深度之间的平衡" 并推进中医药现代化。

实验过程中，针对DIA采集模式下分段可变窗口的参数设置，建议将其设为30 m/z。同时，分别采集正离子和负离子的效果更佳。

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方案

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本研究中使用的试剂和设备列在材料表中。

1. 怀化散供试品溶液的制备

  1. 根据处理规范 "炒槐花" 根据2020年版《中华人民共和国药典》（一部），取适量原药材槐花，除去杂质及枝梗，筛去灰屑，置热锅中，用文火（100 °C）炒至深黄色，取出，放凉。
  2. 制备加工产品 Platycladus orientalis 叶片按照 "0213 准备工作的通用规则" 《中华人民共和国药典》（2020年版，第四部）中规定。取适量原液 Platycladus orientalis 叶片，去除杂质，放入热锅中，用小火（100 ºC）炒至黄色。取出，放凉。
  3. 根据方法制备知克的加工产品 "麸炒 枳实" 《中国药典》（一部）2020年版规定。取适量生枳壳原料，除去杂质，加热至100 °C，按1:10（药材与辅料比例）喷洒适量麦麸。
    1. 烟起后，加入生枳壳片，迅速翻炒至表面呈黄色或深黄色，取出，筛去麦麸，放凉，备用。
  4. 按照1:1:1:1的重量比例配制怀化散 中医方剂学 （新世纪第三版）。准确称取每种中药粉末各1 g（过五号筛）。
    1. 将粉末置于研钵中混合，按以下步骤操作 "研磨与混合法" 对于中药粉末：沿同一方向轻柔且均匀地研磨10分钟。
    2. 当观察不到明显的条纹、团块或颜色差异，且整个混合物呈现均匀一致的外观时，即可认为粉末已混合均匀。采用此方法制备最终的怀化散样品。
  5. 使用标准化的目视检查方案评估混合均匀性。在一致的光照条件下，将粉末混合物置于白色背景上进行观察。
    ​注意：仅当混合物满足以下所有标准时，才可视为均质：整体颜色均匀，无可见的条纹或单一组分的斑块；质地一致，无粗细不均现象；从多个取样点观察，颜色深浅无明显差异；经仔细检查，未发现聚集的颗粒结块。该评估应由两名独立的分析人员进行，以确保结果一致性。
  6. 准确称取0.1 g均匀混合的怀化散样品，转移至10 mL容量瓶中，加入8 mL甲醇。
  7. 以500 W功率、40 kHz频率超声提取60分钟。冷却至室温。用甲醇定容至刻度。
    1. 充分振荡，得到10 mg/mL的槐花粉提取液。经0.22 µm微孔滤膜（PVDF）过滤，将滤液转移至样品瓶中用于检测。
      ​注意：实验过程中产生的有机废液及其他相关有毒有害试剂均进行了分类并贴标。每两周由成都中医药大学资产与实验室管理处工作人员将其运送至有资质的机构进行统一回收和处理。

2. UPLC-Q-Orbitrap 高分辨质谱检测条件

  1. 色谱系统参数设置
    1. 使用 C18 色谱柱（3.0 mm × 100 mm，2.6 µm）。保持柱温为 30 °C。采用流动相 A（含 0.1% 甲酸的水溶液）和流动相 B（乙腈）。
    2. 梯度程序设置如下：0–10 分钟，5%–20% B；10–25 分钟，20%–50% B；25–40 分钟，50%–95% B；40–45 分钟，95% B。流速设定为 0.3 mL/min。进样量为 5 µL。
  2. 按照以下参数设置进行质谱研究。
    ​注：离子源：加热电喷雾电离（H-ESI）；扫描模式：在 DDA 采集模式下，同时采集正离子和负离子；在 DIA 采集模式下，分别采集正离子和负离子；离子源参数：喷雾电压 +3.5 kV（正离子）/ -2.8 kV（负离子）；鞘气流速 40 arb；辅助气流速 10 arb；吹扫气流速 1 arb；离子传输管温度：320 °C；脱溶剂温度：350 °C；S-透镜射频水平：55%。
    1. 数据依赖性采集（DDA）方法的建立与优化
      1. 对于全扫描质谱（Full MS），选择以下设置：
        ​注：分辨率：35,000；扫描范围：100–1000 m/z；自动增益控制（AGC）目标值：3e6；最大注入时间（Max IT）：100 ms。
      2. 对于数据依赖性二级质谱扫描（dd-MS2），选择以下设置：
        1. 在分子离子选择时，设定强度阈值为 5e4。排除不带电荷的离子和同位素峰（启用同位素排除）。采用动态排除策略，排除时间为 15 秒，质量容差为 ±10 ppm，以防止高丰度离子被重复选择。
        2. 在碎裂参数设置中，保持以下条件：隔离窗口：1.0 m/z；碎裂方法：高能碰撞解离（HCD）；归一化碰撞能量（NCE）：20、40、60 V；二级分辨率：17,500；AGC 目标值：1e5；最大注入时间：50 ms；TopN 策略：在每次扫描循环中选择丰度最高的前 3 个分子离子进行碎裂。
    2. DIA 方法的建立与优化
      1. 对于全扫描质谱（Full MS），使用与 DDA 方法相同的参数。
      2. 对于数据非依赖性二级质谱扫描（DIA-MS/MS），建立分段可变隔离窗口策略。
      3. 设定目标范围为 100–1000 m/z。根据优化色谱条件下获得的高质量 DDA 谱图，在整个 m/z 范围内依据离子丰度分布划分窗口。设置可变窗口以平衡各段的总离子丰度，避免饱和或信号不足。
      4. 优化至 30 个窗口，以平衡覆盖范围与循环时间。
        ​注：碎裂参数——碎裂方法：HCD；NCE：20、40、60 V；分辨率：17,500；AGC 目标值：1e6；最大注入时间：自动；分段可变窗口：30 m/z；循环次数：30。
      5. 基于每个隔离窗口段的中心分子量建立包含列表，例如 m/z 115、145、175、205…… 925、955、985。
    3. 数据采集过程
      1. 系统平衡：使用流动相平衡色谱柱至少 5 分钟。
      2. 预实验样品运行：按照制备步骤配制槐花散测试溶液。连续进样 5 次。评估系统稳定性（保留时间 RSD < 2%，总离子流强度 RSD < 5%）。
      3. 空白运行：注入甲醇空白溶液，用于背景扣除。
      4. 槐花散样品运行：以随机顺序对每个样品进行进样分析。每种扫描模式（DDA、DIA）均独立运行所有样品。
    4. 数据处理
      1. 化合物鉴定
        1. 将质谱获取的原始数据导入 Compound Discoverer 软件。建立针对未知组分的鉴定工作流程。进行峰提取与峰对齐处理。将实测的 MS/MS 谱图与 mzCloud 在线 MS/MS 数据库及 mzVault 本地 MS/MS 数据库进行匹配。
        2. 应用以下过滤参数：峰面积阈值 105，母离子和子离子的质量偏差 ±5 ppm，匹配得分 ≥80。将过滤后的离子与数据库、对照品及文献中的化合物信息进行比对，以鉴定化学成分。
        3. Compound Discoverer 软件中的具体操作：创建新的分析流程，选择 天然产物/天然产物未知物鉴定（含统计分析及在线与本地数据库搜索） 工作流程。
        4. 确保工作流程中包含“Detect Compounds”节点以实现峰的识别与提取。添加 Search mzCloud 和 Search mzVault 数据库至工作流程中。
        5. 添加原始数据文件，并设置过滤参数（峰面积阈值 105，母离子和子离子质量偏差 ±5 ppm）。点击 运行 执行分析。
      2. 相关指标的比较分析
        1. 鉴定数量：比较 DDA 和 DIA 模式下在正离子和负离子模式中鉴定出的化合物总数。构建各模式下的离子分布图。
        2. 重复性研究：比较 DDA 与 DIA 模式下代表性高丰度化合物（芦丁、槲皮苷）、中等丰度化合物（新橙皮苷、柚皮苷）和低丰度化合物（补骨脂酚、三甲基秋水仙酸）的保留时间（RT）和峰面积（AA）差异（n = 5）。
        3. MS/MS 谱图质量：评估 Q-Marker 中关键化合物胡薄荷酮在 DDA 和 DIA 模式下的 MS/MS 碎片离子谱图质量。
        4. 低丰度组分的检测：比较 DDA 和 DIA 模式下对代表性低丰度化合物（香芹酮、腺苷）的 MS/MS 碎片检测情况5。

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结果

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化合物的总体鉴定

两种采集模式下怀化散粉的总离子流色谱图如图2所示，整体差异较小。在DDA采集模式下，正负离子模式共鉴定出14,958种化合物，而在DIA采集模式下共鉴定出9,489种化合物（图3A）。其中，DIA模式下匹配得分较高（≥80）的化合物比例高于DDA模式（DDA：6.50 %；DIA：10.63 %）（图3B）。正负离子模式下DDA与DIA的离子分布图如图3C-F所示。上述结果表明，该实验方法可有效区分两种模式在鉴定能力上的差异。

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讨论

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本研究中尤其值得指出的是，我们发现，在DIA采集模式下，分段可变窗口的数值设置不宜过大。我们曾尝试将其设置为300mz和100mz，但最终的谱图效果较差。经过反复探索和尝试，最终确定30mz的采集窗口为最适宜的选择。因此，采集窗口的设置对实验的成败具有至关重要的影响。

同时，还进行了预实验，以考察在DIA模式下分别采集和同时采集正负离子对实验结果的影响。当正负离子同时扫描时，整体谱图质量和分辨率较差，主要原因是循环时间过长，导致每种模式下的二级质谱数量过少。相应地，化合物的色谱峰采样点数量也会减少，无法满足检测要求。因此，选择分别对正离子和负离子进行单独扫描。

本研究以经典复方槐花散为模型系统，实证展示了数据依赖采集（DDA）与数据非依赖采集（DIA）模式在分析中药复杂成分时的根本差异。DIA 模式凭借其无偏倚的采集特性（例如覆盖 100–1000 m/z 的分段可变窗口策略），显著增强了对低丰度成分的检测能力（图5）。这一优势源于其对整个 ...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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本研究由四川省自然科学基金青年项目（编号：2025ZNSFSC1823）、四川省科技创新苗子工程（MZGC20230055）以及成都中医药大学资助 "邢霖学者" 托育人才专项培养计划学科人才科研提升项目（MPRC2022017）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈Thermo Fisher/色谱纯度
Compound Discoverer 3.3 软件Thermo Fisher/质谱数据处理与化合物鉴定
fructus aurantii四川内江220709槐花散处方中的药材
Platycladus orientalis 叶山东临沂240619槐花散处方中的药材
Schizonepeta spike江苏泰州240601槐花散处方中的药材
槐花四川广安241017槐花散处方中的药材
超声波清洗机洁拓超声波清洗设备有限公司240HT槐花散成分提取
UPLC-Q-Orbitrap HRMSThermo Fisher/高分辨质谱仪
水屈臣氏公司/超纯水

参考文献

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DDA MS MS

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