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使用视黄醇同位素稀释技术配制用于人体受试者给药的维生素A示踪剂量

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DOI：

10.3791/69240

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2026年3月31日

 , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Fera Science Ltd

本文内容

摘要

制备用于视黄醇同位素稀释技术的稳定同位素标记维生素A，必须符合食品安全标准。本方案展示了在植物油中配制剂量的方法，其浓度适用于所选的递送系统和所采用的分析平台。

摘要

视黄醇同位素稀释（RID）技术依赖于向人体受试者施用同位素标记的维生素A示踪剂。本文介绍了一种方法，旨在指导研究团队如何为科研研究和人群调查制备维生素A稳定同位素示踪剂。文章概述了示踪剂的制备流程、材料来源、所需设备以及相关操作步骤，以确保示踪剂适合人体摄入且安全可靠。维生素A稳定同位素示踪剂可从商业途径获得，通常以氘[2H]或碳-13[13C]标记，其全反式异构体纯度>95%，同位素富集度>99%。制备维生素A稳定同位素示踪剂的过程包括通过超声和加热将示踪剂溶解于可食用植物油中。示踪剂的浓度需控制在递送系统可容纳的体积范围内。最后，将示踪剂分装至无菌棕色玻璃小瓶中，并通过分光光度法确认其浓度。

引言

为了有效监测旨在减少维生素A缺乏症的干预项目，视黄醇同位素稀释法（retinol isotope dilution, RID）已成功应用于获取不同人群总体维生素A储存量（total body vitamin A stores, TBS）的信息1,2,3,4。尽管血清视黄醇5、血清视黄醇结合蛋白（retinol binding protein, RBP）6,7,8以及改良相对剂量反应（modified relative dose response, MRDR）试验9常被用于确认维生素A缺乏状态，但RID是唯一能够在整个范围内——从亚临床缺乏到中毒——准确量化总体维生素A储存量的方法3,10。通过给予已知剂量的标记维生素A，并在达到平衡后测定其在血浆中的稀释程度，RID方法可精确估算TBS及肝脏维生素A储备量11,12。重要的是，即使在存在炎症的人群中，RID方法仍保持可靠，因此在评估干预措施有效性以及重叠进行的补充和强化项目中的毒性风险方面具有不可替代的作用13,14。

为了实施RID方法，需要以视黄醇酯的形式口服给予同位素标记的维生素A，大多数情况下使用的是溶解在可食用植物油中的视黄醇醋酸酯。大多数实验室会从商业供应商处获得同位素标记的维生素A1,3,7,15,16,17,18,19,20,21,22。几乎所有市售的维生素A同位素示踪剂均使用碳-13 [13C] 或氘 [2H] 等稳定同位素进行标记（表1）。所选用同位素剂量的选择取决于用于测定血清或血浆中质量标记视黄醇浓度的分析仪器。气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）可同时分析 [13C] 和 [2H]22,23,24,25,26,27，而气相色谱-燃烧-同位素比值质谱（GC-C-IRMS）仅能分析 [13C] 标记的视黄醇示踪剂4,25,28。所选分析仪器的检测限、目标人群（儿童或成人）以及研究持续时间将决定所需给予剂量的大小3,25,29。迄今为止，儿童应用的同位素剂量范围为0.3–4.3 mg视黄醇当量（RE；相当于1–15 µmol RE）3,4,30，成人为0.6–10.0 mg RE（相当于2–35 µmol RE）2,3,31，而较新的研究中儿童剂量较低，为0.3–0.6 mg RE（1–3 µmol RE），成人则为0.6–2.0 mg RE（2–7 µmol RE）。尽管曾有人担忧剂量中维生素A的质量过高可能干扰维生素A的内在代谢动力学，但最近一项基于房室模型的分析证实，儿童剂量高达7 µmol RE、成人高达14 µmol RE时，仍不会影响总身体储存（TBS）预测的准确性29。本文将演示如何为RID方法制备用于口服的同位素标记示踪剂，并兼顾食品安全问题及准确剂量浓度的获取。同位素剂量的制备对RID方法至关重要。

方案

研究1在注册英国临床研究网络（UKCRN：7413）之前，已获得英国国家研究伦理服务机构东北桑德兰委员会的批准（REC 09/H0904/20）。研究2获得了菲律宾大学马尼拉分校研究伦理委员会（IRB ID：UPMREB 2016-282-01）、加州大学戴维斯分校机构审查委员会（IRB ID：903681-2）的批准，并在ClinicalTrials.gov注册（ID：NCT03030339）。研究2是比尔及梅琳达·盖茨基金会资助的GloVitAS项目（OPP1115464：评估大规模食品强化及其他干预措施导致维生素A毒性的风险）的一部分。Georg Lietz是GloVitAS项目的首席研究员，负责监督现场研究的实施。研究方案的概述见图1。

1. 纳入与排除标准

  1. 对于研究1，给定的标准为： 纳入标准：纳入年龄在18至45岁之间的健康男性和女性志愿者。排除标准：排除妊娠、吸烟、高血压、糖尿病、BMI >30，肝/肾/胃肠道疾病，脂质代谢紊乱，以及在研究开始前3个月内服用多种维生素（含维生素A、C、E）或β-胡萝卜素补充剂。
  2. 对于研究2， 给定的标准为： 纳入标准：纳入在研究期间持续居住于研究区域内的12至18月龄儿童。 排除标准：若儿童未接受高剂量维生素A补充，且居住在本地市场无维生素A强化食品供应的地区，则予以排除。

2. 确定用于RID的稳定同位素示踪剂的总量

  1. 根据异构体纯度确定每位受试者应接受的稳定同位素示踪剂剂量。建议使用全反式纯度 >95% 的维生素A稳定同位素，因为不同几何异构体之间的生物学活性和代谢途径存在显著差异。根据视黄醇当量（RE）计算剂量水平。计算方法示例见表2。
  2. 将剂量水平乘以受试者总人数。受试者总人数应基于统计功效计算所需的样本量，并根据预期的失访率进行增加（示例见表2）。同时考虑移液过程中可能产生的损耗（最高可达20%），相应增加所需示踪剂的总量。
    注意：通常情况下，同位素制剂需要准备过量，因为无法从瓶中完全回收所有物质。由于油剂黏附在移液枪头外壁，还会进一步造成损失。为在给药时获得准确的剂量体积，需将移液枪头外壁多余的油剂擦拭干净。操作人员可通过避免将移液枪头插入油剂过深来尽量减少移液损失。

3. 确定溶解稳定同位素示踪剂所需的植物油量

  1. 确定所使用的植物油种类及每位受试者的给药体积（表2）。根据受试者给药时所采用的递送系统，确定所需添加的油量。
    注：我们使用葵花籽油，因其维生素E含量较高，有助于维持维生素A制剂的稳定性32,33。然而，其他研究团队也曾使用其他类型的植物油以符合当地饮食习惯。由于RID方法依赖于稳定同位素标记示踪剂的准确递送，建议使用正向置换移液器将溶于食用油中的剂量进行配制和施用。最近的多数研究中使用的给药体积最高达250 µL，特别是在对儿童给药时1,7,23。
  2. 计算稳定同位素示踪剂在植物油中的浓度 [mg/mL]。确定所需植物油的总体积。根据计算出的体积和植物油的相对密度，计算所需油的质量（示例见表2）。
    注：为确保准确性，建议在配制稳定同位素示踪剂时对油进行称重。在计算出所需油的总体积后，即可订购稳定同位素标记的示踪剂。重要的是，应要求供应商将同位素示踪剂装在足够大体积的瓶中，以便研究团队可直接将植物油称量加入含有同位素标记示踪剂的瓶子中。

4. 在专用食品制备区域制备稳定同位素标记示踪剂

  1. 小心打开装有预定总量稳定同位素示踪剂的棕色瓶盖，并将其放置在分析天平上，然后将天平归零。
  2. 使用无菌的10 mL注射器逐滴加入油，直至达到所需重量（准确度为±0.1 g）。
    注意：由于部分视黄醇乙酸酯晶体可能残留在棕色瓶盖内，因此需非常小心地打开瓶盖。在向棕色瓶中加入植物油后，需小心地将瓶盖重新盖上，然后用手轻轻振荡，以重新悬浮仍残留在瓶盖内的视黄醇乙酸酯晶体。
  3. 将瓶子放入超声水浴中，超声功率为14 W/L，工作频率为44 kHz。加水至高于瓶内油面但低于瓶盖的位置，以防止水意外进入样品中。
  4. 超声处理15分钟后，用手轻轻混匀，再继续超声处理15分钟。必须注意超声水浴的温度不得超过50 °C。
    注意：使用葵花籽油配制时，我们发现当剂量在50 °C下暴露30分钟时，不会发生向cis视黄醇类化合物的异构化（见图2）。然而，仍应通过高效液相色谱法（HPLC）分析样品，以评估热诱导异构化的程度。
  5. 将瓶子置于50 °C的恒温水浴中30分钟，以彻底溶解微晶。
  6. 在实验室中取20 µL油样，在光学显微镜下以200倍放大观察是否存在微晶。若发现微晶，则需重复超声和加热步骤。
  7. 确认完全溶解后，将全部油样分装至2–4 mL无菌棕色玻璃小瓶中。此操作应使用正向置换移液器，以避免交叉污染。
    注意：分装至棕色玻璃小瓶中的稳定同位素示踪剂量可根据每日受试者招募数量确定。例如，若每天招募5名受试者，每剂量体积为150 µL，则每小瓶应包含足够5次剂量并考虑移液损耗的体积：5 × 150 µL × 1.2 = 900 µL。
  8. 以三份平行样测定稳定同位素浓度。在配制稳定同位素标记示踪剂时，另取200 µL纯植物油（用于制备分光光度测定空白）和200–350 µL稳定同位素剂量，分别储存于独立的2 mL棕色小瓶中。
    1. 若剂量浓度≤0.5 mg RE，则在独立的2 mL棕色小瓶中保留350 µL稳定同位素；若剂量浓度>0.5 mg RE，则在独立的2 mL棕色小瓶中保留200 µL稳定同位素剂量。
  9. 用惰性气体（Ar）对小瓶进行吹扫，以延缓同位素标记示踪剂可能发生的氧化，随后紧密封口，并储存于冷冻盒中。冷冻盒上应标注同位素浓度、剂量体积（后续确定）、配制日期和项目名称。将冷冻盒存放在-20 °C食品级冰箱中直至运输。在此条件下，示踪剂剂量至少可稳定保存2年。

5. 实验室内稳定同位素示踪剂浓度的测定

  1. 用正己烷在3个容量瓶中稀释稳定同位素示踪剂。在加入示踪剂剂量前，先将容量瓶用正己烷加至刻度线下1 cm处。
    1. 根据示踪剂剂量浓度确定稳定同位素示踪剂的稀释倍数。若稳定同位素示踪剂的剂量浓度 ≤ 0.5 mg RE，取100 µL稳定同位素剂量加入50 mL容量瓶中，用正己烷定容；若剂量浓度在0.5 – 2 mg RE之间，则取50 µL稳定同位素剂量加入50 mL容量瓶中，用正己烷定容；若剂量浓度 >2 mg RE，则取50 µL稳定同位素剂量加入100 mL容量瓶中，用正己烷定容。
    2. 使用玻璃巴斯德吸管直接将50或100 µL油样加入正己烷中，并用额外的正己烷将容量瓶定容至50或100 mL。倒置摇动容量瓶10次，使油与正己烷充分混合。
      警告：正己烷应在通风橱中操作，并佩戴适当的个人防护装备（PPE）。废正己烷应收集于专用容器中，由经批准的承包商进行专业处理。
  2. 通过移液器吸取与稳定同位素示踪剂相同体积的植物油（50或100 µL），将其加入正己烷中，制备分光光度法空白对照样品。确保所用稀释体积（50或100 mL）与稳定同位素示踪剂一致。倒置摇动容量瓶10次，使油与正己烷充分混合。
    注：无论是移取稳定同位素示踪剂还是纯油，均使用100 µL正排量移液器。为确保移液体积准确，必须使用无尘纸从上向下擦拭吸头外壁，以去除残留的示踪剂或油。擦拭一次性替换吸头时需格外小心，避免纸张接触吸头开口，否则会将吸头内部的油液吸出。
  3. 使用分光光度计在325 nm波长下，以植物油的正己烷溶液作为空白对照，在石英比色皿中测定稳定同位素示踪剂的浓度（示例见表3 ）。
    1. 首先使用植物油的正己烷溶液作为空白对照开始测量。每次测量之间用正己烷冲洗石英紫外比色皿3次。所有样品测量完成后，用纯正己烷仔细清洗比色皿。
  4. 根据平均吸光度（AU）读数，结合同位素特异性的摩尔消光系数，利用比尔-朗伯定律计算稳定同位素示踪剂的浓度。由此可计算每剂所需配制的稳定同位素示踪剂体积（参见下文代表性结果及表3中的示例）。

结果

总同位素示踪剂剂量大小的计算
针对一项包含100名受试者的研究，计算了[13C10]视黄基乙酸酯的总用量，以确定需要合成的[13C10]视黄基乙酸酯量（表2）。该用量基于统计功效分析所确定的所需样本量（n = 100）、预计失访人数（n = 15；失访率15%）、移液过程中的损失（20%）以及每剂[13C10]视黄基乙酸酯的视黄醇当量浓度（0.4 mg RE；依据所用质谱仪的灵敏度、实验持续时间及受试者年龄组而定）。由此得出所需的总视黄醇当量（55.2 mg RE）再换算为所需的[13C10]视黄基乙酸酯质量（63 mg）。

为计算溶解 [13C10]视黄醇乙酸酯所需葵花籽油的体积，我们首先将给药体积设定为 150 µL/剂量（0.15 mL/剂量）。随后，计算 [13C10]视黄醇乙酸酯在 1 mL 葵花籽油中的浓度（表 2）。将所需 [13C10]视黄醇乙酸酯的质量（63 mg）除以所需剂量浓度，即可得到所需葵花籽油的总体积。最后，通过葵花籽油的相对密度确定其质量。

通过分光光度计基于比尔-朗伯定律测定稳定同位素示踪剂浓度，确认了油中[13C10]视黄醇乙酸酯的目标剂量浓度的准确性（表3）。考虑测量过程中稳定同位素示踪剂的稀释因素（稀释倍数为500），得到油中[13C10]视黄醇乙酸酯的浓度为2.58 µmol/µL。因此，为获得0.4 mg RE剂量所需的稳定同位素示踪剂终体积确定为155 µL（表3）。

检测示踪剂剂量的潜在异构化
通过高效液相色谱法（HPLC）检测cis异构体的生成，以确定所获得示踪剂剂量的异构体纯度（图2）。操作时，取5.1.2步骤中稀释后的示踪剂溶液样品，在氮气下吹干，残留物重新溶解于100%乙醇中用于进样。采用Liu等人的方法34对3个重复样品进行HPLC分析，以检测是否存在cis-异构化现象（见图2）。在整个研究过程中应持续监测示踪剂剂量的纯度，以确保其未发生降解。

示踪剂剂量浓度对随时间变化的剂量分数的影响
不同剂量水平的应用将导致随时间推移摄入剂量的比例有所不同，这可能影响分析平台对[13C10]在所有受试者的指定时间点检测视黄醇水平。应用1 mg或0.4 mg剂量的[13C10成人油剂中醋酸视黄醇（retinyl acetate）图3A）或儿童（图3B) 表明，给予1 mg [相较于0.4 mg [13C10]视黄醇乙酸酯，并证实了所采用的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）检测[13C10]受试者在给药后长达28天内的视黄醇水平。这证实了在不同时间点获取剂量分数信息至关重要，可用于判断所施用的剂量水平是否足够高，以在所用分析平台的检测限之上获得可检测信号；此类信息 ideally 应在使用代表性样本进行的预试验研究中获得。

示踪剂制备示意图；剂量计算、油量测定、超声处理、分光光度测定步骤。
图1：维生素A示踪剂剂量的制备流程图。 稳定同位素剂量制备的关键步骤，包括所需用量的确定、获得的示踪剂浓度测定以及剂量纯度的确认。请点击此处查看该图的放大版本。

色谱结果、保留时间峰、样品A与B的比较图、分析化学。
图2：示踪剂量的高效液相色谱图，用于研究视黄醇乙酸酯的异构化反应。 通过高效液相色谱法分析每一步骤后的同位素剂量，评估了[13C10]视黄醇乙酸酯在（A）超声处理和（B）50 °C加热30分钟后的潜在异构化情况。分析采用二极管阵列检测器的高效液相色谱系统，并依据Liu等人的方法进行34。请点击此处查看该图的放大版本。

药物血浆分数随时间变化的药代动力学图，显示药物的吸收和消除过程。
图3：摄入[13C10]视黄醇乙酸酯后，血浆中视黄醇的剂量分数随时间变化的观测均值。 剂量分数数据来自（A）45名英国成年人16 和（B）112名菲律宾儿童1，他们分别接受了1 mg或0.4 mg的[13C10]视黄醇乙酸酯剂量。剂量分数计算公式为：{血浆中[13C]视黄醇浓度（µmol/L）× 估计血浆体积（L）/ [13C]剂量（µmol）}。数据以几何均数 ± 标准误（SEM）表示。请点击此处查看该图的放大版本。

稳定同位素供应商/制造商
[D4]-视黄醇乙酸酯Buchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[D6]-视黄醇乙酸酯Buchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[D8]-视黄醇乙酸酯Buchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[13C3]-视黄醇乙酸酯Buchem BV/ReseaChem GmbH
[13C4]-视黄醇乙酸酯Buchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[13C8]-视黄醇乙酸酯Buchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[13C10]-视黄醇乙酸酯Buchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory

表1：市面上可获得的稳定维生素A同位素示踪剂。 不同供应商提供的13C和2H标记的视黄醇乙酸酯示踪剂列表。

参数
样本量 [n]：100
失访数 [n] (%)：15 (15%)
移液损失：20%
MW [13C10]视黄醇乙酸酯：338.5 µg/µmol
MW [13C10]视黄醇：296.46 µg/µmol
给药剂量：每位志愿者 0.4 mg RE 的 [13C10]视黄醇乙酸酯
计算
所需RE总量：= 给药剂量（mg RE）× 样本量 × 失访系数 × 移液损失系数
= 0.4 mg RE × 100 × 1.15 × 1.2
= 55.2 mg RE
所需 [13C10]视黄醇乙酸酯总量：= mg RE × MW [13C10]视黄醇乙酸酯 / MW [13C10]视黄醇
= 55.2 mg RE × 338.5 µg/µmol / 296.46 µg/µmol
= 63.0 mg [13C10]视黄醇乙酸酯
油中 [13C10]视黄醇乙酸酯的给药浓度：[13C10]视黄醇乙酸酯 [mg/ml] =
(mg RE × MW [13C10]视黄醇乙酸酯 / MW [13C10]视黄醇) / 0.15 ml
= (0.4 mg RE × 338.5 µg/µmol / 296.46 µg/µmol) / 0.15 ml
= 3.04 mg/ml
所需葵花籽油总体积：= [13C10]视黄醇乙酸酯总质量 / 油中给药浓度
= 63.0 mg / 3.04 mg/ml
= 20.7 ml 油
所需葵花籽油质量：= 葵花籽油总体积 × 葵花籽油相对密度
= 20.7 ml × 0.92 g/ml
= 19.0 g 葵花籽油

表2：稳定同位素示踪剂剂量计算示例。 用于确定示踪剂剂量和植物油用量的参数及计算方法。

参数
摩尔消光系数（E1%1cm) 的[13C10]己烷中的醋酸视黄酯： 52718 L mol-1 cm-1 x 1 厘米
稀释倍数： 500 (100µL 50 mL 己烷中的油样制备
测定的平均吸光度：0.917
MW [13C10]视黄醇：296.46 µg/µmol
计算
浓度（mol/L）的[13C10]己烷中的醋酸视黄酯：浓度（mol/L）= 吸光度 / E1%1cm 比色皿光程长度（1 cm）
= 0.917 / 52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm = 1.739 x 10-5 mol/L
将浓度转换为 µmol/µL:浓度（mol/L）= 浓度（µmol/µL)
1.739 × 10-5 mol/L 相当于 1.739 × 10-5 µmol/µL
校正稀释倍数： 1.739 × 10-5 µmol/µL x 500 = 8.697 x 10-3 µmol/µL 在油中
重量每 µL (µg/µL):= [13C10]视黄醇乙酸酯 µmol/µL 在油中 x MW [13C10]视黄醇
= 8.697 × 10-3 µmol/µL x 296.45 µg/µmol = 2.58 µg/µL
每剂体积： = 体积 (µL/ 400 µg 剂量）= 400µg / 2.58 µg/µL = 155 µL

表3：稳定同位素示踪剂剂量浓度的确定。 用于确定示踪剂剂量浓度及口服给药所需体积的相关参数与计算方法。

讨论

在人体研究中使用的稳定同位素示踪剂通常被认为是安全的，在所应用的浓度下未见有不良生物学或生理学效应的报道25,35。然而，由于稳定同位素示踪剂需要经口给予，因此必须确保示踪剂剂量符合食品安全标准。这可以通过要求稳定同位素标记维生素A的供应商和生产商对所提供的同位素进行食品安全检测来实现7,20,24。同样，同位素的配制和储存必须仅在专门用于食品制备的区域进行。此外，用于配制稳定同位素的所有设备必须专用于同位素配制，并存放于食品制备区域内。

先前，标记同位素的醋酸视黄酯是使用乙醇溶解，然后在氮气下干燥，再溶于植物油中36。本文介绍一种通过超声和加热相结合的方法，将同位素标记的示踪剂直接溶解于植物油中的技术。尽管该方法在食品制备区域操作更为简便，但在加热溶解示踪剂时需格外小心。全反式视黄醇在加热过程中会异构化为13-cis-视黄醇，且随着温度升高，异构化速度加快37。视黄醇的异构化在光照条件下会进一步加剧32。此外，视黄醇的稳定性还受到植物油脂质氧化特性的影响32,38。由于植物油中α-生育酚的含量对维生素A的保留具有积极影响32，而葵花籽油的α-生育酚含量处于较高水平33，因此我们选择使用葵花籽油来配制示踪剂剂量。决定采用最高50°C的加热条件溶解示踪剂，是基于在化妆品生产中加热溶解视黄醇晶体且未造成显著损失的相关应用39。尽管在本方案所述条件下我们未观察到醋酸视黄酯的显著降解，但在加热处理后立即检测示踪剂剂量中是否存在cis异构化仍至关重要（图2）。我们进一步建议，在整个研究过程中应持续监测示踪剂剂量的稳定性，以确认所用示踪剂浓度的准确性。

示踪剂的配制浓度必须严格控制在给药系统容积限制范围内，以确保准确给予所需剂量。由于RID依赖于稳定同位素标记示踪剂的精确给药，建议使用正置换移液器进行剂量施用。尽管过去曾对成人给予高达1 mL的剂量16,20,40，但施用100–250 µL的体积更为方便，因为该体积范围已被证明在婴儿和儿童中具有良好的耐受性1。此外，剂量也可采用胶囊形式给予17，但必须选择专门设计以防止油泄漏并确保在研究人群中具有良好可接受性的胶囊。最后，所用剂量水平取决于目标人群的年龄组29、所用分析平台对低浓度物质的检测能力3以及目标人群的总体脂含量；总体脂含量越高，血浆中示踪剂剂量的占比越低1。

如上例所示，将浓度为 2.58 µg/µL 的[13C10]视黄醇醋酸酯溶于葵花籽油中，可在 155 µL 葵花籽油中提供 0.4 mg RE 的示踪剂剂量，该体积可使用 250 µL 正置换移液器准确递送。为了获得符合递送系统体积限制的浓度，必须使用分析天平（精确至 0.1 g）准确称量用于溶解示踪剂的植物油，并将其加入含有稳定同位素示踪剂的瓶中。例如，若需在葵花籽油中配制总质量为 63 mg、浓度为 3.04 mg/mL 的[13C10]视黄醇醋酸酯溶液，且葵花籽油在 25 ◦C 时的相对密度为 0.92 g/mL，则需向含有示踪剂的瓶中称取 19.0 g（20.7 mL × 0.92 g/mL）油。尽管最终的稳定同位素示踪剂浓度将通过分光光度计读数确认，但对同位素示踪剂及所用油的精确称量可确保所得浓度接近每剂所需的递送体积。

建议根据预期的每日用量分装油剂，以确保瓶内所有剂量在开瓶后2周内使用完毕。使用过程中，在野外应将油剂置于冰袋上保存，并在给药结束后尽快重新冷冻。尽管油剂不受反复冻融循环的影响，但在不使用时必须始终避光并冷冻保存。

综上所述，本实验方案详细阐述了用于RID方法的示踪剂剂量的精确制备与质量控制，以确保给药的准确性、稳定性和安全性。该方法可计算示踪剂的需求量，优化其在植物油中的溶解性，并通过紫外-可见光谱法和高效液相色谱法（HPLC）验证其纯度和浓度。严格的处理和储存规范可确保示踪剂的完整性，从而保证基于同位素评估结果的准确性。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本工作的支持由比尔 & 比尔及梅琳达·盖茨基金会（项目编号：OPP1115464）和维也纳国际原子能机构（IAEA）（项目编号：E4.30.30）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于分装剂量的2ml棕色玻璃小瓶Fisher11573690根据研究的样本量以及每日给药的受试者数量，使用更大容量（例如4ml）的棕色小瓶可能更为高效
100ml容量瓶Fisher11323644Pyrex硼硅酸盐玻璃A级认证容量瓶
50ml容量瓶Fisher11313644Pyrex硼硅酸盐玻璃A级认证容量瓶
分析天平 Fisher13592970
毛细管活塞（移液吸头）CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
毛细管活塞 CP1000ST 2x91GilsonF148180
毛细管活塞 CP250ST 6x96GilsonF148714
纸质冻存盒StarlabA9623-8181
Hellma UV石英比色皿SLSCEL1600
正己烷 95% n-己烷 HPLC级 经认证HPLC用FisherH/0406/17
2ml棕色玻璃小瓶的瓶盖Fisher11573542
Microman E M1000E移液器（正向置换式）GilsonFD10006
Microman E M100E移液器（正向置换式）GilsonFD10004
Microman E M250E移液器（正向置换式）GilsonFD10005
显微镜NikonEclipse E400
显微镜载玻片 Sigma41122601
超声水浴锅VWRUSC100T
分光光度计Thermo Fisher ScientificA51119600C
稳定同位素标记的醋酸视黄酯示踪剂Buchem BVN/ARID方法可使用多种稳定同位素。表1列出了不同 commercially available 的同位素。 
非搅拌式水浴锅SLSSLS1176
植物油任意杂货店N/A制备同位素剂量时，必须使用新鲜且保质期充足的植物油。
Volac无塞玻璃巴斯德移液管 150mmSLSPIP4150

参考文献

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使用视黄醇同位素稀释技术配制用于人体受试者给药的维生素A示踪剂量
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