传统中药与左旋多巴在帕金森病中的协同神经保护作用：一项行为学与药代动力学研究

摘要

这项临床前研究表明，ZXFD 和左旋多巴在帕金森病动物模型中可安全有效地改善运动技能和认知功能。需要开展临床研究以验证这些发现，并探索该疗法在缓解症状和提高生活质量方面的潜力。

摘要

帕金森病（PD）是一种复杂的神经系统疾病，可导致震颤、僵直和运动迟缓等严重运动障碍。目前正研究将中医方剂（如镇肝熄风汤（ZXFD））联合西药（左旋多巴）用于帕金森病的治疗。然而，由于缺乏可靠且可解释的实验模型，相关机制研究受到阻碍。本研究在帕金森病大鼠模型中评估了ZXFD的神经保护作用，并考察其与西药（WM）联用时的有效性与安全性。将240只经MPTP诱导产生帕金森病样症状的小鼠分为两组：干预组（IG，n = 120）接受ZXFD + 左旋多巴治疗，对照组（CG，n = 120）仅接受左旋多巴治疗。经过12周治疗后，通过转棒实验、旷场实验、高架迷宫实验、莫里斯水迷宫实验及尾悬实验评估动物的运动功能与认知表现。次要结局指标包括ZXFD与左旋多巴之间的药代动力学相互作用及不良事件特征。两种治疗方法均能提升小鼠的运动功能与认知能力，表现为所有行为学测试评分改善。但ZXFD+左旋多巴组改善更为显著，转棒、旷场、莫里斯水迷宫及尾悬实验评分均显著提高。我们在两组中均观察到明显的ZXFD-左旋多巴药代动力学相互作用。在CG组中，Cmax为150.9 ± 35.6 ng/mL，Tmax为1.8 ± 0.5 h，AUC0-∞为654.2 ± 153.9 ng·h/mL，清除率为23.4 ± 5.6 L/h，半衰期为4.2 ± 1.0 h。相比之下，IG组的Cmax为421.9 ± 93.5 ng/mL，Tmax为3.2 ± 1.1 h，AUC0-∞为2431.9 ± 561.2 ng·h/mL，清除率为10.3 L/h，且不良事件和死亡率降低。本研究表明，ZXFD联合左旋多巴可能是治疗帕金森病样症状的一种安全有效的方案。这些发现提示，该联合治疗策略尚需进一步的临床研究以验证其有效性和安全性。

引言

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种复杂且多因素的神经退行性疾病，全球有数百万人受其影响，在60岁以上人群中发病率约为1%^1,2。该疾病以黑质（substantia nigra）中多巴胺能神经元进行性丧失为特征，黑质是大脑中对运动控制起关键作用的区域³。这些神经元的退化导致多巴胺缺乏，而多巴胺是一种调节运动、动机和奖赏处理的神经递质⁴。帕金森病的运动症状，如震颤、强直、运动迟缓和姿势不稳，已被广泛研究并有明确定义。非运动症状，包括认知障碍、抑郁、焦虑和睡眠障碍，在帕金森病患者中也十分常见，并显著影响其生活质量^5,6。

目前帕金森病（PD）的治疗主要强调多巴胺替代疗法（DRT）和深部脑刺激（DBS）。DRT通过给予左旋多巴（多巴胺的前体物质）来缓解症状，并改善PD患者的运动功能^7,8,9。长期使用左旋多巴会导致运动波动、异动症以及潜在的神经毒性^10,11,12。深部脑刺激（DBS）涉及在脑内植入电极，可显著改善PD患者的运动功能和生活质量¹³。DBS是一种高度侵入性的手术，存在显著的风险和并发症^14,15。

西医，包括药物替代疗法（DRT）和脑深部电刺激术（DBS），是帕金森病（PD）治疗的主要手段，而中医药（TCM）作为辅助疗法正逐渐获得认可^16,17。越来越多的证据表明，中医药可作为帕金森病（PD）有效的辅助治疗手段，在调节疾病进展及减轻多巴胺能治疗相关不良反应方面具有潜在疗效。Zhang 等人（2015年）开展的一项系统综述与荟萃分析¹⁸表明，中医药辅助治疗在特发性帕金森病患者中总体安全且耐受性良好，可显著改善运动功能和症状管理。此外，Pan 等人（2013年）¹⁹报道，中医药干预显著改善了患者的睡眠质量，并改善了去趋势波动分析（DFA）参数，提示自主神经系统功能得到增强。这些研究结果凸显了将中医药整合入帕金森病患者治疗方案的潜在益处，尤其是在改善运动症状和非运动症状方面。镇肝熄风汤（ZXFD）是一种传统中药方剂，用于治疗类似帕金森病的症状，如震颤、肌强直和运动迟缓^20,21。ZXFD 包含多种草药成分，如人参（Panax ginseng）、黄芩（Scutellaria baicalensis）和黄芪（Astragalus membranaceus）。ZXFD 中所含的中药成分表现出神经保护作用，包括抗炎、抗氧化和抗凋亡特性。其中，人参（Panax ginseng）作为 ZXFD 的关键成分，可在帕金森病动物模型中调节多巴胺水平并改善运动功能^22,23,24。此外，中医药与左旋多巴联合使用可能产生协同效应，提高疗效并减少常规治疗带来的副作用。然而，ZXFD 联合左旋多巴治疗帕金森病的疗效与安全性尚不明确。本项观察性研究旨在通过帕金森病小鼠模型，评估 ZXFD 与左旋多巴联合治疗方案的治疗效果及安全性，以探讨该双重疗法可能带来的增强效应。

该研究采用帕金森病的小鼠模型，确保了研究结果与该疾病的病理生理学密切相关。这些结果可能适用于其他动物模型，为进一步研究奠定基础，并可能增进我们对ZXFD作用机制的理解。本研究的发现对临床实践具有重要意义。如果证实ZXFD与左旋多巴联合使用有效，则可能为帕金森病患者提供一种新的治疗策略。这种整合性方法有望提高疗效、减少不良反应，并改善患者的生活质量。该结果还可能为未来临床试验的设计提供参考，推动ZXFD在临床实践中的潜在应用，为帕金森病患者带来新的希望。

方案

​所有动物实验均按照机构指南进行，并经西安中医脑病医院动物护理与使用委员会（机构动物护理与使用委员会，2024-154）批准。本研究遵循既定的动物研究伦理原则。

1. 小鼠模型

1. 从经认证的实验动物供应商处获取8至10周龄的雄性C57BL/6小鼠。将小鼠饲养在温度控制在22 ± 2 °C的环境中，维持12小时光照-黑暗循环，并确保其拥有 随意摄取 食物和水的获取

2. 诱导帕金森病模型

1. 向小鼠腹腔注射溶于生理盐水的1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）^25,26，剂量为30 mg/kg/天，连续给药5天，以建立帕金森病模型。对照组小鼠给予等体积的生理盐水。

3. 镇肝熄风汤（ZXFD）的制备

注意：复方丹参（FD）是一种传统中药方剂，包含人参（Panax ginseng）、黄芩（Scutellaria baicalensis）和黄芪（Astragalus membranaceus）等多种草药²⁷。这些草药购自北京同仁堂，并由合格的中药师进行真伪鉴定。

1. 采用标准化提取工艺制备中药复方制剂ZXFD。取100 g干燥的中药混合物，按1:10（w/v）的比例加入去离子水，在室温（20–25 °C）下浸泡1小时，随后使用温度控制在100 °C的加热提取器进行两次煎煮，每次煎煮30分钟。
2. 合并所得煎液，过滤后使用旋转蒸发仪（50 °C，50 rpm）浓缩至最终体积为50 mL。
3. 将浓缩后的煎液在4 °C条件下以1000 × g 离心20分钟，以去除沉淀物。收集上清液，即为ZXFD煎剂，用于后续实验。

4. 西药（WM）的制备

注意：使用左旋多巴，这是一种常用于治疗帕金森病的多巴胺前体。

1. 将左旋多巴溶解于蒸馏水中，配制成浓度为 10 mg/mL 的溶液。

5. ZXFD 和 WM 的单独治疗

1. 让一组小鼠接受ZXFD治疗，另一组小鼠接受WM治疗。该实验设计可用于评估每种治疗对小鼠帕金森病样症状的单独影响。

6. 治疗组

1. 将小鼠分为两组处理组：对照组（CG），仅给予WM（左旋多巴）；干预组（IG），给予ZXFD与WM（左旋多巴）联合治疗。
2. 遵循治疗方案，该方案包括两个不同阶段：
   1. 以30 mg/kg/天的剂量给予MPTP 通过 第1天至第7天进行腹腔注射。
   2. 给予MPTP后，在干预组（IG）和对照组（CG）分别于第8至84天给予ZXFD（200 mg/kg/天，灌胃）和WM（左旋多巴，20 mg/kg/天，灌胃）²⁸使用无菌灌胃针或导管进行灌胃操作。由经过培训的人员通过食道将导管或灌胃针小心插入胃内，以尽量减少动物应激和潜在并发症。操作过程中，轻柔固定小鼠，并缓慢谨慎推进灌胃针，避免对食道或气管造成损伤。
      ​注意：为尽量减少并发症，采取的预防措施包括对操作人员进行适当培训、使用无菌器械、轻柔固定动物，并密切监测动物是否出现呼吸困难、嗜睡或食欲减退等痛苦迹象。在连续70多天的给药过程中，未观察到明显并发症，小鼠对该操作耐受良好。
   3. 通过酪氨酸羟化酶（TH）免疫组织化学染色验证帕金森病（PD）模型²⁹，即MPTP给药小鼠黑质中多巴胺能神经元的标志物。

7. 主要和次要结局

1. 实施全面的行为评估方案，以评估小鼠的运动功能和认知表现，作为主要结局指标。
   1. 转棒实验
      注意：包括转棒实验³⁰，该实验用于评估运动协调性和平衡能力，这是帕金森病（PD）中常受影响的运动功能关键方面。在测试过程中，整合感觉、运动和认知过程，以维持在旋转棒上的平衡与协调。
      1. 使用转棒仪进行转棒实验，转棒仪的棒直径为3 cm，长度为30 cm。将转棒速度设置为在5分钟内从4 rpm加速至40 rpm。
      2. 将小鼠放置于转棒仪上，测量其停留在棒上的时间。连续三天，每天重复三次该操作，每次试验之间确保有30分钟的间隔。记录每次试验中小鼠跌落的潜伏期（以秒为单位）。这将提供对小鼠运动协调性和平衡能力的评估。
   2. 旷场实验
      ​注意：在旷场实验³¹中评估自主活动能力和探索行为，这些是帕金森病中常受影响的运动功能的重要组成部分。通过该实验评估自发运动活动、探索行为以及对新环境的习惯化能力。
      1. 在尺寸为40 cm × 40 cm × 30 cm的旷场装置中进行旷场实验。确保地面和墙壁由白色有机玻璃制成，并在装置中心上方1.5 m处使用60 W灯泡照明。
      2. 将小鼠置于旷场装置的中心，允许其自由探索5分钟。使用视频追踪系统记录总移动距离、在中心区域停留的时间以及在周边区域停留的时间。这将提供对自主活动能力和探索行为的评估。
   3. 高架十字迷宫实验
      ​注意：使用高架十字迷宫实验³²评估类焦虑行为，这是帕金森病常见的非运动症状。通过观察小鼠对开放空间的自然厌恶及其倾向于回避高架十字迷宫开放臂的行为，来测量类焦虑行为。
      1. 在由两条开放臂（30 cm × 5 cm）和两条封闭臂（30 cm × 5 cm × 15 cm）组成的装置上进行高架十字迷宫实验，装置离地高度为50 cm。在迷宫中心上方1.5 m处使用60 W灯泡照明。
      2. 将小鼠面朝开放臂放置于高架十字迷宫的中心，允许其自由探索5分钟。在此期间，确保使用视频追踪系统记录小鼠在开放臂、封闭臂和中心区域停留的时间，以评估类焦虑行为。
   4. 认知与运动功能评估
      1. 评估空间学习与记忆能力：进行Morris水迷宫实验³³，以评估帕金森病（PD）小鼠的空间学习与记忆能力。利用空间线索使小鼠能够在注水迷宫中导航并找到隐藏平台。
      2. 评估抗抑郁样行为与运动功能：进行悬尾实验³⁴，以评估抗抑郁样行为和运动功能。将实验中的静止时间作为抗抑郁样活性的指标。通过评估小鼠被尾部悬挂时移动和挣扎的能力来评价其运动功能。
      3. 药代动力学分析与不良事件评估：进行药代动力学分析。评估以下不良事件：嗜睡、食欲减退、腹泻、呕吐、惊厥和死亡。

8. 药代动力学分析

1. 按以下步骤进行药代动力学分析：
   1. 口服给予小鼠单剂量 ZXFD（200 mg/kg，p.o.）和左旋多巴（50 mg/kg，p.o.）。
   2. 采用高效液相色谱法（HPLC）³⁵测定活性成分的血浆浓度，色谱条件如下：C18 色谱柱（150 mm × 4.6 mm，5 µm），柱温 30 °C，流动相：水（含 0.1% 甲酸）-乙腈，梯度洗脱，流速：1.0 mL/min，检测波长：280 nm。
   3. 进样 20 µL 血浆样品，使用适当的软件分析色谱图。
   4. 计算色谱峰面积，并通过标准曲线法确定血浆浓度。

9. 进行统计分析

1. 评估数据的正态性
   1. 使用 SPSS 26.0³⁶ 或 GraphPad Prism 8.0³⁷ 进行 Shapiro-Wilk 检验，以确定数据是否符合正态分布。
   2. 绘制正态 Q-Q 图^38,39，通过可视化方式评估正态性。
2. 正态分布的数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。
3. 进行组间比较：对于两组之间的比较，采用 Student's 非配对双尾 t 检验^40,41；对于多组之间的比较，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）或双因素方差分析（two-way ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验（适用于正态分布数据），或采用 Kruskal-Wallis H 检验并结合 Bonferroni 校正（适用于非正态分布数据）^42,43。
4. 根据获得的 p 值判断显著性，统计学显著性定义为 p < 0.05⁴⁴。

结果

本研究探讨了在帕金森病（PD）小鼠模型中，ZXFD 与左旋多巴（WM）联合使用的治疗效果。共纳入 240 只表现出 MPTP 诱导的帕金森病样症状的小鼠，并随机分配至干预组（IG，n = 120），接受 ZXFD + 左旋多巴治疗，或对照组（CG，n = 120），仅接受 WM 治疗，如图 1所示。通过酪氨酸羟化酶免疫组织化学染色发现，与生理盐水处理的对照组相比，给予 MPTP 的小鼠黑质中 TH 阳性神经元显著减少，证实成功诱导出以多巴胺能神经元丢失为特征的帕金森病样病理改变（图 2）。通过一系列行为学测试评估为期 12 周的治疗方案对运动功能和认知表现的影响，并考察药代动力学相互作用及不良事件的发生情况。主要研究结果如下：

小鼠的基线特征

讨论

正安熄风汤是一种用于治疗帕金森病（PD）及多种神经退行性疾病的中医方剂。该方剂由多种草药组成，包括人参、银杏叶和黄芪，这些成分被认为可协同作用以缓解帕金森病症状^45,46。正安熄风汤联合左旋多巴的治疗方案通过多种机制有效减轻帕金森病症状，这些作用包括抑制细胞死亡、促进神经发生、调节多巴胺水平、抑制炎症性细胞因子、发挥抗氧化效应、保护线粒体、增强线粒体生物合成、调控α-突触核蛋白以及调节肠-脑轴功能^47,48,49。

本研究表明，联合使用ZXFD和左旋多巴可能有效治疗帕金森病（PD），这是一种以运动障碍和认知功能受损为特征的神经退行性疾病。研究结果表明，这种联合疗法可改善PD小鼠的运动功能、认知表现以及类似抗抑郁的行为，如图9

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蒸发仪	上海临博仪器有限公司	LB-EL-01
高效液相色谱（HPLC）	岛津，日本京都	LC-20AT
左旋多巴	西安天广源生物科技有限公司（中国）	TY-001
MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）	Sigma-Aldrich, Inc., 美国	M-102
岛津 LC Solution 软件	岛津，日本京都	https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/m0896
镇肝熄风汤（ZXFD）	康仁堂 / Meridian Pro Formulas	货号 / MPF: MPF20131