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方法文章

肾近端小管细胞中线粒体分裂/融合动态的评估

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DOI：

10.3791/69268

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2025年11月14日

 ,  ,  ,  , 
1Lewis Katz Medical School at Temple University

本文内容

摘要

本文介绍了利用共聚焦显微镜和ImageJ评估线粒体裂变/融合动态的方法 通过 Dendra2 光转换荧光

摘要

线粒体最主要的功能是合成ATP，同时也是细胞代谢的关键调控因子。线粒体动力学包括线粒体在细胞内和细胞间的移动，以及分裂与融合过程。这些事件对于维持线粒体功能至关重要，有助于保持细胞稳态、形态、生物能量学、质量控制以及应激反应。相反，线粒体动力学的失调会影响细胞的形态和功能。精确测量线粒体的分裂与融合事件可反映细胞的健康状态。目前测量线粒体动力学的方法包括使用超分辨率显微镜等先进成像技术、用于评估连接性的荧光技术（如光漂白后荧光恢复，FRAP），以及用于时空控制的光遗传学工具。定量分析则利用计算工具测量长度、数量和分支等参数，以反映分裂与融合的平衡状态。然而，这些方法需要专业技术以及复杂的仪器设备。本文中，我们描述了结合共聚焦显微镜与ImageJ（Fiji）中免费工具，利用标记在线粒体细胞色素c上的dendra2蛋白的光转换特性，来研究线粒体分裂与融合事件的方法。

引言

线粒体是一种动态的细胞器，在能量产生、细胞死亡和信号转导中发挥着至关重要的作用1。线粒体形态是指线粒体区室的大小和形状，其形态高度响应细胞内外环境的变化，并对维持细胞健康至关重要2。线粒体的形态可为其功能提供关键信息，然而，线粒体形状的改变可能影响细胞代谢及整体健康状态3。线粒体形态的异常与多种疾病相关，包括神经退行性疾病、癌症和代谢性疾病4。线粒体形态通过融合与分裂/融合过程动态调控，这些过程对于维持细胞稳态以及响应各种代谢需求至关重要5,6。

线粒体动力学有助于该细胞器应对不同的应激因素和代谢需求7涉及线粒体在细胞内或细胞间的持续分裂与融合，以及运动。线粒体通过形态变化来适应细胞的能量需求 通过 分裂/融合事件8这些过程决定了线粒体的形态，并影响其功能，如能量产出、活性氧（ROS）生成以及线粒体质量控制。7,9,10此外，线粒体分裂与融合是维持功能性线粒体网络的相互平衡的机制。11融合可促进线粒体内容物的交换，实现互补并缓冲局部损伤，而分裂则有助于受损线粒体的分离与清除 通过 线粒体自噬7,12此外，分裂有助于分离线粒体中受损的组分，这些组分随后通过线粒体自噬（一种选择性自噬过程）被清除。13另一方面，融合能够实现线粒体内容物的互补，从而稀释任何受损组分14线粒体分裂/融合的关键调控因子是线粒体融合蛋白（Mitofusins, MFN1/2），其在介导线粒体外膜融合过程中发挥重要作用15,16（OPA1）：这种动力蛋白样GTP酶负责线粒体内膜融合16裂变蛋白包括动力相关蛋白1（Drp1）和促裂变蛋白13,17线粒体分裂蛋白1（Fis1）、线粒体分裂因子（Mff）和线粒体分裂调节因子1样蛋白（MTFR1L）。已有多种技术被用于研究线粒体超微结构，例如超分辨率电镜（EM）。18单分子荧光 原位 杂交（smFISH）技术结合STED与MINFLUX超分辨率显微镜（纳米显微技术），已被用于可视化单个线粒体mRNA及其相关蛋白18单分子定位显微技术（SMLM）可追踪膜间距的变化19随机光学重建显微镜（STORM）超分辨率显微技术可用于研究线粒体内膜复合物20然而，这种先进设备的使用并不容易普及。共聚焦显微镜则更具可及性，且对操作者专业技术要求较低。此外，线粒体靶向荧光蛋白的开发极大地推动了活细胞中线粒体动态的研究21，因为我们使用光激活型绿色荧光蛋白（GFP）来观察和定量线粒体融合22.

为了研究线粒体分裂与融合，可对细胞施加应激或使用顺铂等药物处理，顺铂能够结合DNA并诱导DNA损伤，最终导致线粒体介导的细胞凋亡23。在本研究中，我们利用光可转换标记的Dendra2线粒体（来自光激活型线粒体小鼠）来观察经顺铂处理的肾小管上皮细胞中的线粒体分裂与融合事件，因为这类细胞富含线粒体且具有较强的再生能力。然而，该实验方案也可应用于任何表达光可转换标记Dendra2线粒体的细胞类型（图1A-C）。

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方案

所有动物实验均依照天普大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行（天普大学，动物实验方案编号-5183）。表达Dendra2蛋白的线粒体Pham小鼠为外购获得。

1. 细胞培养基的制备

  1. 根据实验方案分离肾近端小管细胞，该方案在使用磁珠分离肾小球内皮细胞后进行24（图1A）。Bouchareb 等人开发了一种方法，利用磁珠从表达荧光线粒体（mito-Dendra2）的转基因小鼠肾脏中分离并培养肾小球内皮细胞（GECs）。在分离出GEC后，将沉淀中残留的小管部分分离并进行培养。
  2. 将肾近端小管细胞接种于10 cm培养皿中，加入10 mL DMF-12培养基，补充5% FBS（热灭活）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL）。培养2-3天，直至细胞从小管组织中迁移出来。
  3. 通过形态学特征筛选小管细胞，筛选前需进行为期2天的饥饿处理（使用不含FBS的DMF-12培养基）。
    注意：实验时应使用细胞融合度为50-70%的培养皿。接种前需使用血细胞计数板对细胞进行计数。
  4. 实验用细胞接种：根据实验需求，将细胞以每孔1-5 × 105个细胞的密度接种至玻璃底培养板中。接种后过夜培养，使细胞充分贴壁和生长，再加入顺铂。
    注意：顺铂是一种具有危害性的化疗药物，必须严格遵守安全操作规程以保护人员和环境。为此，应遵循II级生物安全柜操作规范，穿戴个人防护装备（PPE），执行去污染、泄漏控制和废弃物处置（危险药物废弃物—化疗类）的相关规定：佩戴双层手套、护目镜，对工作台面进行去污染处理，并在工作区附近配备泄漏应急处理包，废弃物容器须明确标识。对于DMSO，也需穿戴PPE，在通风橱中操作，并遵守泄漏去污染及废弃物处置程序。

2. 使用顺铂诱导应激

  1. 顺铂培养基的制备
    1. 将顺铂溶于DMSO中，配制50 mM的储备液。
    2. 在玻璃底培养板中接种1–5 × 106个近端肾小管细胞，加入2 mL DMF-12培养基。
      注：可使用任何类型的玻璃底培养皿。
    3. 向实验组培养板中加入顺铂，使其终浓度为2 µM，DMSO终浓度为0.004%。
      注：取2 µL 50 mM顺铂加入1,998 µL无FBS的DMF-12培养基中稀释，取80 µL加入实验组培养板中。
    4. 将细胞孵育24小时。

3. 成像

  1. 使用共聚焦显微镜
    1. 将激光器配置为 405 nm（Dendra2 光转化）、488 nm（未转化 Dendra2 激发）和 561 nm（光转化后 Dendra2、Alexa 594）。
    2. 打开激光器并等待其稳定（约 10 分钟）。
  2. 研究分裂与融合事件
    1. 将激光器配置为 405 nm（Dendra2 光转化）、488 nm（未转化 Dendra2 激发）和 561 nm（光转化后 Dendra2、Alexa 594）。
    2. 将培养皿放入孵育室中。
    3. 在孵育室周围加入水，并将温度设定为 37 °C。应维持 CO2 的供应。
    4. 让孵育室达到平衡状态。温度变化会对细胞造成应激。
    5. 使用更高放大倍数和分辨率观察细胞，以进行线粒体成像。
    6. 打开左上角的下拉菜单，选择 FRAP 选项（图 2A-D）。
    7. 使用 LAS X 软件定义感兴趣区域（ROI），用于进行光漂白。
      注意：感兴趣区域可绘制为任意大小，不会影响结果，因为后续将对单个线粒体进行分析。
    8. 以低激光强度采集一系列漂白前图像，以建立基线荧光强度。将激光器设置为 405 nm 波长用于光转换（0.00）、48 nm（0.20）和 56 nm（0.20），确保细胞处于聚焦状态。
      注意：激光波长后括号中的数值表示激光强度，可设为任意值，因其不影响光漂白效果。
    9. 为对细胞进行光漂白，应用高强度激光脉冲对 ROI 区域进行漂白。将 FRAP 激光器设置为 405 nm（4.00）、488 nm（0.00）和 561 nm（0.00）。将漂白前设置为 5.140 秒，共 59 次迭代，漂白后时间设置为所需时长（图 2B）（括号中注明漂白前后激光强度）。
    10. 漂白后成像时，继续以低激光强度采集图像，观察荧光恢复情况，持续 10 分钟。保持 FRAP 激光器设置为 405 nm（0.00）、488 nm（0.50）和 561 nm（0.50）。
      注意：漂白时间可能因细胞类型而异；在本实验条件下，管状细胞和瓣膜间质细胞（VIC）中的线粒体采用了相似的漂白时间。FRAP 实验结束后，可进行图像采集或活细胞成像（图 3 和 补充视频 1），也可继续采集漂白后的图像。

4. 图像分析

注意：由于线粒体标记了 Dendra2 蛋白，经过光漂白后，Dendra2 蛋白会发生不可逆的构象变化，导致通过 561 nm 激光检测到的红色荧光增强。当红色线粒体与未漂白的绿色线粒体融合时，两者结合呈现黄色。利用这一现象，可检测动态的分裂/融合事件。

  1. 分析融合的红色与绿色线粒体
    1. 安装 RGB 轮廓插件，用于分析所选区域中红色和绿色信号的分布。
      注意：请按照网站上的说明将该插件添加到 Fiji 软件中。
    2. 打开 ImageJ（图 4A）。
    3. 从 文件 菜单中找到并打开待分析的文件（图 4B）。
    4. 选择 彩色模式复合图像，勾选 自动缩放 选项，并打开待分析的视频（图 4C）。
    5. 选择一个矩形区域进行分析（图 4D）。
    6. 将鼠标悬停在所选矩形区域附近，右键单击并选择 复制 （图 4E）。
    7. 选择 复制超堆栈 选项，以复制所有图像堆栈（图 4F）。
    8. 为将复制的堆栈转换为 RGB 格式，请选中图像，然后在图像下拉菜单中选择 RGB 选项（图 4G-H）。
    9. RGB 图像被复制后，仅选择一个帧（图 4I）。
    10. 如果图像中的线粒体呈弯曲状，请沿其长度方向绘制一条线，然后进入 编辑 菜单，选择 选区，并点击 拉直 （图 5A）。
    11. 为图像设置标题，并将线条宽度设为 20 像素（图 5B）。
    12. 拉直线粒体后，沿目标线粒体绘制一条线，以确保其与直线对齐（图 5C）。
    13. 打开 RGB 轮廓插件（图 5D）。
    14. 插件激活后，将生成一条曲线图，显示沿所画线段的红色和绿色荧光强度。每个峰的高度与荧光强度成正比（图 5E）。
      注意：也可使用线粒体分析插件25计算线粒体形态。选择用于曝光的区域，分析所选区域内的阈值，然后测量线粒体形态及二维参数。可选择面积、周长等其他参数。

5. 分析融合事件

  1. 建立融合前基线：在线粒体融合之前，确认红色荧光（561 nm）定位于一个线粒体，绿色荧光（488 nm）定位于相邻的另一个线粒体。相应的荧光强度图应显示两个明显分离的峰，分别为红色峰和绿色峰，且重叠部分极少。
  2. 确认融合后事件：融合发生后，红色信号（代表 Dendra2 基质内容物）应扩散至相邻的绿色线粒体中，表明内容物混合。此时荧光强度图将显示红色与绿色峰的重叠，从而确认融合事件的发生。
  3. 融合事件的评估可通过在活细胞成像中仔细选择健康的线粒体与光漂白的线粒体进行融合来实现。随时间推移，红/绿荧光强度比值的变化可指示融合事件的发生。

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结果

通过酶消化法从小鼠肾脏中分离原代肾小管上皮细胞，并在添加了5%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMF-12培养基中，于37 °C、5% CO2条件下进行培养。当细胞融合度达到80%时，用胰蛋白酶（0.25%胰蛋白酶-EDTA）消化后，以每孔5 × 104个细胞的密度接种于预先包被胶原蛋白的玻璃底培养板中。

培养基中含顺铂，终浓度为 µM，溶剂为 DMF-12 培养基，添加 0.004% DMSO（v/v，与顺铂溶剂体积一致）。每孔加入 2 mL 培养基，细胞处理 24 小时。处理结束后，弃去原培养基，更换为不含化合物的新鲜培养基。随后评估细胞形态 通过 相差显微镜。本文中，我们提供了一种自适应方法，利用共聚焦显微镜和ImageJ分析Dendra2光转换荧光，以检测化疗处理后线粒体裂变与融合事件的动态变化。

光漂白后荧光恢复（FRAP）
使用 FRAP 方法评估了顺铂处理的近端小管细胞中的线粒体动力学。在表达线粒体靶向 dend...

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讨论

线粒体分裂/融合是维持线粒体稳态和细胞存活的关键动态过程26。对这些过程进行准确评估需要采用先进的成像技术，以可视化并定量分析线粒体的形态、动态变化及功能27,28。目前已有多种技术用于测量线粒体的分裂与融合。其中一些精密工具包括受激辐射损耗（STED）纳米显微镜，可用于活细胞中线粒体嵴动态的可视化观察29。结构照明显微镜（SIM）已被用于线粒体亚结构的多色成像30。扩展显微镜技术可用于可视化和表征线粒体嵴的形态31。电子显微镜可提供线粒体的超微结构细节32。此外，电子断层扫描技术（Cryo-STET）可用于观察完整的线粒体及其周围环境33。透射电子显微镜（TEM）可用于观察细胞中线粒体形态和数量的变化...

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披露

作者声明无任何利益冲突可披露。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院资助项目（资助号：5R01DK135470-03）、ISAC-NIH 资助项目（资助号：5U24DK128851-03）以及美国心脏协会博士后奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞培养 
DMEM/F12 基础培养基 (Gibco/Cat. No.11320033 ) 近端小管细胞培养 
胎牛血清 (FBS) 5–10% 添加量 (Biowest/Cat. No.S181B) 培养基增补 
青霉素-链霉素 100倍浓度 (Gibco/Cat. No.15140122) 抗生素保护 
IV型胶原蛋白 包被 (Sigma-C5533-5M) Ibidi 培养板包被 
胰蛋白酶-EDTA 0.25% 溶液 (Gibco/Cat. No.25200056) 细胞解离 
磷酸盐缓冲液 (PBS) (Gibco/Cat. No.10010023 ) 细胞洗涤 
处理 
顺铂 2 µM 工作浓度 (Selleck Chemicals/Cat. No.S1166) 应激诱导  
二甲基亚砜 (DMSO) 溶剂对照 (Fisher Scientific/Cat. No.D1391) 顺铂溶剂对照 
成像 
无酚红培养基 活细胞成像 (Gibco/Cat. No.21041025) 降低背景荧光 
分子生物学 
TRIzol® RNA 提取 (Gibco/Cat. No.15596018) 总RNA分离 
SYBR Green Master Mix qPCR 反应体系 (Thermo Scientific/Cat. No.K0221) 线粒体动力学相关基因表达分析（DNM1L、FIS1、MFN1、MFN2、OPA1） 
荧光工具 
Dendra2 线粒体基质标签 Jacson Laboratory(PhAMexcised) 光转换报告蛋白（405 nm 转换，488/561 nm 成像） 
显微镜 
共聚焦显微镜 Leica DMi8 活细胞成像和荧光漂白恢复（FRAP） 405 nm/488 nm/561 nm 激光器 
Image J https://imagej.net/software/fiji/downloads 
RGB Profiler 插件 https://imagej.net/ij/plugins/rgb-profiler.html. 融合事件分析（红/绿信号重叠） 

参考文献

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