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一种用于检测虫媒病毒抗体反应的多重血清学检测方法

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DOI：

10.3791/69259

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2025年11月4日

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1Infectious Diseases Epidemiology and Analytics G5 Unit, Department of Global Health, Institut Pasteur, Université Paris-Cité, INSERM U1347, 2Laboratory for Urgent Response to Biological Threats (CIBU), Environment and Infectious Risks (ERI) Unit, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 3Immunology of Infectious Diseases Unit, Institut Pasteur de Madagascar, 4MRC Centre for Infectious Disease Analysis and Modelling, School of Public Health, Imperial College London, 5Immunophysiopathology and Infectious Diseases Department, Institut Pasteur de Dakar, 6Pasteur Network, Institut Pasteur, 7Department of Immunology, Institut Pasteur

本文内容

摘要

多重荧光免疫测定正成为血清学检测的参考方法。然而，其应用受限于复杂且耗时的微球-分析物偶联过程。本报告介绍了一种半自动化、可重复的多重微球偶联方案，其效果与标准方法相当，但显著缩短了获得结果所需的时间。

摘要

节肢动物传播病毒（虫媒病毒）是一类通过蚊子传播、在全球范围内分布的病原体。自2016年寨卡病毒（ZIKV）在美洲暴发，使这类感染引起公众关注以来，虫媒病毒持续对公共卫生构成重大负担。其在以往非流行地区的出现已成为公共卫生关注的重点。目前，世界卫生组织（WHO）已将虫媒病毒感染的监测与防控列为优先事项，并于2024年启动了全球战略计划以应对虫媒病毒性疾病。Multiplex® 技术革新了血清学监测领域，可在仅需极小样本量的情况下同时检测多种抗体。基于在多重血清学检测开发方面的专业经验，研究人员建立了一种基于微球的多重检测方法，用于检测针对虫媒病毒抗原的抗体。该检测包含多种常见虫媒病毒的特异性抗原，包括登革病毒（DENV）、黄热病毒（YFV）、寨卡病毒和基孔肯雅病毒（CHIKV）。采用半自动化方法将抗原共价结合至微球上。这一新方案高效可靠，可在单次实验中完成多达96种抗原的偶联，同时确保结果具有良好的可重复性。中位荧光强度（MFI）数据通过用户友好的荧光成像系统获取。当应用于来自流行地区的人类血清样本时，预计该检测将成为血清学监测工作中的有力工具。

引言

虫媒病毒每年共同导致数千人死亡。这些病毒通过节肢动物传播给人类 通过 感染节肢动物，主要是蚊子和蜱虫。虫媒病毒感染的严重程度各异，从无症状感染到可导致死亡的重症疾病不等。2024年，世界卫生组织（WHO）仅登革病毒（DENV）的四种血清型就记录了超过10,000例死亡病例1同年，该病毒导致超过1400万人感染，其中包括5万例重症病例。1尽管登革病毒（DENV）是最为突出的虫媒病毒，但该类病毒还包括其他多种危及生命的病原体，已在全世界范围内引发多次疫情。近期一篇关于非洲虫媒病毒感染的综述总结指出，2023年这些病毒——包括登革病毒（DENV）、黄热病毒（YFV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）、裂谷热病毒（RVFV）、西尼罗病毒（WNV）和寨卡病毒（ZIKV）——在非洲大陆共导致至少29次疫情暴发。22022年，世界卫生组织非洲区域办事处发布的一份报告强调了该区域在虫媒病毒监测方面的现有局限性，指出迫切需要开发虫媒病毒监测与控制的方法。3.

由于虫媒病毒感染的症状与其他地方性病原体引起的症状相似，例如发热、关节痛和全身不适，因此其临床诊断具有挑战性4。此外，由于多种病毒可能共同流行并导致混合感染，因此难以区分具体的致病病原体5。实验室确诊对于鉴别诊断至关重要。目前已有多种方法可用于检测人体样本中的虫媒病毒。直接检测方法包括分子诊断检测、病毒抗原检测和病毒分离，用于检测病原体的存在；而间接方法（如血清学诊断）则通过检测机体对病毒感染产生的免疫反应来进行判断6。

已开发出多种用于检测针对节肢动物传播病毒（arboviruses）抗体反应的方法，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、补体结合试验、血凝抑制试验以及微球免疫分析法6,7。本报告介绍一种基于多重荧光微球的免疫分析法（FMIA），用于检测针对节肢动物传播病毒抗原的抗体反应。基于微球的检测方法8在血清学中被广泛应用，具有多项优势，其中最重要的是可在单次反应中以极小样本量同时检测多种分析物。该方法采用包被有目标重组抗原的光学编码微球（磁性聚苯乙烯微珠），进行间接血清学免疫检测。将偶联后的微珠与样本共同孵育，然后使用与藻红蛋白（Phycoerythrin, PE）荧光报告分子偶联的抗人IgG二抗来检测抗原特异性抗体。目前有多种分析仪可用于检测所发射的荧光信号，结果以平均荧光强度（MFI）表示。

该检测方法的原理详见 Angeloni 等人的研究8。简而言之，将感兴趣的抗原通过化学方法结合到颜色编码的微球上。具体操作中，首先使用1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚磺酸钠（sulfo-NHS）处理微球，以活化微球表面的羧基，形成一种可与氨基反应的中间产物。该中间产物随后与目标蛋白混合，使蛋白中的氨基与微球共价结合，从而生成表面稳定包被目标蛋白的微珠。将结合抗原的微珠与样本共同孵育，使抗体与特异性抗原结合。通过荧光染料标记的抗免疫球蛋白二抗检测与抗原结合的抗体。我们采用PE标记的二抗。使用光信号成像仪测量荧光强度（仪器详细信息见材料表）。该仪器配备两种LED光源——红色LED和绿色LED，分别用于激发微珠内部的染料以及微珠表面报告分子的荧光信号9。随后利用滤光片根据颜色对微珠进行分类，并定量分析待测物所发射的荧光信号。

我们此前已将该技术应用于检测针对SARS-CoV-210和疫苗可预防疾病11的抗体反应，并证明多重检测是血清流行率和监测研究中不可或缺的工具。本项目的目标是将荧光微球免疫分析法（FMIA）的应用扩展至检测针对多种属于虫媒病毒的抗原的抗体反应，并旨在将该检测方法应用于筛查非洲地区的样本。

已有文献报道使用不同抗原靶标（如非结构蛋白1（NS1）12,13或包膜蛋白结构域III（EDIII）14）的基于多重技术的虫媒病毒多重检测方法。本文介绍了一种50重检测方法，包含26种虫媒病毒抗原（包括NS1、EDIII、病毒样颗粒（VLPs）以及多种其他抗原），可用于检测在特定地区共同传播的病原体。该检测方法将有助于评估这些病原体的传播强度。表1列出了本检测方法开发中所使用的重组抗原的汇总信息。本报告中所述方案是在一项全面的方法学开发研究基础上建立的，该研究重点优化了虫媒病毒的检测效果。

通常，抗原与微球珠的偶联（或固定）是在单个试管中进行的8（手动偶联）。该过程耗时较长、操作繁琐，且容易出现重复性误差。本文报道了一种使用自动化仪器完成抗原与珠子化学结合过程中各连续步骤的实验方案。在本论文中，我们报告了为验证新方案所采取的步骤。通过比较使用50重荧光微球免疫分析法（FMIA）检测的IgG反应——其中抗原偶联珠子分别采用手动方法或自动化方案制备——对新方案进行了验证。进一步的方法学验证则通过对来自非洲和法国队列的人类血清样本进行分析而完成。

自动化的珠子偶联方案快速高效，可在单次运行中同时偶联多达96种分析物。更重要的是，其结果与传统手动方案所获得的结果相当，且批间变异更小。

方案

已获得适当的伦理批准，用于使用人源样本。样本为先前研究中匿名化的剩余样本。关于使用的方案 "标准池" ORPAL样本研究已获得苏里南国家伦理委员会（CMWO（Commissie voor Mensgebonden Wetenschappelijk Onderzoek），意见编号VG 25-17）的批准。 使用来自马达加斯加的样本已作为PvSTATEM项目的一部分获得批准 伦敦卫生与热带医学院 & 热带医学伦理委员会 (28541) 以及 马达加斯加生物医学研究伦理委员会 (135MSANP/SG/AMM/CERBM) 而使用塞内加尔样本已作为正在进行的Dielmo和Ndiop项目的一部分获得批准 塞内加尔国家卫生研究伦理委员会（CNERS Sénégal）. 检测这些样本中针对NTDs的抗体已获得塞内加尔国家伦理审查委员会（CNERS Sénégal，编号00000007 MSAS/CNERS/Sec）的批准。非流行区的法国样本来自法国医院实验室的常规医学检测，并依照法国数据保护委员会的现行法规和指南进行处理。法国国家信息与自由委员会）。人血清样本来自虫媒病毒高发地区的受试者以及未暴露过的法国人群。血清样本在使用前需在56 °C孵育30分钟以进行热灭活。若样本未灭活，则必须在生物安全柜内操作。大多数重组抗原为商业获取，唯独EDIII重组蛋白为实验室自行制备。基于成像的分析仪设备9 用于数据采集。所用试剂和设备见下文 材料表.

1. 确定用于偶联的最佳抗原浓度

注意：为防止光漂白，整个操作过程中应尽量减少微球珠暴露于光照。在进行大规模偶联之前，需使用手动偶联方案优化每种抗原的偶联浓度。本方案改编自 Angeloni 等人8。缓冲液和溶液详见补充表1。

  1. 选择用于偶联的磁珠区域。充分涡旋振荡20秒。将管子超声处理至少60秒。
  2. 将200 µL（2.5 M 磁珠）磁珠转移至1.5 mL离心管中。
  3. 用200 µL 100 mM 单碱基磷酸钠缓冲液/0.125x Triton洗涤磁珠。
    1. 将管子置于磁力架上60秒。小心移除上清液，避免接触磁珠。
    2. 加入单碱基磷酸钠缓冲液。继续放在磁力架上60秒，然后移除上清液。
  4. 使用含有80 µL 100 mM 单碱基磷酸钠、0.125x Triton、10 µL sulfo-NHS和10 µL EDC的缓冲液活化磁珠。
    1. 向各管中加入单碱基磷酸钠-sulfo-NHS-EDC混合液。在室温下避光孵育20分钟，同时使用滚轴混合器混匀。
    2. 用250 µL PBS（1x）和0.125x Triton洗涤磁珠，重复洗涤三次。
  5. 结合抗原。
    1. 在总体积为1 mL的1x PBS和0.125x Triton溶液中配制不同浓度（系列稀释）的抗原。至少测试两种抗原浓度。
    2. 将抗原溶液加入活化的磁珠中。在室温下避光孵育2小时，或在4 °C下过夜孵育，同时使用滚轴混合器混匀。
  6. 用500 µL PBS-TBN和0.125x Triton洗涤偶联后的磁珠，重复洗涤三次。
  7. 将偶联后的磁珠重悬于1 mL PBS-TBN和0.125x Triton溶液中。
    注：偶联后的磁珠在使用前应于4 °C保存至少24小时。若在偶联后立即检测，与24小时后检测相比，其平均荧光强度（MFI）会出现变异。
  8. 选择后续大规模偶联所用的最佳浓度。使用不同浓度的偶联磁珠对标准样本池进行免疫测定，选择能够获得线性标准曲线的最低浓度。
    注：抗体对标准样本池反应的线性示例见结果部分的图1。

2. 大规模自动化珠耦联

  1. 准备 Pro Magnetic COOH 磁珠。
    1. 计算所需磁珠数量：每份样品使用 500 个磁珠，250 万个磁珠足以用于 5000 个样品。
    2. 按照先前所述方法，准备用于偶联的磁珠区域。
    3. 将所需体积的磁珠转移至指定孔中。对于 250 万个磁珠，使用 200 µL 磁珠（标准 Luminex 浓度为 1.25e7 个磁珠/mL）。
  2. 准备抗原。这是确保抗原用量准确的关键步骤。
    1. 根据优化结果计算所需抗原的用量。各抗原所用浓度详见 表 1。
    2. 在 1.5 mL 微离心管中，将适量的目标抗原与 1x PBS / 0.125x Triton 充分混合，总体积为 1 mL。
  3. 用试剂准备微孔板。按以下方式准备 96 孔深孔板。各体积为每孔用量，按 250 万个磁珠偶联计算。
    1. 板 1（吸头梳）：装载吸头梳。
    2. 板 2（磁珠）：加入 8 µL 0.125x Triton 和 200 µL 目标磁珠区域。
    3. 板 3（洗涤 1）：加入 200 µL 100 mM 一碱磷酸钠 / 0.125x Triton。
    4. 板 4（活化）：加入 80 µL 100 mM 一碱磷酸钠 / 0.125x Triton + 10 µL sulfo-NHS + 10 µL EDC。
    5. 板 5（洗涤 2）：加入 250 µL 1x PBS / 0.125x Triton。
    6. 板 6（偶联）：将 1 mL 抗原溶液转移至指定孔中。
    7. 板 7（洗涤 3）：加入 500 µL PBS-TBN / 0.125x Triton。
    8. 板 8（最终板，含偶联磁珠）：加入 1 mL PBS-TBN + 0.125x Triton。
  4. 在自动化处理器中设置 偶联循环 运行程序。
    1. 按照制造商说明开启仪器并设置程序。相关软件可在 PC 上下载15。具体运行参数详见 补充表 2。
    2. 将微孔板装入仪器指定位置。选择程序，启动循环。程序预计运行时间为 2 小时 50 分钟。
  5. 循环结束
    1. 按照制造商说明关闭仪器。按指示卸下微孔板。目视检查第 8 板是否含有磁珠（棕色沉淀）。此外，仪器会导出运行报告。
    2. 将第 8 板中的偶联磁珠转移至各自的 1.5 mL 离心管中保存。将偶联磁珠于 4 °C 保存，直至使用。
  6. 计数磁珠。
    注意：使用了细胞计数仪。若使用血细胞计数板进行手动计数，请参考 Luminex 实验手册8。
    1. 充分涡旋混匀偶联磁珠。取 10 µL 加入细胞计数室。按照制造商说明读取每毫升磁珠数量。
    2. 通过细胞计数仪观察图像，检查是否存在聚集。非聚集磁珠的代表性图像见 补充图 1。
    3. 若存在聚集，充分涡旋并超声处理至少 5 分钟。重复计数
      ​注意：在磁珠计数后，通过在标准样本池上对偶联磁珠进行免疫测定，评估偶联效率，以检测抗体反应的线性。

表1：50重检测中包含的抗原组合。 该检测包含多种抗原，用于检测虫媒病毒感染及共同流行的病原体。表中提供了用于偶联125万个微球的抗原用量。请点击此处下载该表格。

3. 多重免疫测定

注意：测量 MFI 的实验方案详细步骤见相应手册9。为尽量减少微球暴露于光线下及光漂白的风险，所有溶液和样品均需在将微球从冰箱中取出前预先准备好。

  1. 设置板布局。使用96孔板，并在第一行包含标准品混合液的系列稀释液以及一个空白对照（仅缓冲液）。
  2. 在另一个非结合性板中，用PBT缓冲液稀释样本和标准品。样本采用1:200稀释（最终浓度为1:400）。标准曲线则使用标准血清混合液1:50稀释（最终浓度为1:100），并进行10次2倍系列稀释。
  3. 确定在每孔总体积为50 µL时所需的偶联微球用量。每孔使用每种微球500个，并用PBT缓冲液调整至所需体积。
  4. 将偶联微球混合物充分涡旋振荡30秒，随后超声处理至少60秒。
  5. 计算每种偶联微球加入多重预混液中的体积，以确保每种分析物对应的微球数量相等。微球体积按以下公式计算：每孔微球体积 = 每孔微球数量 / 微球浓度。
    注：有关预混液所需微球及缓冲液体积计算的示例见补充表3。
  6. 将适量的微球-抗原混合液转移至离心管中。
  7. 用PBT缓冲液定容。
  8. 充分混匀预混液。
  9. 向成像微孔板（例如ps、f-底板）中每孔加入50 µL预混液。
  10. 向微球中加入50 µL稀释后的样本。
  11. 在室温下以700 rpm在板式振荡器上混匀30分钟。
  12. 按以下步骤洗涤板三次（手动洗涤）。
    1. 将板置于磁力架上，室温静置60秒。紧握板体，弃去上清液。
    2. 加入100 µL PBT缓冲液，继续置于磁力架上60秒。重复洗涤操作。
      注：也可使用板式洗板机16。洗板机设置如下：1个浸泡循环，随后进行3个循环（吸液、注液和浸泡），最后执行一次吸液循环。
  13. 弃去上清液，每孔加入50 µL稀释后的二抗。
    1. 按照供应商说明配制二抗储存液。实验中使用1/120稀释的二抗溶液。二抗体积按以下公式计算：二抗体积 = 总体积 / 稀释倍数。
    2. 将二抗与适量PBT缓冲液混合，充分混匀后，向洗涤后的微球中每孔加入50 µL稀释二抗。
  14. 在室温下以700 rpm振荡孵育15分钟。
  15. 按前述方法进行三次洗涤。
  16. 用150 µL PBT缓冲液重悬微球。
  17. 在室温下以700 rpm振荡孵育5分钟。按照仪器制造商的说明进行仪器设置9。
    注：使用成像仪配套的xPONENT软件17。荧光读数设置如下：采集体积设为50 µL，最低计数微球数为50个，不启用XY加热器，分析类型设为“无”。

4. 数据分析

  1. 运行验证
    1. 检查是否达到最低微球计数。建议每孔至少有35个微球，以获得具有统计学意义的平均荧光强度（MFI）8。
    2. 检查空白孔和阴性对照样品的MFI值是否最低。
    3. 通过绘制标准曲线检查标准品的MFI值。这些值应高于空白孔和/或阴性对照样品。
  2. 样品数据分析
    1. 将数据导出为CSV文件，并使用R软件进行外部分析。

结果

为了说明该方案验证所遵循的流程，我们选择了代表三种虫媒病毒科的三种抗原：黄病毒科（登革病毒1型NS1蛋白）、甲病毒科（基孔肯雅病毒样颗粒蛋白）和布尼亚病毒科（裂谷热病毒核蛋白）。这些抗原在一组预先暴露人群的标准血清池（ORPAL）、法国（未暴露）人群血清以及来自非洲的两个队列（塞内加尔和马达加斯加）中进行了检测。

抗体反应的稀释线性
通过ORPAL混合样本的系列稀释确定用于微球偶联的抗原浓度。最佳浓度被选定为能够获得线性标准曲线的最低浓度（数据未显示）。图1展示了每种节肢动物传播病毒抗原在各自最佳浓度下的线性情况。为进行偶联质量控制，每批偶联微球均使用预先选定的浓度，对ORPAL标准混合样本进行稀释线性检测。

与标准手动偶联实验的可比性
为评估使用新自动化方案获得的数据与已确立的手动偶联方法之间的可比性，我们比较了手动与自动偶联所得结果生成的标准曲线。图2显示两种实验方法均具有平行线性关系。MFI值因抗原而异。

微球偶联批次间变异
通过Levey-Jennings质控图18评估了同一偶联批次内检测结果的可重复性，即偶联批次间变异。使用代表性抗原及偶联BSA的对照微球，在ORPAL标准血清池中进行检测。图3展示了在不同日期对每种抗原进行检测时，19个不同板上的MFI值。三种抗原及对照的MFI结果均处于均值±3倍标准差（SD）范围内。

多重检测对 MFI 的影响
为了进一步评估该检测方法的性能，我们测试了多种抗原的多重检测是否会影响所测得的抗体反应。使用 ORPAL 标准混合样本，将多重检测结果与单一抗原（或单重磁珠）的结果进行比较。图 4 显示，当在单一抗原或包含 50 种抗原的预混样本中测量 MFI 时，两者结果之间具有高度相关性（R = 0.99，p < 2.2e-16）。

非洲人群血清样本中的抗体反应
为评估该检测方法在不同人群样本中的适用性，我们将来自非洲人群的血清样本（其暴露于节肢动物传播病毒的可能性较高）与来自法国人群的样本（推测其对这些病毒的暴露水平较低）进行了抗体反应比较。总共检测了1,596份马达加斯加样本、1,428份塞内加尔样本和84份法国人群样本。图5展示了不同人群的密度图。在塞内加尔人群中，针对CHIKV VLP的反应呈现出明显的双峰分布，提示该人群中存在两种不同的CHIKV反应模式。在塞内加尔人群中，DENV1 NS1和RVFV NP的反应也显示出轻微的双峰尾部特征，而法国人群与马达加斯加人群之间则无明显差异。

抗体反应线性图；稀释度 vs log(MFI)；CHIKV VLP、DENV1 NS1、RVFV NP。
图1：在ORPAL标准血清池中检测的抗体反应线性关系。 以几种选择的虫媒病毒抗原为例展示。纵轴显示中位荧光强度（MFI，对数刻度），横轴显示标准血清池的连续稀释倍数。在对样本进行大规模检测之前，该检测面板中的所有抗原均已使用标准血清池预先验证。 请点击此处查看该图的放大版本。

VLP、NS1、NP 稀释曲线；荧光检测比较：自动化与手动法在对数(MFI)尺度上的结果。
图 2：不同偶联方法对抗体反应平行性的影响。 对 ORPAL 标准血清池进行系列稀释（x 轴），检测其针对代表性抗原（分面图）的 MFI 对数值（y 轴）。不同颜色代表不同的偶联方法：自动化方法（红色、绿色、蓝色）和手动方法（紫色）。请点击此处查看该图的放大版本。

对照样本数据分析的Levey-Jennings图，1/400稀释度下的MFI变异，共四张图
图3：板间变异。 显示了在1:400浓度下ORPAL标准品池针对BSA偶联微球（对照）、DENV1 NS1、CHIKV VLP和RVFV的Levey-Jennings图。结果来自不同日期运行的19块板。y轴表示MFI值，x轴表示检测次数。请点击此处查看该图的放大版本。

单重与多重MFI比较；R=0.99的统计图，显示显著相关性。
图4：单重与多重检测法抗体反应的相关性。 标准血清池稀释至终浓度1:400，平行检测含有50重抗原的预混样本以及单个抗原包被的微球。采用Pearson相关性分析。图中显示三个代表性抗原作为示例。请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术荧光直方图；按国家对CHIKV VLP、DENV1 NS1、RVFV NP的nMFI分析。
图5：本检测方法在地方性流行区与非流行区样本队列中的应用。本研究对来自马达加斯加（绿色）、塞内加尔（蓝色）和法国（红色）的样本进行了检测。所有样本稀释至最终浓度为1:400。横轴表示标准化的平均荧光强度（nMFI），其值为相同浓度（1:400）下待测样本MFI与标准池MFI的比值。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：微球聚集的代表性示例图像。 图（A）显示未发生聚集的微球，图（B）显示微球聚集物。请点击此处下载该文件。

补充表1：缓冲液列表。 请点击此处下载该文件。

补充表 2：KingFisher Apex 磁珠偶联程序设置。 请点击此处下载该文件。

补充表3：预混液微珠体积计算示例。 请点击此处下载该文件。

讨论

多重微球免疫分析（FMIA）的应用已经改变了血清学检测的格局。该检测方法的优势在于能够在一次反应中评估针对多种抗原的抗体应答，从而缩短获得结果的时间并降低检测成本。这在血清学监测中尤为重要。然而，由于传统的FMIA检测依赖于耗时且劳动密集的手动微球偶联步骤，且每次反应只能处理单一抗原，因此其常规应用受到限制。本报告介绍了一种抗原与微球化学偶联的自动化方法。该自动化技术可在单次运行中同时完成多达96种抗原的偶联，显著缩短了高通量抗原偶联所需的时间。

图1显示抗原已成功结合到微球上。结果还表明，新的自动化方案与已建立的手动方案之间具有高度平行性（图2），说明在检测针对所评估抗原的IgG反应时，自动化方法的准确性不低于手动方法。板间变异（图3）和微球偶联批次间变异（图2）的结果显示，使用自动化偶联方法时数据具有可比性。多重与单重MFI之间的高度相关性（图4）表明，在本检测中同时检测大量抗原不会影响针对各个单独抗原的抗体反应。

为验证该检测方法，对来自流行区和非流行区队列的样本进行了测试（图5）。尽管非洲地区关于虫媒病毒的血清流行病学研究仍较为有限，但现有数据19,20,21,22表明，不同国家之间乃至同一国家内部的IgG血清阳性率存在差异。值得注意的是，现有数据显示，例如塞内加尔的三种病毒（基孔肯雅热、登革热和裂谷热）流行率高于马达加斯加19。本报告中观察到的结果与此一致，显示出塞内加尔队列对不同抗原具有明显且独特的免疫应答，与其他队列形成对比。这支持了该检测方法在相对较高血清流行率背景下区分抗体谱的能力。马达加斯加队列的观测数据可能与采样地点报告的病毒低流行率有关22，而与非流行区队列数据的可比性可能部分归因于法国队列样本量较小。此外，不同地区间报道的流行率差异也可能解释各数据集之间的差别。尽管仍需开展大规模研究以评估IgG血清流行率，但本报告提供的数据表明，所开发的检测方法能够特异性地检测针对所评估虫媒病毒抗原的IgG免疫应答，有效区分来自流行区的数据，并在同一人群中识别出细微而独特的免疫反应特征。

主要的技术挑战包括：尽管抗原使用量极小，仍需获得均一的抗原溶液；确保预混液中各微球区域的等摩尔比例；以及尽量减少微球的聚集。为克服在96孔板中难以实现均一溶液的问题，增加了一个步骤，即在将抗原溶液分配至孔板之前，先在1.5 mL离心管中将其充分预混。此外，还增加了一步对偶联后的微球进行计数，并调整体积，以确保向预混液中加入等数量的各类微球区域。同时加入了超声处理步骤，以促进微球混合并减少预混液中的聚集现象。

在本项有限的研究中，由于所有样本均在磁珠偶联后一个月内完成检测，因此未评估偶联磁珠的稳定性及其对检测性能的影响。此项评估超出了本报告的范围，将在未来的研究中进行。尽管存在这些局限性，本报告仍提出了一种快速且可靠的检测方法，可用于检测针对多种病原体（包括虫媒病毒）的抗体反应。对虫媒病毒感染进行血清学监测对于控制相关疾病至关重要，而可重复、快速检测针对这些病毒抗体反应的方法的建立，标志着在全球范围内评估传播异质性并针对性实施干预以减轻此类感染负担方面取得了重要进展。此外，尽管本报告的重点是虫媒病毒，但该实验方案广泛适用于多种抗原，代表了该领域的一项重大进步。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者们诚挚感谢各研究现场的参与者和社区卫生工作者。我们还衷心感谢所有实验室和现场工作人员，感谢他们在样本采集、数据获取和实验室分析中付出的辛勤努力。本研究由惠康信托基金会（Wellcome Trust）资助，项目编号为 [228185/Z/23/Z]，项目名称为“在气候变化背景下重建非洲虫媒病毒传播强度及干预措施的影响”（xSTAR）。为实现开放获取，作者已对本投稿所产生的任何作者接受稿版本应用了知识共享署名（CC BY）公共版权许可。我们还感谢以下人员允许我们使用样本：Rob Van Der Pluijm（巴黎巴斯德研究所传染病流行病学与数据分析部门）以及 Maylis Douine 和 Alice Sanna（安的列斯-圭亚那临床研究中心，卡宴中心医院，卡宴）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管 -常规实验室耗材
1000 mL 滤器单元，0.2 µmThermo Fisher Scientific567-0020
25 mL 储液槽 Thermo Scientific95128095
50 mL Falcon 管-常规实验室耗材
96 孔深孔板 - KingFisher DWThermo Scientific10373480
自动板式洗板机（可选）TECANHydroFlex Plus 微孔板洗板机
B 百日咳 FHA天然抗原 BP-FHA-50
天平-常规实验室设备
台式离心机  - 常规实验室设备
BioPlex Pro 磁性 COOH 微珠 LuminexMC10xxx （x=微珠区域）
牛血清白蛋白，BSASigmaA7906
Branson Ultrasonics Bransonic 超声波清洗机 B200 型Fisher Scientific15-337-22
BSASigma AldrichA7906
CCHF GP天然抗原REC31639-100
细胞计数器/血球计数板Bio-Rad/MerckTC20 /Z359629
CHIKV E2天然抗原REC31617-100
CHIKV VLP天然抗原CHIKV-VLP-100
透明平底免疫非无菌 96 孔板Thermo Scientific3455
CMV 颗粒天然抗原CMV-HP-100
细胞计数双腔计数板 Bio-RadL003662 A
cp23天然抗原生产用蛋白
CT694天然抗原生产用蛋白
CtxB
DENV1 EDIII + SNAP实验室自制-
DENV1 NS1天然抗原DENV1-NS1-100
DENV1 VLP天然抗原DENVX4-VLP-100
DENV2 EDIII + SNAP实验室自制-
DENV2 NS1天然抗原DENV2-NS1-100
DENV2 VLP天然抗原DENVX4-VLP-100
DENV3 EDIII + SNAP实验室自制-
DENV3 NS1天然抗原DENV3-NS1-100
DENV3 VLP天然抗原DENVX4-VLP-100
DENV4 EDIII + SNAP实验室自制-
DENV4 NS1天然抗原DENV4-NS1-100
DENV4 VLP天然抗原DENVX4-VLP-100
白喉毒素天然抗原 DIP-TNL-100
EBV-gp125天然抗原REC31601-100
EDC Sigma03449
乙醇 100% -常规实验室 
铝箔封板膜，非无菌 -通用
荧光成像仪器 - MAGPIX 系统Luminex MAGPIX-XPON4.1-CEIVD
手持式板用磁铁 - 96 孔磁性分离器LuminexCN-0269-01
HEV-ORF2天然抗原 REC31653-100
Inaba OSPBoston_MGH -
KingFisher 96 孔深孔板吸头梳Thermo Scientific17170069
利什曼原虫 K28ClinisciencesMBS3040095
Luminex MAGPIX 校准试剂盒LuminexMPX-CAL-K25
Luminex MAGPIX 验证试剂盒LuminexMPX-PVER-K25
磁性管分离器InvitrogenDynaMag
MAGPIX 驱动液 PlusLuminex40-50030
麻疹 NP天然抗原REC31796
微孔板振荡器 Randox
微孔板，96 孔，聚苯乙烯，平底（烟囱孔）Greiner-Bio One655096
超纯水 H₂O -常规实验室 
多通道移液器 10、300SARTORIUS
NIE天然抗原生产用蛋白
Ogawa OSPBoston_MGH -
ONNV E2ClinisciencesIT-022-006Ep
颗粒处理仪器Thermo ScientificThermo Scientific KingFisher Flex
PBS 10x pH~7.0EUROMEDEXET330
PE 标记抗人 IgG Fc 二抗Jackson Immuno Research709-116-098
PfAMA1实验室自制-
PfMSP1天然抗原REC32013-100
pgp3天然抗原生产用蛋白
移液器吸头（供应商）10 µL、200 µL、1000 µL -常规实验室耗材
Pm MSP1ClinisciencesCUST-PRT-31102024-1B
Po MSP1ClinisciencesCUST-PRT-31102024-1A
PvMSP1天然抗原REC31724-100
R 软件 R4.4.1--
RVFV NP天然抗原REC31640-100
单通道移液器 10p、20p、200p、1000pEppendorf
SNAP实验室自制-
S-NHS Sigma56485
叠氮化钠SigmaS2002
次氯酸钠溶液（漂白剂） -通用家用漂白剂
破伤风毒素天然抗原REC31801-100
Thermo Scientific BindIx 软件 1.1 版ThermoFisher Scientific-
TRITONThermo ScientificA16046
管式滚轴混合器 IKARoller 6D -100219627
Tween-20SigmaP7949
USUV EDIII + SNAP实验室自制-
USUV NS1天然抗原USUV-NS1-100
涡旋振荡器  -常规实验室设备
VSP3天然抗原生产用蛋白
VSP5天然抗原生产用蛋白
WNV EDIII + SNAP实验室自制-
WNV NS1天然抗原WNV-NS1-100
xPONENT 软件Luminex89-30000-00-759 Rev A May-19
YFV EDIII + SNAP实验室自制-
YFV NS1天然抗原YFV-NS1-100
ZIKV EDIII + SNAP实验室自制-
ZIKV NS1天然抗原ZIKV-NS1-100
ZIKV VLP天然抗原ZIKV-VLP-100

参考文献

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