本方案概述了一种坏死性小肠结肠炎（NEC）的新生小鼠模型，以及随后从新生小鼠小肠固有层中分离免疫细胞的方法。
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摘要
摘要
坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）是一种新生儿肠道的严重炎症性疾病，主要影响早产儿。NEC 的特征包括肠上皮损伤、微生物群失衡以及免疫反应失调，常导致肠组织坏死和全身性炎症。能够模拟人类疾病关键特征的实验性小鼠模型，对于深入理解疾病发生机制并推动治疗策略研发至关重要。本实验方案描述了一种成熟的新生儿小鼠 NEC 模型，通过配方奶喂养、间歇性缺氧、口服脂多糖（LPS）以及接种自一名 NEC 患儿分离培养的肠道细菌来诱导疾病。该组合方法可稳定诱导出与人类婴儿 NEC 一致的组织病理学、转录组学及免疫学特征，并已在该领域多项关键研究中发挥基础性作用。此外，本方案还详细介绍了从新生小鼠小肠固有层中分离免疫细胞的方法。固有层免疫细胞的分离为深入分析免疫细胞组成和功能提供了技术基础 坏死性小肠结肠炎，新生儿小鼠模型，配方奶喂养，间歇性缺氧，脂多糖，肠道细菌，免疫细胞分离，固有层，免疫表型分析 通过 流式细胞术，有助于分析肠道内先天性和适应性细胞群体。
引言
坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）是一种严重的肠道炎症性疾病，几乎仅影响早产新生儿。约7%–8%的极低出生体重婴儿（<1500 克）的新生儿会受到坏死性小肠结肠炎（NEC）影响，需要外科干预的新生儿中，该病相关死亡率可接近 50%1坏死性小肠结肠炎的发病机制尚未完全阐明；然而，现有证据表明，该病源于多种因素的共同作用，包括肠屏障发育不成熟、免疫信号调控失调以及肠道微生物群失衡。2,3,4这些因素的共同作用可启动并加剧肠道内的炎症反应，尤其是通过激活Toll样受体4（TLR4），导致上皮损伤及多种类型的细胞死亡，包括凋亡和坏死。5,6本实验方案旨在提供一种可重复且具有生理相关性的新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）小鼠模型，该模型能够重现肠道炎症及 肠壁积气 （肠壁内气体）在人类新生儿中被观察到，从而能够对疾病发病机制进行机制性研究。此外，本方案描述了从新生小鼠小肠固有层中分离免疫细胞的方法，使研究人员能够进行免疫细胞谱型分析 通过 流式细胞术
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方案
所有方法均遵循北卡罗来纳大学教堂山分校医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）提供的伦理指南进行。小鼠的繁殖、维持和饲养均按照IACUC批准的研究方案（方案编号：24-114）中所述《实验动物护理和使用指南》中的程序进行。本研究中所有实验均使用C57BL/6J小鼠。幼鼠于出生后第4天开始进入模型，体重介于1.8–2.3 g之间；超出此体重范围的动物被排除。实验队列的性别分布均衡，雄性和雌性各约占处理动物的50%。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 小鼠坏死性小肠结肠炎模型
注意：肠道细菌储备液的制备来源于患有最严重形式坏死性小肠结肠炎（即全型坏死性小肠结肠炎，NEC totalis）的婴儿的肠道内容物13,16。将肠道内容物在37 °C条件下，以1 × g转速培养过夜16小时，随后在4 °C下以3000 × g离心10分钟，并用50%甘油重悬。取20 µL分装至冻存管中，于-80 °C长期保存。本方案中选定的培养时间旨在提高实验流程效率，可根据各实验室的具体安排灵活调整时间点，而不会影响整体模型效果。此外，本方案优化适用于最多40只小鼠的实验规模，但可根据需要进行相应放大。
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结果
本方案所述的新生小鼠坏死性小肠结肠炎模型重现了该疾病的关键特征。Kaplan-Meier生存分析（图 1A) 结果显示，与母鼠喂养的对照组相比，NEC处理组的存活率显著降低（9/21 vs. 8/8； p = 0.0063）。对接受该模型处理的小鼠肠道进行大体检查时发现图 1B) 表现出坏死性小肠结肠炎的典型特征，包括肠管扩张、气泡形成及肉眼可见的 肠壁囊样积气症 （肠壁内气体蓄积）。组织学评估 通过 H&伊红染色进一步证实，在发生坏死性小肠结肠炎样肠道损伤的动物中，存在斑片状绒毛破坏区域及正常肠道结构的紊乱。此外，炎症基因表达的分子分析显示，与人类疾病相关的关键促炎标志物出现显著上调。与母鼠喂养的对照组小鼠相比，暴露于实验性坏死性小肠结肠炎的小鼠表现出显著升高的 Il1b (p = 0.0049), Cxcl2 (p = 0.0081），且 Lcn2 (p
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讨论
本方案结合了具有生理相关性的新生小鼠坏死性小肠结肠炎（NEC）模型与固有层免疫细胞的分离技术，提供了一个全面的研究平台，可用于探究肠道炎症期间黏膜免疫应答。通过整合临床上相关的干预因素，例如来自人类NEC病例的肠道微生物组、缺氧应激以及配方奶喂养，该模型可重现人类疾病中所观察到的复杂且多因素的发病机制10,13。该方法能够对同一份肠组织样本进行详细的免疫表型分析，同时开展转录组学和蛋白质组学研究，从而为NEC的病理生理机制提供独特见解，并可用于评估潜在治疗方法。本文将讨论研究人员在实施过程中应关注的关键要点与局限性，以优化实验结果，提升模型的转化相关性及成功率。
本方案包含多个可能需要优化的技术变量，以减少实验差异性、降低总体死亡率并提高样本质量。以下描述了关键注意事项。在进行灌胃操作时，若经外周插入中心静脉导管（PICC）导管位置不当，可能导致误吸和反流，进而引发呼吸窘迫11。为防止此类情况发生，应确保PICC导管完.......
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披露
作者声明本论文不存在利益冲突。
致谢
本手稿由R01DK124614、R01HD105301、DP1DK140012、Chan Zuckerberg倡议基金项目编号2022-316749、Yang生物医学学者奖以及北卡罗来纳大学教堂山分校儿科系资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器-结核菌素滑动接头 | Becton Dickinson | 309659 | 用于配方喂养的注射器 |
| 1.5 mL 半微量一次性比色皿 | BRAND GMBH + CO KG | 759085D | |
| 1.7 ml 微量离心管 透明 | Axygen - 康宁公司 | MCT-175-C | 非化脓性 &且无RNase/DNase |
| 5% 氧气，余量为氮气，有证标准物质，200 高压钢瓶，CGA 580 接头 | Airgas | X02NI95C2003186 | |
| 抗小鼠 CD16/CD32 纯化克隆：93 | eBioscience 公司 | 14-0161-85 | |
| 抗小鼠 CD16/CD32 纯化克隆：93 | eBioscience 公司 | 14-0161-86 | |
| APC 抗小鼠 Ly-6C 克隆：HK1.4 同型：大鼠 IgG2c | BioLegend | 128015 | |
| autoMACS 冲洗液 | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| BB515 大鼠抗小鼠 CD11b 单克隆抗体：M1/70 | BD 生物科学 | 564455 | |
| BB700 大鼠抗小鼠 CD4 单克隆抗体：RM4-5 | BD 生物科学 | 566408 | |
| BD Microtainer SST | Becton Dickinson | 365867 | 血清管 |
| BIOTIX Rainin LTS 兼容带架滤芯吸头，p1200 | Fisher Scientific | 12-111-365 | |
| BIOTIX Rainin LTS 兼容带架滤芯吸头，p20 | Fisher Scientific | 12-111-366 | |
| BIOTIX Rainin LTS 兼容带架滤芯吸头，p200 | Fisher Scientific | 12-111-362 | |
| Brilliant Stain 缓冲液 | BD 生物科学 | 563795 | |
| BUV615 大鼠抗小鼠 Ly-6G 单克隆抗体：1A8 | BD 生物科学 | 751263 | |
| BV650 大鼠抗小鼠 I-A/I-E 单克隆抗体：M5/114.15.2 | BD 生物科学 | 563415 | |
| C57BL/6J新生小鼠 | 杰克逊实验室 | 000664 | |
| CD45-VioGreen 小鼠 | Miltenyi Biotec | 130-102-412 | |
| CD64 抗体（抗小鼠，PE-Vio 770 标记，REAfinity，克隆 REA286） | Miltenyi Biotec | 130-119-659 | |
| CFX Opus 实时荧光定量 PCR 系统 | 伯乐（Bio-Rad） | 12011319 | |
| IV型胶原酶 | 沃辛顿生化公司 | LS004188 | |
| DL-二硫苏糖醇 | Sigma | D9779-5g | |
| eBioscience FOXP3/转录因子染色缓冲液套装 | Life Technologies Corp. | 00-5523-00 | |
| EDTA（0.5 M），pH 8.0 | Quality Biological Inc | 351-027-721 | |
| Esbilac 幼犬代乳粉 | Pet-Ag, Inc. | 99502-1 | 幼犬乳液 |
| Fisherbrand 一次性比色皿 | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Fisherbrand 无菌聚苯乙烯一次性刻度吸管（带放大条，纸/塑料包装），10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Fisherbrand 无菌聚苯乙烯一次性刻度吸管（带放大条，纸/塑料包装），25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Fisherbrand 无菌聚苯乙烯一次性刻度吸管（带放大条，纸/塑料包装），50 mL | Fisher Scientific | 13-678-11F | |
| Fisherbrand 无菌聚苯乙烯一次性刻度吸管（带放大条，纸/塑料包装），5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Genie Temp-Shaker 300 | USA Scientific, Inc. | SI-G1600 | |
| gentleMACS 组织解离器（程序；m_intestine-01） | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C 管 | Miltenyi Biotec | 130096334 | |
| Ghost Dye 红 780 活性染料 | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| 甘油 ReagentPlus | Sigma-Aldrich | G7757-500ML | |
| GraphPad Prism 软件，版本 10.0 | GraphPad | N/A | |
| Greiner Bio-One 圆底聚丙烯培养管，带双位置通气塞 | Fisher Scientific | 07-000-212 | |
| Handi+ 氧气分析仪 | Maxtec | N/A | |
| Hanks' 平衡盐溶液 | Gibco | 141650-095 | |
| HEPES缓冲液 | Mediatech, Inc. | 25-060-CI | |
| 缺氧培养箱 | Billups-Rothenburg, Inc. | N/A | |
| ImageJ | 施耐德等人，2012 | N/A | |
| Integra Miltex MeisterHand 睫状体剪刀，10.2 cm | Fisher Scientific | 12-460-655 | |
| Integra Miltex MeisterHand 睫状体剪刀，9 cm | Fisher Scientific | 12-460-598 | |
| Integra Miltex™ 瑞士珠宝匠风格镊子 | Fisher Scientific | 12-460-110 | |
| Isolette 婴儿培养箱 | Air-Shields Vickers | C100-200-2 系列 02 | 小鼠培养箱 |
| Kimtech Science Kimwipes 精密任务擦拭纸 | 金佰利 | 34120 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L3129-10mg | |
| LB培养基，Miller分子遗传学级粉末 | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| MACS BSA 储存液 | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACSmix 管式旋转仪 | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| 微量离心管 | 赛默飞世尔科技 | 3451 | 1.5 ml，透明，带刻度，无菌 |
| NanoDrop OneC 微体积紫外-可见分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | ND-ONEC-W | |
| Ohaus scout 便携式天平 | Fisher Scientific | 30253024 | |
| 多聚甲醛 | 赛默飞世尔科技 | J61899.AK | |
| PE 大鼠抗小鼠 TIM-4 克隆：RMT4-54 | BD 生物科学 | 564147 | |
| PE-CF594 小鼠抗小鼠 CD24 单克隆抗体，克隆号：M1/69 | BD 生物科学 | 562477 | |
| 外周插入中心静脉导管，1.9 法规，单腔 | Utah Medical Products, Inc. | P-2S | 单腔硅胶外周插入中心导管 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 10010023 | |
| 快速-RNA MicroPrep 试剂盒 | Zymo Research | R1051 | |
| Rainin 移液器 - 1000 μL | Rainin | 17014382 | |
| Rainin 移液器 - 200 μL | Rainin | 17014390 | |
| Rainin 移液器 - 20 μL | Rainin | 17014392 | |
| RB780 仓鼠抗小鼠 CD11c 单克隆抗体：HL3 | BD 生物科学 | 755338 | |
| RPMI 1640 培养基（1x） | Gibco | 11875-093 | |
| Similac Advance | 雅培营养 | 53363 | 婴儿配方奶粉 |
| Sorvall ST8R 离心机 | Fisher Scientific | 75007200 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | 伯乐（Bio-Rad） | 1725271 | |
| 直而细的锐头剪刀 | Miltex 仪器 | MH5-300 | |
| T100热循环仪 | Bio-Rad | 621BR71229 | |
| 赛默飞世尔科技 Nunc 50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管，蓝色架 | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| 赛默飞世尔科技 S1 移液管助吸器 | Fisher Scientific | 14387166 | |
| 组织培养瓶 | Fischer Scientific | FB012937 | 75 cm2 ，通气盖，经组织培养处理，无菌 |
| True-Stain 单核细胞阻断剂 | BioLegend | 426102 | |
| 双级黄铜通用气瓶减压器 0-50 psi | Airgas | Y12215B580-AG | |
| Vortex-Genie 2 | USA Scientific, Inc. | NC9864336 | |
| 世界精密仪器 虹膜镊，10 cm，弯曲型，带齿，德国产 | Fisher Scientific | 50-822-332 | |
| 世界精密仪器公司 虹膜镊，10 cm，直型，带齿 | Fisher Scientific | 50-822-329 | |
| ZymoScript RT 预混试剂盒 | Zymo Research | R3012 | |
| 引物 | |||
| 序列 | |||
| Cxcl2 （小鼠）定量PCR正向引物 | Integrated DNA Technologies | CCAGACAGAAGTCATAGCCACT | |
| Cxcl2 （小鼠）定量 PCR 反向引物 | Integrated DNA Technologies | GGCACATCAGGTACGATCCA | |
| Il1b （小鼠）定量PCR正向引物 | Integrated DNA Technologies | AGTGTGGATCCCAAGCAATACCCA | |
| Il1b （小鼠）定量PCR反向引物 | Integrated DNA Technologies | TGTCCTGACCACTGTTGTTTCCCA | |
| LCN2 （小鼠）定量PCR的上游引物 | Integrated DNA Technologies | GACTTCCGGAGCGATCAGTT | |
| LCN2 （小鼠）定量PCR反向引物 | Integrated DNA Technologies | CTGTACCTGAGGATACCTGTGC |
参考文献
- Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of necrotizing enterocolitis: A systematic review and meta-analysis. BMC Pediatr. 20 (1), 344(2020).
- Warner, B. B., Tarr, P. I. Necrotizing enterocolitis and preterm infant gut bacteria. Semin Fetal Neon....
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