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方法文章

一种用于免疫细胞分析的坏死性小肠结肠炎新生小鼠模型及固有层分离方法

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DOI：

10.3791/69233

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2025年9月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

本文内容

摘要

本方案概述了一种坏死性小肠结肠炎（NEC）的新生小鼠模型，以及随后从新生小鼠小肠固有层中分离免疫细胞的方法。

摘要

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）是一种新生儿肠道的严重炎症性疾病，主要影响早产儿。NEC 的特征包括肠上皮损伤、微生物群失衡以及免疫反应失调，常导致肠组织坏死和全身性炎症。能够模拟人类疾病关键特征的实验性小鼠模型，对于深入理解疾病发生机制并推动治疗策略研发至关重要。本实验方案描述了一种成熟的新生儿小鼠 NEC 模型，通过配方奶喂养、间歇性缺氧、口服脂多糖（LPS）以及接种自一名 NEC 患儿分离培养的肠道细菌来诱导疾病。该组合方法可稳定诱导出与人类婴儿 NEC 一致的组织病理学、转录组学及免疫学特征，并已在该领域多项关键研究中发挥基础性作用。此外，本方案还详细介绍了从新生小鼠小肠固有层中分离免疫细胞的方法。固有层免疫细胞的分离为深入分析免疫细胞组成和功能提供了技术基础 坏死性小肠结肠炎，新生儿小鼠模型，配方奶喂养，间歇性缺氧，脂多糖，肠道细菌，免疫细胞分离，固有层，免疫表型分析 通过 流式细胞术，有助于分析肠道内先天性和适应性细胞群体。

引言

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）是一种严重的肠道炎症性疾病，几乎仅影响早产新生儿。约7%–8%的极低出生体重婴儿（<1500 克）的新生儿会受到坏死性小肠结肠炎（NEC）影响，需要外科干预的新生儿中，该病相关死亡率可接近 50%1坏死性小肠结肠炎的发病机制尚未完全阐明；然而，现有证据表明，该病源于多种因素的共同作用，包括肠屏障发育不成熟、免疫信号调控失调以及肠道微生物群失衡。2,3,4这些因素的共同作用可启动并加剧肠道内的炎症反应，尤其是通过激活Toll样受体4（TLR4），导致上皮损伤及多种类型的细胞死亡，包括凋亡和坏死。5,6本实验方案旨在提供一种可重复且具有生理相关性的新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）小鼠模型，该模型能够重现肠道炎症及 肠壁积气 （肠壁内气体）在人类新生儿中被观察到，从而能够对疾病发病机制进行机制性研究。此外，本方案描述了从新生小鼠小肠固有层中分离免疫细胞的方法，使研究人员能够进行免疫细胞谱型分析 通过 流式细胞术

与较大的动物模型（如新生大鼠或新生仔猪）7,8 相比，新生小鼠模型具有多项显著优势，包括成本较低、更容易获得转基因动物，以及能够在更大样本量的群体中开展实验。小鼠坏死性小肠结肠炎（NEC）模型主要通过配方奶喂养、冷应激和缺氧的组合方式，模拟在人类患者中观察到的NEC复杂病理生理过程7,8,9。然而，许多小鼠NEC模型受限于对广泛微生物应激源或人为改变肠道菌群的依赖，这可能削弱其临床相关性。相比之下，本实验方案所描述的模型通过整合人类婴儿NEC发病机制中多个关键因素，克服了上述局限10,11。具体而言，该模型结合了已被证实可破坏肠道屏障完整性的缺氧应激3,12，以及口服添加脂多糖（LPS）的婴儿配方奶——LPS是一种特征明确的TLR4配体，可诱导肠道炎症；同时还引入了具有临床相关性的生态失调菌群，即从一名患有NEC totalis（疾病最严重形式，以全肠段坏死为特征）的患者体内分离培养的肠道细菌10,13。通过整合这些具有临床相关性和疾病特异性的应激因素，本模型能够准确反映NEC的临床和分子特征。此外，为了为研究人员提供一个探究NEC发病机制中免疫介导过程的框架，本方案详细阐述了从新生小鼠小肠固有层中分离细胞以进行流式细胞术分析的方法。作为肠道黏膜免疫活动的主要部位，固有层包含一系列动态变化的常驻和浸润性免疫细胞，在NEC相关炎症中发挥核心作用14。流式细胞术提供了一个强大且可扩展的平台，能够高分辨率地表征这些免疫细胞群体，实现对细胞表型的精细分析、免疫反应的定量评估，以及识别参与NEC发病机制的免疫学特征15。

本方案所述的小鼠NEC模型可作为补充 体外 通过在新生肠道的复杂环境中研究宿主-微生物组相互作用、免疫反应以及炎症信号传导，为坏死性小肠结肠炎（NEC）发病机制中一些无法模拟的关键方面提供了模型支持。 体外，使其成为阐明疾病机制和评估治疗策略的有力工具。尽管物种间的特异性差异仍是该模型的局限性，但它为深入理解坏死性小肠结肠炎（NEC）并加速靶向干预措施的开发提供了一个可靠且易于使用的平台。

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方案

所有方法均遵循北卡罗来纳大学教堂山分校医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）提供的伦理指南进行。小鼠的繁殖、维持和饲养均按照IACUC批准的研究方案（方案编号：24-114）中所述《实验动物护理和使用指南》的程序进行。本研究中所有实验均使用C57BL/6J小鼠。幼鼠于出生后第4天开始进入模型，体重介于1.8–2.3 g之间；超出此体重范围的动物被排除。实验队列的性别分布均衡，雄性和雌性各约占处理动物的50%。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 小鼠坏死性小肠结肠炎模型

注意：肠源性细菌储备液的制备来源于患有最严重形式坏死性小肠结肠炎（即全型坏死性小肠结肠炎，NEC totalis）的婴儿的肠道内容物13,16。将肠道内容物在37 °C条件下以1 × g转速培养过夜16小时，随后在4 °C下以3000 × g离心10分钟，并用50%甘油重悬。取20 µL分装至冻存管中，于-80 °C长期保存。本方案中选定的培养时间旨在提高实验流程效率，可根据各实验室的具体安排灵活调整时间点，而不会影响整体模型效果。此外，本方案优化适用于最多40只小鼠的实验规模，但可根据需要进行相应扩增。

  1. 制备细菌培养物
    1. 在实验第0天15:00，加入20 µ从一名婴儿体内培养出的肠道细菌的L等分试样 全结肠坏死性小肠结肠炎 加入至含有2 mL LB（Luria-Bertani）液体培养基的15 mL培养管中。将培养管管盖置于通气位置，在37℃恒温振荡摇床中培养细菌。°C，1 × g，4℃过夜孵育16小时，同时将仅含2 mL LB肉汤的培养管作为对照进行培养，以检测LB是否存在污染。
      1. 通过比较细菌培养物与透明的仅含LB培养基的对照组之间的浊度，目视确认过夜培养结果；只有当细菌培养物呈现浑浊而对照组保持透明时，方可继续后续操作。
    2. 实验第1天上午7:00，分装125 µ将过夜培养的接种液 25 mL 加入含 25 mL LB 肉汤的带通气盖 T75 细胞培养瓶中。共准备四个 T75 培养瓶，并将其直立放置于 37°C 摇床中培养°C，1 × g，于37°C振荡培养2小时以扩增细菌培养物。
      注意：在坏死性小肠结肠炎模型的实验第0、1和2天制备过夜培养物。
  2. 将幼崽分配至实验组
    1. 实验第1天上午7:00，称量出生第4天的幼鼠体重。
      ​注意：最佳体重范围为1.8-2.3 g，超出该范围的个体应从实验中剔除。
    2. 将实验小鼠分为配方奶喂养组和母鼠喂养组，并计算配方奶喂养小鼠的平均体重。将指定的配方奶喂养小鼠与母鼠分离，放入预热至37℃的婴儿培养箱中的新笼具内 °C. 将由母鼠哺育的幼鼠与母鼠一同保留在原始鼠笼中。
      注意：新生小鼠对环境温度的变化特别敏感。为了在与母鼠分离后维持稳定的体温调节，喂食配方奶的幼鼠应置于温度控制在37℃的婴儿恒温箱中饲养。 °C. 该方法与既定的新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）方案一致，在不使用额外热干预措施的情况下维持生理温度11,17,18,19.
    3. 在实验第2天和第3天重复操作，每天在07:00喂养时间点之前称量配方奶喂养小鼠的体重，并计算平均体重。
  3. 测量细菌培养物的光密度（OD）
    1. 孵育37℃ 2小时后 °C 和 1 × g在实验第1、2、3天，从轨道摇床取下四瓶扩增培养的T75培养瓶，合并四瓶培养物，充分混匀后，用移液器吸取1 mL细菌培养液加入比色皿中。
      1. 通过向比色皿中加入 1 mL 无菌 LB 肉汤制备空白溶液。在 600 nm 处测定细菌培养物的光密度（OD600 nm使用分光光度计。
        注意：目标OD600 nm 是 0.6 ± 0.02。如果OD600 nm 若细菌培养物的OD值低于目标值，继续按照步骤1.3.1所述进行培养，直至达到目标OD值600 nm 0.6 ± 0.02 时。如果 OD600 nm 大于0.6时，用无菌LB肉汤稀释细菌培养物。
    2. 将80 mL细菌培养物分装至两个50 mL离心管中，于3000 x g 4℃下10分钟 °C. 通过检查每根试管底部是否有可见沉淀来确认培养是否成功。
  4. 配方制备
    1. 在实验第1、2、3天的09:00开始配制配方液。将16 mL婴儿配方奶与8 mL幼犬奶粉按2:1比例混合，置于无菌50 mL离心管中。
    2. 从含有菌体沉淀的两个50 mL离心管中移去上清液（步骤1.3.2）。
    3. 将两个沉淀物分别用2 mL配方混合液充分重悬，并将重悬液转移至配方混合液中，制成24 mL的NEC配方液。
      注意：NEC配方中的最终细菌浓度应在4至5 × 10之间9 CFU/mL
    4. 为六个喂食时间点（10:00、13:00、16:00、19:00、22:00、07:00）分别标记六个50 mL离心管。
    5. 将4 mL NEC配方移液至每个已标记的试管中。
    6. 制备六份LPS（5 mg/mL）储备液的单次使用分装样品，置于低吸附性微量离心管中，于-20℃保存°C. 在每个时间点喂养前，立即向NEC配方中加入LPS（LPS浓度见注释）。
      注意：添加到NEC配方中的LPS量基于每天07:00计算的配方喂养幼鼠的平均体重，剂量为5 µ每克幼崽体重给予 g LPS。最终的 LPS 浓度随体重变化而变化。例如，当给药体积为 80 µL 和平均每窝幼崽体重为 2 克时，配方中的 LPS 浓度为 0.125 mg/mL。
  5. 喂养
    注意：实验第1天，用于建立坏死性小肠结肠炎（NEC）模型的小鼠在与母鼠分离后需禁食3小时。首次给予NEC配方奶的时间为10:00，之后每3小时喂养一次，直至22:00。实验第2天和第3天，小鼠分别在07:00、10:00、13:00、16:00、19:00和22:00进行喂养。实验第4天不进行喂养。
    1. 在给小鼠喂食前立即解冻一份数量的LPS并涡旋振荡15秒。根据小鼠的平均体重，将适量LPS加入已准备好的4 mL NEC配方管中（计算方法见步骤1.4.6），并通过移液充分混匀。
    2. 用1 mL注射器抽取NEC配方液，并连接新生儿经外周静脉置入的中心静脉导管（PICC）管路。确保注射器及PICC管路中无气泡或空气。
    3. 给幼鼠灌胃NEC配方 通过 经外周静脉置入中心静脉导管进行口服灌胃。
      1. 轻轻抓住每只幼鼠颈部基部的松弛皮肤，将小鼠保持直立姿势。使用镊子将PICC管的远端引导进入口咽和食管，使PICC管尖端位于胃内。
        注意：PICC 导管的插入长度等于从口角到胃部乳斑顶端的距离。应使用永久性记号笔在 PICC 导管上明确标记最佳插入点。
      2. 若在置入PICC导管过程中感到明显阻力，应撤出导管，重新调整位置后谨慎再次尝试置入。
      3. 分配 8 µ将NEC配方液缓慢注入胃内，喂养过程中密切监测幼崽是否出现误吸迹象。观察是否有白色乳斑出现，以确认胃内给药成功。
      4. 移除PICC导管。观察幼犬是否有呼吸困难或呕吐现象。若幼犬反流配方奶，应用低絮实验室擦拭纸轻拭其口鼻部。
    4. 在每次喂养时间点重复此过程。
    5. 每天两次，在13:00和19:00喂食后立即对幼崽进行10分钟的低氧处理。
      1. 每天喂养两次后，将幼崽放入与气体罐相连的缺氧室中，气体罐内含有95%氮气和5%氧气。打开气罐阀门，使用手持式监测仪监测密闭缺氧室内的氧气浓度。当缺氧室内的氧气浓度降至5%时± 0.5% 氧气，将幼崽维持在此氧浓度水平10分钟。
        注意：应优化流速，使氧气浓度在2分钟内以稳定、可控的速率从20%降至5%。
    6. 在喂养间隔期间观察幼鼠是否有呼吸困难、苍白变色或呼吸暂停等迹象。若出现上述症状，立即将受影响的幼鼠移出低氧舱，密切观察其恢复情况；必要时，根据IACUC政策对幼鼠实施安乐死。
    7. 在NEC模型的整个72小时期间，按预定时间点持续进行灌胃喂养和低氧暴露。
      注意：如果实验第1天从周一上午10:00开始，则72小时终点将落在周四上午10:00，此时间点被定义为模型的第4天。在模型第4天上午07:00不给小鼠喂食，并于最终时间点（上午10:00）处死小鼠以采集组织。
  6. 安乐死动物并采集组织
    1. 在模型建立的第4天早晨，称量每只仔鼠的体重并记录其性别，然后根据IACUC指南实施安乐死。
    2. 安乐死后，将每只幼鼠的血液收集至含有促凝剂和凝胶的血清分离管中。
    3. 在 16,000 x g 条件下离心 g 4℃下20分钟 °C 以分离血清。用移液器将血清转移至已标记的 1.7 mL 离心管中，并于 -80 保存 °C.
    4. 沿腹壁中线做1-2 cm切口，穿透腹壁和腹膜，暴露胃肠道。观察外露肠段是否存在坏死性小肠结肠炎（NEC）的典型特征，包括肠管扩张、红斑、肠壁内积气（肠壁积气）以及可见的气泡。
    5. 通过远端直肠识别并切除十二指肠。将组织置于冰上的培养皿中。使用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗肠道。
    6. 找到盲肠，并在近端切断，以分离盲肠和结肠与小肠。从回肠远端开始，向空肠方向逐段截取组织。取1 cm组织片段置于含有RNA裂解缓冲液和1.5 mm氧化锆珠的离心管中，冰上保存，用于转录分析。
      1. 用连接24 G钝头针头并装有PBS的注射器冲洗一段1.5 cm的组织，然后将其放入含有1 mL 4%多聚甲醛（PFA）的微量离心管中。将一段1 cm的肠组织速冻，并于-80℃保存 °用于蛋白质分析。取一段1厘米长的肠组织，速冻后于-80℃保存。 °C 用于任何其他检测。
    7. 将收集到RNA裂解缓冲液中的组织在珠磨机中处理（5.50 m/s，1.0 min，循环次数 = 1.0，暂停间隔：10 s，4℃） °C）匀浆组织，然后于 -80 保存 °C.
  7. 组织固定
    1. 将收集在4% PFA中的组织块置于4℃摇床上 °C，固定24小时。24小时后，从每支试管中移除4% PFA，并加入1 mL PBS洗涤组织。将试管放回4°C摇床中 °在4℃下孵育15分钟。重复PBS洗涤一次。
      1. 移除 PBS，向每根试管中加入 1 mL 50% 乙醇，并将试管放回 4 ℃摇床中 °C 下 15 分钟。去除 50% 乙醇，加入 1 mL 70% 乙醇，于 4 °直至组织可被处理成石蜡包埋切片样本。
        注意：可根据需要额外采集肠段或粪便样本用于进一步分析。

2. 固有层免疫细胞的分离

注意：本方案适用于分离约一周龄新生小鼠的固有层细胞。若需用于光谱流式细胞术的参考样本，可使用断奶期小鼠（出生后第3-4周）。对于断奶期样本，应将本方案中指定的所有试剂体积加倍。

  1. 准备试剂
    1. 制备不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 1x Hank's 平衡盐溶液（HBSS W/O），其中含有 10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），并在室温下保存。
    2. 通过将 5% 牛血清白蛋白（BSA）溶解于含 5 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）的 PBS 中制备荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液，并在 4 °C 下保存。
    3. 在进行固有层细胞分离的前一天，向 HBSS W/O 中加入 5 mM EDTA、5% 胎牛血清（FBS）和 1 mM 二硫苏糖醇（DTT），制备预消化溶液。
    4. 在进行固有层细胞分离前立即配制消化溶液，即在 Roswell Park Memorial Institute 1640 培养基（RPMI）中添加 10% FBS 和  mg/mL 胶原酶 IV。
      注意：HBSS W/O 可预先配制并在室温下保存。FACS 缓冲液应提前配制并在 4 °C 下保存。预消化和消化溶液必须在进行固有层分离前立即新鲜配制，并置于冰上。
  2. 收集并准备用于消化的肠道组织
    1. 定位盲肠，并在其近端切断以移除盲肠和结肠。切除 2–3 cm 的远端小肠（回肠），并将其置于培养皿中冰冷的 HBSS W/O 上（从步骤 1.6.5 继续）。
    2. 使用连接在注射器上的 24 G 钝端针头，在用镊子固定组织的同时，用冰冷的 HBSS W/O 完全冲洗肠腔。冲洗后目视确认肠腔内无粪便残留。
    3. 使用精细镊子或剪刀小心去除肠段上残留的任何结缔组织。
    4. 沿纵向切开肠道使其展开，然后横向切成 1–1. cm 的小段。
  3. 固有层组织解离
    1. 将肠段转移至含有 1 mL 预先冰上冷却的预消化溶液的 1 mL 离心管中。
    2. 将样品在 37 °C 下孵育 20 分钟，并持续旋转以促进组织解离。
    3. 轻轻摇动离心管，然后将内容物倒入置于 5 mL 离心管上的 10 µm 细胞滤筛中。
      注意：通过 10 µm 滤筛收集的滤液含有上皮内淋巴细胞（IELs），可根据需要用于后续分析。
    4. 将组织碎片转移至新的 15 mL 离心管中，加入 10 mL 预热至 37 °C 的消化溶液。随后在 37 °C 下孵育 40 分钟，并持续旋转。
    5. 将整个样品转移至自动组织解离管中，运行解离程序，包括四个各 15 秒的旋转循环，顺时针与逆时针方向交替进行。
      注意：若无自动组织解离仪，可使用两张载玻片的磨砂端手动研磨肠道组织。若采用此方法，应施加轻柔且均匀的压力，避免过度机械应力，因为这会显著降低细胞活力。
    6. 轻轻涡旋细胞悬液，然后在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
    7. 小心吸除上清液而不扰动沉淀，然后将细胞重悬于  mL 冰冷的 FACS 缓冲液中。
    8. 将 10 µm 细胞滤筛置于 5 mL 离心管上。将重悬的细胞悬液通过滤膜过滤，再用额外的  mL 冰冷 FACS 缓冲液冲洗滤膜。
    9. 使用台盼蓝或活率染料对细胞进行计数并评估活力。将用于流式细胞术所需的体积在 4 °C 下以 30 × g 离心 5 分钟。立即用于后续实验，以保持细胞活力和标志物表达。

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结果

本方案所述的新生小鼠坏死性小肠结肠炎（NEC）模型可再现该疾病的关键特征。Kaplan-Meier生存分析（图1A) 显示，与亲代喂养对照组相比，NEC治疗组的存活率显著降低（9/21 vs. 8/8； p = 0.0063）。对接受模型处理的小鼠肠道进行大体检查（图1B) 表现出 NEC 的典型特征，包括肠管扩张、气泡和可见的 肠壁积气 （肠壁内气体积聚）。组织学评估 通过 H&E染色进一步证实，在具有类似坏死性小肠结肠炎（NEC）肠道损伤的动物中存在局灶性绒毛破坏以及正常肠道结构的紊乱。此外，炎症相关基因表达的分子分析显示，若干关键促炎标志物显著上调，这些标志物亦与人类疾病相关。与哺乳母鼠喂养的对照小鼠相比，暴露于实验性NEC的小鼠表现出显著升高的mRNA水平，包括 Il1b (p = 0.0049), Cxcl2 (p = 0.0081），以及 Lcn2 (

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讨论

本方案结合了具有生理相关性的新生小鼠坏死性小肠结肠炎（NEC）模型与固有层免疫细胞的分离技术，提供了一个全面的研究平台，可用于探究肠道炎症期间黏膜免疫应答。通过整合临床上相关的干预因素，例如来自人类NEC病例的肠道微生物组、缺氧应激以及配方奶喂养，该模型可重现人类疾病中所观察到的复杂且多因素的发病机制10,13。该方法能够对同一份肠组织样本进行详细的免疫表型分析，同时开展转录组学和蛋白质组学研究，从而为NEC的病理生理机制提供独特见解，并可用于评估潜在治疗方法。本文将讨论研究人员在实施过程中应关注的关键要点与局限性，以优化实验结果，提升模型的转化相关性及成功率。

本方案包含多个可能需要优化的技术变量，以减少实验差异性、降低总体死亡率并提高样本质量。以下描述了关键注意事项。在进行灌胃操作时，若经外周插入中心静脉导管（PICC）导管位置不当，可能导致误吸和反流，进而引发呼吸窘迫11。为防止此类情况发生，应确保PICC导管完...

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披露

作者声明本论文不存在利益冲突。

致谢

本手稿由R01DK124614、R01HD105301、DP1DK140012、Chan Zuckerberg倡议基金项目编号2022-316749、Yang生物医学学者奖以及北卡罗来纳大学教堂山分校儿科系资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器-结核菌素滑动接头Becton Dickinson309659用于配方喂养的注射器
1.5 mL 半微量一次性比色皿BRAND GMBH + CO KG759085D
1.7 ml 微量离心管 透明Axygen - 康宁公司MCT-175-C非化脓性 &且无RNase/DNase
5% 氧气，余量为氮气，有证标准物质，200 高压钢瓶，CGA 580 接头AirgasX02NI95C2003186
抗小鼠 CD16/CD32 纯化克隆：93eBioscience 公司 14-0161-85
抗小鼠 CD16/CD32 纯化克隆：93eBioscience 公司 14-0161-86
APC 抗小鼠 Ly-6C 克隆：HK1.4 同型：大鼠 IgG2cBioLegend128015
autoMACS 冲洗液Miltenyi Biotec130-091-222
BB515 大鼠抗小鼠 CD11b 单克隆抗体：M1/70BD 生物科学564455
BB700 大鼠抗小鼠 CD4 单克隆抗体：RM4-5BD 生物科学566408
BD Microtainer SSTBecton Dickinson365867血清管
BIOTIX Rainin LTS 兼容带架滤芯吸头，p1200Fisher Scientific12-111-365
BIOTIX Rainin LTS 兼容带架滤芯吸头，p20Fisher Scientific12-111-366
BIOTIX Rainin LTS 兼容带架滤芯吸头，p200Fisher Scientific12-111-362
Brilliant Stain 缓冲液BD 生物科学563795
BUV615 大鼠抗小鼠 Ly-6G 单克隆抗体：1A8BD 生物科学751263
BV650 大鼠抗小鼠 I-A/I-E 单克隆抗体：M5/114.15.2BD 生物科学563415
C57BL/6J新生小鼠杰克逊实验室000664
CD45-VioGreen 小鼠Miltenyi Biotec 130-102-412
CD64 抗体（抗小鼠，PE-Vio 770 标记，REAfinity，克隆 REA286）Miltenyi Biotec 130-119-659
CFX Opus 实时荧光定量 PCR 系统 伯乐（Bio-Rad）12011319
IV型胶原酶沃辛顿生化公司 LS004188
DL-二硫苏糖醇 SigmaD9779-5g
eBioscience FOXP3/转录因子染色缓冲液套装Life Technologies Corp. 00-5523-00
EDTA（0.5 M），pH 8.0Quality Biological Inc351-027-721
Esbilac 幼犬代乳粉Pet-Ag, Inc.99502-1幼犬乳液
Fisherbrand 一次性比色皿Fisher Scientific14-955-127
Fisherbrand 无菌聚苯乙烯一次性刻度吸管（带放大条，纸/塑料包装），10 mLFisher Scientific13-678-11E
Fisherbrand 无菌聚苯乙烯一次性刻度吸管（带放大条，纸/塑料包装），25 mLFisher Scientific13-678-11
Fisherbrand 无菌聚苯乙烯一次性刻度吸管（带放大条，纸/塑料包装），50 mLFisher Scientific13-678-11F
Fisherbrand 无菌聚苯乙烯一次性刻度吸管（带放大条，纸/塑料包装），5 mLFisher Scientific13-678-11D
Genie Temp-Shaker 300USA Scientific, Inc.SI-G1600
gentleMACS 组织解离器（程序；m_intestine-01）Miltenyi Biotec 130-093-235
gentleMACS  C 管Miltenyi Biotec 130096334
Ghost Dye 红 780 活性染料Tonbo Biosciences13-0865-T100
甘油 ReagentPlusSigma-AldrichG7757-500ML
GraphPad Prism 软件，版本 10.0GraphPadN/A
Greiner Bio-One 圆底聚丙烯培养管，带双位置通气塞Fisher Scientific07-000-212
Handi+ 氧气分析仪MaxtecN/A
Hanks' 平衡盐溶液Gibco141650-095
HEPES缓冲液Mediatech, Inc. 25-060-CI
缺氧培养箱Billups-Rothenburg, Inc.N/A
ImageJ施耐德等人，2012N/A
Integra Miltex MeisterHand 睫状体剪刀，10.2 cmFisher Scientific12-460-655
Integra Miltex MeisterHand 睫状体剪刀，9 cmFisher Scientific12-460-598
Integra Miltex™ 瑞士珠宝匠风格镊子Fisher Scientific12-460-110
Isolette 婴儿培养箱Air-Shields VickersC100-200-2 系列 02小鼠培养箱
Kimtech Science Kimwipes 精密任务擦拭纸金佰利34120
LPSSigma-AldrichL3129-10mg
LB培养基，Miller分子遗传学级粉末Fisher ScientificBP1426-500
MACS BSA 储存液Miltenyi Biotec 130-091-376
MACSmix 管式旋转仪Miltenyi Biotec 130-090-753
微量离心管赛默飞世尔科技34511.5 ml，透明，带刻度，无菌
NanoDrop OneC 微体积紫外-可见分光光度计赛默飞世尔科技ND-ONEC-W
Ohaus scout 便携式天平Fisher Scientific30253024
多聚甲醛赛默飞世尔科技J61899.AK
PE 大鼠抗小鼠 TIM-4 克隆：RMT4-54BD 生物科学564147
PE-CF594 小鼠抗小鼠 CD24 单克隆抗体，克隆号：M1/69BD 生物科学562477
外周插入中心静脉导管，1.9 法规，单腔Utah Medical Products, Inc.P-2S单腔硅胶外周插入中心导管
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco 10010023
快速-RNA MicroPrep 试剂盒Zymo ResearchR1051
Rainin 移液器 - 1000 μLRainin17014382
Rainin 移液器 - 200 μLRainin17014390
Rainin 移液器 - 20 μLRainin17014392
RB780 仓鼠抗小鼠 CD11c 单克隆抗体：HL3BD 生物科学755338
RPMI 1640 培养基（1x）Gibco11875-093
Similac Advance 雅培营养53363婴儿配方奶粉
Sorvall ST8R 离心机Fisher Scientific75007200
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix伯乐（Bio-Rad）1725271
直而细的锐头剪刀Miltex 仪器MH5-300
T100热循环仪Bio-Rad621BR71229
赛默飞世尔科技 Nunc 50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管，蓝色架Fisher Scientific12-565-271
赛默飞世尔科技 S1 移液管助吸器Fisher Scientific14387166
组织培养瓶Fischer ScientificFB01293775 cm2 ，通气盖，经组织培养处理，无菌
True-Stain 单核细胞阻断剂BioLegend426102
双级黄铜通用气瓶减压器 0-50 psiAirgasY12215B580-AG
Vortex-Genie 2USA Scientific, Inc.NC9864336
世界精密仪器 虹膜镊，10 cm，弯曲型，带齿，德国产Fisher Scientific50-822-332
世界精密仪器公司 虹膜镊，10 cm，直型，带齿Fisher Scientific50-822-329
ZymoScript RT 预混试剂盒Zymo ResearchR3012
引物
序列
Cxcl2 （小鼠）定量PCR正向引物Integrated DNA TechnologiesCCAGACAGAAGTCATAGCCACT
Cxcl2 （小鼠）定量 PCR 反向引物Integrated DNA TechnologiesGGCACATCAGGTACGATCCA
Il1b （小鼠）定量PCR正向引物Integrated DNA TechnologiesAGTGTGGATCCCAAGCAATACCCA
Il1b （小鼠）定量PCR反向引物Integrated DNA TechnologiesTGTCCTGACCACTGTTGTTTCCCA
LCN2 （小鼠）定量PCR的上游引物Integrated DNA TechnologiesGACTTCCGGAGCGATCAGTT
LCN2 （小鼠）定量PCR反向引物Integrated DNA TechnologiesCTGTACCTGAGGATACCTGTGC

参考文献

  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of necrotizing enterocolitis: A systematic review and meta-analysis. BMC Pediatr. 20 (1), 344(2020).
  2. Warner, B. B., Tarr, P. I. Necrotizing enterocolitis and preterm infant gut bacteria. Semin Fetal Neonatal Med. 21 (6), 394-399 (2016).
  3. Rose, A. T., Patel, R. M. A critical analysis of risk factors for necrotizing enterocolitis. Semin Fetal Neonatal Med. 23 (6), 374-379 (2018).
  4. Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: Modeling the innate immune response. Am J Pathol. 185 (1), 4-16 (2015).
  5. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair1. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  6. Hackam, D. J., Sodhi, C. P. Toll-like receptor-mediated intestinal inflammatory imbalance in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 6 (2), 229-238.e1 (2018).
  7. Sulistyo, A., Rahman, A., Biouss, G., Antounians, L., Zani, A. Animal models of necrotizing enterocolitis: Review of the literature and state of the art. Innov Surg Sci. 3 (2), 87-92 (2018).
  8. Lopez, C. M., et al. Models of necrotizing enterocolitis. Semin Perinatol. 47 (1), 151695(2023).
  9. Jilling, T., et al. The roles of bacteria and TLR4 in rat and murine models of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 177 (5), 3273-3282 (2006).
  10. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A mouse model of necrotizing enterocolitis. Methods Mol Biol. 2321, 101-110 (2021).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protoc. 2 (4), 100951(2021).
  12. Kaplina, A., et al. Necrotizing enterocolitis: The role of hypoxia, gut microbiome, and microbial metabolites. Int J Mol Sci. 24 (3), 2471(2023).
  13. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus hn001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: Evidence in mice for a role of TLR9. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  14. Denning, T. L., Bhatia, A. M., Kane, A. F., Patel, R. M., Denning, P. W. Pathogenesis of nec: Role of the innate and adaptive immune response. Semin Perinatol. 41 (1), 15-28 (2017).
  15. Yu, Y. -R. A., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLOS ONE. 11 (3), e0150606(2016).
  16. Mihi, B., et al. Interleukin-22 signaling attenuates necrotizing enterocolitis by promoting epithelial cell regeneration. Cell Rep Med. 2 (6), 100320(2021).
  17. Bautista, G. M., Cera, A. J., Chaaban, H., Mcelroy, S. J. State-of-the-art review and update of in vivo models of necrotizing enterocolitis. Front Pediatr. 11, 1161342(2023).
  18. Sodhi, C. P., et al. The human milk oligosaccharides 2'-fucosyllactose and 6'-sialyllactose protect against the development of necrotizing enterocolitis by inhibiting toll-like receptor 4 signaling. Pediatr Res. 89 (1), 91-101 (2021).
  19. Blum, L., Vincent, D., Boettcher, M., Knopf, J. Immunological aspects of necrotizing enterocolitis models: A review. Front Immunol. 15, 1434281(2024).
  20. Nolan, L. S., et al. Indole-3-carbinol-dependent aryl hydrocarbon receptor signaling attenuates the inflammatory response in experimental necrotizing enterocolitis. Immunohorizons. 5 (4), 193-209 (2021).
  21. Valle-Noguera, A., Gómez-Sánchez, M. J., Girard-Madoux, M. J. H., Cruz-Adalia, A. Optimized protocol for characterization of mouse gut innate lymphoid cells. Front Immunol. 11, 563414(2020).
  22. Booth, J. S., et al. Characterization and functional properties of gastric tissue-resident memory T cells from children, adults, and the elderly. Front Immunol. 5, 294(2014).

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