本文介绍了利用共聚焦显微镜和ImageJ评估线粒体裂变/融合动态的方法 通过 Dendra2 光转换荧光
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本文内容
摘要
摘要
线粒体最主要的功能是合成ATP，同时也是细胞代谢的关键调控因子。线粒体动力学包括线粒体在细胞内和细胞间的移动，以及分裂与融合过程。这些事件对于维持线粒体功能至关重要，有助于保持细胞稳态、形态、生物能量学、质量控制以及应激反应。相反，线粒体动力学的失调会影响细胞的形态和功能。精确测量线粒体的分裂与融合事件可反映细胞的健康状态。目前测量线粒体动力学的方法包括使用超分辨率显微镜等先进成像技术、用于评估连接性的荧光技术（如光漂白后荧光恢复，FRAP），以及用于时空控制的光遗传学工具。定量分析则利用计算工具测量长度、数量和分支等参数，以反映分裂与融合的平衡状态。然而，这些方法需要专业技术以及复杂的仪器设备。本文中，我们描述了结合共聚焦显微镜与ImageJ（Fiji）中免费工具，利用标记在线粒体细胞色素c上的dendra2蛋白的光转换特性，来研究线粒体分裂与融合事件的方法。
引言
线粒体是一种动态的细胞器，在能量产生、细胞死亡和信号转导中发挥着至关重要的作用1。线粒体形态是指线粒体区室的大小和形状，其形态高度响应细胞内外环境的变化，并对维持细胞健康至关重要2。线粒体的形态可为其功能提供关键信息，然而，线粒体形状的改变可能影响细胞代谢及整体健康状态3。线粒体形态的异常与多种疾病相关，包括神经退行性疾病、癌症和代谢性疾病4。线粒体形态通过融合与分裂/融合过程动态调控，这些过程对于维持细胞稳态以及响应各种代谢需求至关重要5,6。
线粒体动力学有助于该细胞器应对不同的应激因素和代谢需求7涉及线粒体在细胞内或细胞间的持续分裂与融合，以及运动。线粒体通过形态变化来适应细胞的能量需求 通过 分裂/融合事件8这些过程决定了线粒体的形态，并影响其功能，如能量产出、活性氧（ROS）生成以及线粒体质量控制。7,9,
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方案
所有动物实验均依照天普大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行（天普大学，动物实验方案编号-5183）。表达Dendra2蛋白的线粒体Pham小鼠为外购获得。
1. 细胞培养基的制备
- 根据实验方案分离肾近端小管细胞，该方案在使用磁珠分离肾小球内皮细胞后进行24（图1A）。Bouchareb 等人开发了一种方法，利用磁珠从表达荧光线粒体（mito-Dendra2）的转基因小鼠肾脏中分离并培养肾小球内皮细胞（GECs）。在分离出GEC后，将沉淀中残留的小管部分分离并进行培养。
- 将肾近端小管细胞接种于10 cm培养皿中，加入10 mL DMF-12培养基，补充5% FBS（热灭活）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL）。培养2-3天，直至细胞从小管组织中迁移出来。
- 通过形态学特征筛选小管细胞，筛选前需进行为期2天的饥饿处理（使用不含FBS的DMF-12培养基）。
注意：实验时应使用细胞融合度为50-70%的培养皿。接种前需使用血细胞计数板对细胞进行计数。 - 实验用细胞接种：根据实验需求，将细胞以每孔1-5 × 105个细胞的密度接种至玻璃底培养板中。接种后过夜培养，使细胞充分贴壁和生长，再加入顺铂。
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结果
通过酶消化法从小鼠肾脏中分离原代肾小管上皮细胞，并在添加了5%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMF-12培养基中，于37 °C、5% CO2条件下进行培养。当细胞融合度达到80%时，用胰蛋白酶（0.25%胰蛋白酶-EDTA）消化后，以每孔5 × 104个细胞的密度接种于预先包被胶原蛋白的玻璃底培养板中。
培养基中含顺铂，终浓度为 µM，溶剂为 DMF-12 培养基，添加 0.004% DMSO（v/v，与顺铂溶剂体积一致）。每孔加入 2 mL 培养基，细胞处理 24 小时。处理结束后，弃去原培养基，更换为不含化合物的新鲜培养基。随后评估细胞形态 通过 相差显微镜。本文中，我们提供了一种自适应方法，利用共聚焦显微镜和ImageJ分析Dendra2光转换荧光，以检测化疗处理后线粒体裂变与融合事件的动态变化。
光漂白后荧光恢复（FRAP）
使用 FRAP 方法评估了顺铂处理的近端小管细胞中的线粒体动力学。在表达线粒体靶向 dend.......
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讨论
线粒体分裂/融合是维持线粒体稳态和细胞存活的关键动态过程26。对这些过程进行准确评估需要采用先进的成像技术，以可视化并定量分析线粒体的形态、动态变化及功能27,28。目前已有多种技术用于测量线粒体的分裂与融合。其中一些精密工具包括受激辐射损耗（STED）纳米显微镜，可用于活细胞中线粒体嵴动态的可视化观察29。结构照明显微镜（SIM）已被用于线粒体亚结构的多色成像30。扩展显微镜技术可用于可视化和表征线粒体嵴的形态31。电子显微镜可提供线粒体的超微结构细节32。此外，电子断层扫描技术（Cryo-STET）可用于观察完整的线粒体及其周围环境33。透射电子显微镜（TEM）可用于观察细胞中线粒体形态和数量的变化.......
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披露
作者声明无任何利益冲突可披露。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院资助项目（资助号：5R01DK135470-03）、ISAC-NIH 资助项目（资助号：5U24DK128851-03）以及美国心脏协会博士后奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | |||
| DMEM/F12 | 基础培养基 | (Gibco/Cat. No.11320033 ) | 近端小管细胞培养 |
| 胎牛血清 (FBS) | 5–10% 添加量 | (Biowest/Cat. No.S181B) | 培养基增补 |
| 青霉素-链霉素 | 100倍浓度 | (Gibco/Cat. No.15140122) | 抗生素保护 |
| IV型胶原蛋白 | 包被 | (Sigma-C5533-5M) | Ibidi 培养板包被 |
| 胰蛋白酶-EDTA | 0.25% 溶液 | (Gibco/Cat. No.25200056) | 细胞解离 |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | (Gibco/Cat. No.10010023 ) | 细胞洗涤 | |
| 处理 | |||
| 顺铂 | 2 µM 工作浓度 | (Selleck Chemicals/Cat. No.S1166) | 应激诱导 |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | 溶剂对照 | (Fisher Scientific/Cat. No.D1391) | 顺铂溶剂对照 |
| 成像 | |||
| 无酚红培养基 | 活细胞成像 | (Gibco/Cat. No.21041025) | 降低背景荧光 |
| 分子生物学 | |||
| TRIzol® | RNA 提取 | (Gibco/Cat. No.15596018) | 总RNA分离 |
| SYBR Green Master Mix | qPCR 反应体系 | (Thermo Scientific/Cat. No.K0221) | 线粒体动力学相关基因表达分析（DNM1L、FIS1、MFN1、MFN2、OPA1） |
| 荧光工具 | |||
| Dendra2 | 线粒体基质标签 | Jacson Laboratory(PhAMexcised) | 光转换报告蛋白（405 nm 转换，488/561 nm 成像） |
| 显微镜 | |||
| 共聚焦显微镜 | Leica DMi8 | 活细胞成像和荧光漂白恢复（FRAP） | 405 nm/488 nm/561 nm 激光器 |
| Image J | https://imagej.net/software/fiji/downloads | ||
| RGB Profiler 插件 | https://imagej.net/ij/plugins/rgb-profiler.html. | 融合事件分析（红/绿信号重叠） |
参考文献
- Liesa, M., Palacin, M., Zorzano, A. Mitochondrial dynamics in mammalian health and disease. Physiol Rev. 89 (3), 799-845 (2009).
- Chen, Z., Berquez, M., Luciani, A. Mitochondria, mitophagy, and metabolic disease: towards assembling the puzzle. Cell Stress. 4
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