利用功能化纳米抗体对培养细胞进行内吞运输的活细胞成像

摘要

蛋白质从质膜到反式高尔基网络的内吞和逆向运输对于维持膜稳态和调控信号传导至关重要。本文介绍一种利用衍生化抗GFP纳米抗体，通过活细胞显微镜在HeLa细胞中对跨膜货物蛋白的内吞运输进行成像和定量分析的方法。

摘要

受体及其他跨膜蛋白从细胞表面向内体及更远区室的内吞作用，对于细胞稳态、生理功能和正常运作至关重要。为了研究内吞摄取及逆行性蛋白运输，我们建立了一套多功能工具包，包含经过功能修饰的纳米抗体，可用于通过固定细胞成像、活细胞成像、电子显微镜以及结合放射自显影的凝胶电泳技术，监测从细胞表面至反式高尔基网络（TGN）的运输过程。我们开发了靶向绿色荧光蛋白（GFP）或mCherry的衍生化纳米抗体——这些为单体、不发生交联、高亲和力的蛋白质结合剂，可直接添加至表达带有相应胞外荧光标签的目标膜蛋白的细胞系中。当这些纳米抗体结合于GFP或mCherry标记的跨膜报告蛋白后，会随着报告蛋白自身的内源分选通路被特异性地内化并同步运输。这些纳米抗体已被偶联不同的功能分子：通过连接特定荧光染料，实现荧光显微镜和活细胞成像下的逆行运输追踪；连接抗坏血酸过氧化物酶2（APEX2），用于电子显微镜下解析超微结构定位；连接酪氨酸硫酸化基序，以定量评估到达TGN的动力学过程。在本方法学研究中，我们详细描述了功能化纳米抗体的细菌表达与纯化通用方案，以及稳定表达GFP报告蛋白细胞系的构建方法。我们以一种经mCherry修饰的抗GFP纳米抗体（VHH-mCherry）为例，展示该方法在活细胞成像中的应用，用于分析转铁蛋白受体（TfR）和依赖阳离子的甘露糖-6-磷酸受体（CDMPR）的内吞摄取过程。

引言

受体及其他跨膜（TM）蛋白从质膜内吞至各种细胞内区室，对于维持膜稳态至关重要^1,2。通过网格蛋白依赖性或非依赖性内吞作用被内化后，这些蛋白货物首先进入早期内体，随后被进一步分选至内体-溶酶体系统、循环返回质膜，或逆行转运至反式高尔基网络（TGN）^3,4,5。从早期内体和/或细胞表面循环返回TGN是多种跨膜货物受体功能循环的一部分，例如阳离子依赖性和非依赖性甘露糖-6-磷酸受体（CDMPR和CIMPR），它们将新合成的溶酶体水解酶从TGN递送至晚期内体和溶酶体^6,7,8；Wntless（WLS）将Wnt配体转运至细胞表面^9,10,11,12；TGN46则介导可溶性分泌蛋白货物（包括胰腺上调因子（PAUF）及其他CARTS货物）从TGN的转运^13,14,15,16。尽管上述所有货物受体均需经过TGN以装载新的客户蛋白，但转铁蛋白受体（TfR）在内化铁结合型转铁蛋白后则被排除在高尔基体逆行路径之外^{17,18,19,20,21}。

为了研究内吞作用和逆向运输过程，我们先前建立了一种基于纳米抗体的工具包，旨在对从细胞表面到细胞内区室的货物蛋白进行标记和示踪¹⁷。纳米抗体是一类新型的蛋白质结合分子，来源于天然存在于骆驼科动物和软骨鱼类中的同源二聚体仅重链抗体（hcAbs）^22,23。它们代表了hcAbs的重链可变区（VHH），相较于传统抗体（如IgG）具有多种优势：呈单体形式、分子量小（约15 kDa）、高度可溶、不含二硫键、可在细菌中表达，并且可通过筛选获得高亲和力结合能力²⁴。为了增强该纳米抗体工具包的多功能性和广泛应用性，我们采用功能化的抗GFP纳米抗体，对胞外域或管腔域带有GFP标签的蛋白质进行细胞表面标记与追踪。通过将纳米抗体与mCherry、抗坏血酸过氧化物酶2（APEX2）或酪氨酸硫酸化序列进行重组偶联，可利用固定细胞和活细胞荧光显微镜、电子显微镜或基于放射自显影的生化检测方法，分析真正的跨膜货物蛋白的逆向运输过程。由于酪氨酸硫酸化是由酪氨酸蛋白硫酸转移酶TPST1和TPST2催化的翻译后修饰，且该修饰仅发生在反式高尔基体/反式高尔基网络（TGN）中，因此该策略能够直接评估货物蛋白从细胞表面至高尔基体区室的运输动态和动力学特征^25,26,27。最近，我们进一步扩展了此类功能化蛋白结合分子的种类，新增了衍生化的抗mCherry纳米抗体。这些试剂在通过生化分析解析依赖于分子机器的甘露糖-6-磷酸受体（MPRs）尤其是CDMPR向TGN运输通路方面发挥了关键作用^17,28。

尽管之前的研究主要关注通过放射自显影技术生化评估经酪氨酸硫酸化序列修饰的纳米抗体在反式高尔基网络（TGN）中的定位¹⁹，本文方法学文章则描述了荧光标记的功能化纳米抗体（VHH-mCherry）及报告细胞系的构建，用于活细胞成像中内吞运输过程的可视化。结合另一种定位于高尔基体的荧光报告蛋白，本方案可进一步优化，形成一套稳健的工作流程，用于定量分析选定货物蛋白从内体到反式高尔基网络的活细胞运输过程。

在应用本方案之前，研究人员应确保目标蛋白以GFP标签融合构建体的形式表达，通常通过标准的分子克隆方法获得。功能化纳米抗体可在细菌中高效表达，产量足以满足表面标记实验的需求，工作浓度在低纳摩尔范围内即可适用于大多数活细胞成像分析。用户还应注意，不同货物蛋白的运输动力学会存在差异，可能需要调整标记时间或成像频率，以实现对内吞作用或内体到反式高尔基网络（TGN）运输过程的最佳可视化。

方案

1. 使用 VHH-mCherry 进行细菌转化

注意：本方案已针对功能化抗GFP纳米抗体的表达、纯化和分析进行了优化，如先前所述¹⁷。以下步骤适用于VHH-mCherry，并与此前的方法学报告一致¹⁹。

1. 将适合蛋白表达的化学感受态细菌（50-100 µL）置于冰上融化（例如 Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) 细胞）。
   注意：请按照标准实验室方案制备化学感受态细菌细胞。也可使用新英格兰生物实验室（NEB）提供的市售 BL21 (DE3) 细胞。
2. 加入 50 ng 编码功能化 VHH-mCherry 构建体的质粒（Addgene #109421）。为确保在细菌表达过程中纳米抗体报告分子发生高效的位点特异性生物素化，需同时共转化编码细菌生物素连接酶 BirA 的质粒（Addgene #109424），其用量为三倍过量（150 ng）。轻轻弹击离心管 4–5 次，以充分混匀细胞与质粒 DNA。
   注意：若无需通过生物素受体肽（BAP）进行生物素化，则无需共转化编码 BirA 的质粒。
3. 将混合物置于冰上孵育 30 分钟。此步骤中避免振荡。
4. 将细菌细胞在 42 °C 水浴或加热块中准确热激 20 秒。
5. 加入 1 mL 室温（RT）的 LB 培养基（Luria broth），并将转化后的细菌在恒温振荡器中于 37 °C 孵育 1 小时（转速 250–500 rpm），以实现抗生素抗性基因的表型表达。
   注意：配制 1 L LB 培养基时，加入 5 g 酵母提取物、10 g 胰蛋白胨、10 g NaCl，加水定容后通过高压灭菌进行消毒。
6. 在 11,000 × g 离心 1 分钟以沉淀细菌，弃上清后将菌体沉淀重悬于 100 µL 新鲜 LB 培养基中，并通过移液充分混匀。
7. 将重悬的细菌涂布于预先温育的含适当抗生素的 LB 平板上（例如含 50 µg/mL 卡那霉素；若共转化了 BirA 质粒，则还需添加 50 µg/mL 羧苄青霉素，参见步骤 1.2）。
8. 将添加抗生素的 LB 平板倒置，在 37 °C 培养 13–15 小时。
   注意：本方案可在此处暂停。长出菌落的平板可用透气膜密封后储存于 4 °C，以防干燥。

2. 细菌液体培养及VHH-mCherry表达的诱导

1. 从转化平板上挑选单个细菌菌落，接种于含有20 mL添加抗生素的LB培养基的锥形瓶中。将培养物置于摇床培养箱中，在37 °C条件下振荡培养13–15小时（关于选择性抗生素的说明，另见步骤1.7）。
2. 次日，将过夜培养的20 mL细菌培养物稀释至含有相应选择性抗生素的1 L LB培养基的新鲜锥形瓶中。
3. 继续在37 °C培养，直至菌液在600 nm处的光密度（OD₆₀₀0.6–0.7 的）
   注意：在诱导蛋白表达之前，需将培养物冷却至室温或16 °C。
4. 通过加入1 mL 1 M 异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导VHH-mCherry（若共表达则包括BirA）的表达，使诱导剂终浓度达到1 mM（1:1000稀释）。若与BirA表达质粒共转化，还需向培养物中添加10 mL 20 mM D-生物素储备液，使生长培养基中D-生物素终浓度为200 µM。这有助于 体内 VHH-mCherry 构建体中生物素受体（BAP）表位的生物素化
   注意：用ddH₂O配制D-生物素储备液₂O，并通过逐步加入500 mM NaH使其溶解₂PO₄.
5. 在16 °C下将IPTG诱导的1 L培养物孵育13–15小时，以促进蛋白质的最佳折叠和表达产量。
   注意：对于新设计的带有其他荧光标签的纳米抗体构建体，其表达条件可能需要研究者通过实验进行优化。
6. 将培养物转移至1 L离心瓶中，通过5,000 x g离心收集细胞 g 4 °C 下孵育 45 分钟。将上清液弃入适当的液体生物废弃物容器中，随后进行纯化步骤。
   注意：此时可通过将细菌沉淀物保存在 -80 °C 来暂停实验流程。VHH-mCherry 沉淀物通常呈粉红色，表明荧光融合蛋白正确折叠。

基于IMAC的VHH-mCherry纯化

1. 如有需要，将冷冻的细菌沉淀在冰上解冻（另见步骤 2.6）。
2. 向细菌细胞沉淀中加入 30 mL 冰冷的结合缓冲液（含 20 mM 咪唑的 1× PBS），通过反复吹打充分重悬。将悬液转移至已标记的 50 mL 离心管中。
3. 向重悬的细胞中添加 200 µg/mL 溶菌酶、20 µg/mL DNase I、1 mM MgCl₂ 和 1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）。室温孵育 10 分钟，随后在 4 °C 下于翻转旋转仪上孵育 1 小时。
   注意：PMSF 具有毒性。请在通风橱内佩戴手套、实验服和护目镜进行配制和操作；含 PMSF 的废弃物应弃置于卤代有机废液容器中。实验中使用 0.1 M 储存液并进一步稀释。
4. 使用直接插入悬液中的探头式超声仪机械裂解细菌细胞。以指定参数连续进行三次 1 分钟的超声处理，每次超声之间间隔 1 分钟冷却时间（探头尺寸：6 mm，实心探头；振幅：40%；占空比（脉冲模式）：1 秒开/1 秒关）。
5. 在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 45 分钟，澄清裂解液，使细菌碎片和完整细菌形成沉淀。
   注意：可将裂解液转移至离心瓶或分装至 5 mL 离心管中进行台式离心。
6. 小心将上清液转移至新的 50 mL 管中，将沉淀弃入适当的生物废弃物容器中。
7. 在准备固定化金属亲和层析（IMAC）的同时，将澄清后的裂解液置于冰上保存。为分离带组氨酸标签的纳米抗体，使用预装的、一次性使用的、适用于重力流操作的 His 标签纯化柱。
8. 将 Ni-NTA（镍-次氮基三乙酸）层析柱固定在金属支架或合适的柱架上。
   1. 排出层析柱中的保存液，并用 10 mL 结合缓冲液（含 20 mM 咪唑的 1× PBS）平衡柱子。
   2. 让缓冲液依靠重力流过层析柱；将流出液作为生物废弃物丢弃。
9. 将澄清的细菌裂解液（约 30 mL）缓慢加样至层析柱中。让其依靠重力流过，并弃去流出液。
10. 用两份连续的 10 mL 结合缓冲液（含 20 mM 咪唑的 1× PBS）洗涤层析柱。
11. 用 2 mL 洗脱缓冲液（含 500 mM 咪唑的 1× PBS）洗脱结合的纳米抗体，收集至 2 mL 微量离心管中。
12. 进行缓冲液置换。
    1. 将置于 50 mL 管适配器中的脱盐柱用 5 mL 1× PBS 冲洗 5 次，以平衡脱盐柱。
    2. 让缓冲液完全进入填料中；弃去流出液。最后一次 PBS 洗涤后，在 1,000 × g 下离心 2 分钟。
    3. 弃去流出液。将带有适配器的层析柱置于新的 50 mL 管上。将 2 mL 洗脱得到的功能化纳米抗体（来自步骤 3.11）加载到 PBS 平衡的脱盐柱上，在 1,000 × g 下离心 2 分钟，收集洗脱液。
       注意：也可使用透析法进行缓冲液置换。
13. 根据制造商的操作说明，使用二辛可宁酸（BCA）法或 Bradford 法测定纯化的 VHH-mCherry 蛋白浓度。
    注意：为实现活细胞成像应用中的高效纳米抗体摄取，建议最终储存浓度为 5–10 mg/mL。

4. 骆驼单域抗体-mCherry 表达与纯度的验证（考马斯亮蓝染色）

1. 根据既定的实验室方案制备10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）。
   注：作为替代方案，可使用Bio-Rad公司提供的商用预制梯度凝胶，以提高操作的便捷性和结果的可重复性。
2. 取20 µg纯化的VHH-mCherry样品置于1.5 mL微量离心管中，加入上样缓冲液于95 °C加热5分钟进行变性处理。
3. 将变性的纳米抗体样品上样至SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，按照标准PAGE程序进行电泳，直至示踪染料（如溴酚蓝）迁移至分离胶底部。
4. 对凝胶进行考马斯亮蓝染色和脱色处理。
   1. 小心从凝胶夹中取出凝胶，浸入考马斯亮蓝染色液（将10 g/L考马斯亮蓝储备液以5%比例溶于含10%乙酸、45%甲醇的ddH₂O中）中，在室温下轻轻振荡染色20–30分钟。确保凝胶完全浸没于染色液中。
   2. 使用脱色液（含7.5%乙酸和15%甲醇的ddH₂O）进行脱色，室温下每次1小时，重复2–3次。为获得最佳背景清除效果，可将凝胶在新鲜脱色液中静置13–15小时。
      注：在脱色过程中，可在凝胶周围放置家用纸巾以有效吸附多余的染料。染色/脱色液含有易燃的甲醇和刺激性乙酸，应在通风橱中操作，佩戴手套和护目镜，并将废液收集至指定的易燃液体废物容器中。
5. 使用凝胶成像系统或合适的相机对凝胶进行成像观察。
   注：为进一步验证纳米抗体的表达，可使用特异性表位抗体进行免疫印迹分析（参见图1C）。

5. 使用逆转录病毒转导生成 GFP 标记的报告基因 HeLa 细胞系

注意：此前已构建多种GFP报告基因HeLa α Kyoto细胞系（以下简称HeLa或HeLa α）¹⁷。为演示活细胞成像实验，选用GFP标记的CDMPR或TfR作为代表性货物蛋白。对于具有I型拓扑结构的跨膜蛋白，GFP标签位于其最N端；而对于具有II型拓扑结构的跨膜蛋白，则需将GFP融合至其C末端。

1. 编码 EGFP-CDMPR（Addgene #182642）或 TfR-EGFP（#243763）的基因先前已使用标准限制性内切酶克隆技术亚克隆至逆转录病毒载体 pQCXIP 中¹⁷。将质粒转化至化学感受态 E. coli 后，使用中量质粒提取试剂盒（例如 Macherey-Nagel 公司产品）制备高纯度质粒 DNA。
   注意：化学感受态细菌细胞应按照标准实验室方案制备。可使用 NEB 公司的 NEB 5-alpha 感受态 E. coli 进行克隆和质粒纯化。
2. 为建立稳定的 GFP 报告基因 HeLa 细胞系，通过转染包装细胞系 Phoenix ampho 产生逆转录病毒颗粒。所有细胞培养操作均在 BSL2 级层流条件下进行。
   1. 转染前一天，将 2.0–3.0 × 10⁶ 个 Phoenix ampho 细胞接种于 10 cm 培养皿中，加入 10 mL 培养基，使次日细胞融合度达到 60%–80%。Phoenix ampho 细胞维持在含 10% 胎牛血清（FBS）、100 单位/mL 青霉素/链霉素和 1 mM 丙酮酸钠的高糖 DMEM GlutaMAX-I 培养基中。
   2. 转染当天，弃去原有培养基，更换为 10 mL 新鲜完全培养基。
   3. 在 1.5 mL 微离心管中，将 1 mL 无血清且无添加剂的高糖 DMEM GlutaMAX-I 与 10 µg pQCXIP-EGFP-CDMPR 或 pQCXIP-TfR-EGFP 质粒以及 30 µL FuGENE HD 转染试剂混合。用移液器充分混匀。
   4. 室温孵育 15 分钟，使 DNA 与试剂形成复合物。
   5. 将全部转染混合物逐滴加入 Phoenix ampho 细胞培养物中。轻轻摇动培养皿，使复合物均匀分布。
   6. 将转染后的 Phoenix ampho 细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 13–15 小时。
      注意：可使用其他包装细胞系，前提是其与 Retro-X Q 载体系统兼容。
3. 次日，弃去转染培养基，更换为 7 mL 新鲜完全培养基以促进病毒产生。
4. 转染后 48 小时（可选地在 72 小时）时，使用移液辅助装置收集含有病毒颗粒的培养上清液（约 7 mL）。使用荧光显微镜或成像系统（例如 Bio-Rad ZOE）监测转染后 Phoenix ampho 细胞中的 GFP 表达情况。
   注意：再次强调，逆转录病毒操作需在 BSL-2 防护条件下进行。所有操作应在经认证的生物安全柜中完成，佩戴手套、实验服和眼部防护装备，并在高压灭菌处理废弃物前，先用 1% hexaquart 消毒表面，再用 70% 乙醇擦拭。
5. 将收集的病毒上清液通过 0.45 µm 滤膜过滤。过滤后的上清液可立即使用（见步骤 5.7），或短期储存于 4 °C，长期储存于 -80 °C。注意：冷冻可能导致病毒滴度下降。
6. 为建立稳定的 GFP 报告基因 HeLa 细胞系，使用过滤后的病毒上清液进行逆转录病毒转导。所有操作必须在 BSL2 条件下进行。
   1. 转导前一天，将约 2.0–3.0 × 10⁶ 个 HeLa α 细胞接种于 10 cm 培养皿中，加入 10 mL 培养基，使次日细胞融合度达到 60%–80%。HeLa α 细胞培养于补充有 10% FBS 和 100 U/mL 青霉素/链霉素的高糖 DMEM GlutaMAX-I 培养基中。
   2. 将过滤后的病毒上清液与 15 µg/mL 多聚素（polybrene，即 hexadimethrine bromide）混合，以提高感染效率。
      注意：多聚素具有刺激性——配制储备液时应戴手套和护目镜，避免气溶胶产生，并将含多聚素的溶液作为危险化学废物处理。
   3. 次日，弃去常规生长培养基，更换为含多聚素的未稀释病毒上清液，确保完全覆盖培养皿表面。
   4. 将 HeLa α 细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 13–15 小时进行转导。
      注意：如需测定病毒滴度，可在 HeLa α 细胞上进行系列稀释和感染实验。由于逆转录病毒仅感染分裂期细胞，此处滴度测定为可选步骤。
7. 转导次日，将病毒培养基弃入 BSL2 废物容器中，并更换为 10 mL 新鲜完全 HeLa α 培养基。在 37 °C、5% CO₂ 条件下继续孵育 13–15 小时。
8. 次日开始筛选，更换为含 1.5 µg/mL 嘌呤霉素的完全培养基。
9. 维持筛选压力 2–3 周，根据需要传代细胞。在将基因修饰细胞转移至 BSL1 环境前，必须确认其不含复制能力的病毒颗粒。
10. 为获得均一细胞群体，可采用克隆环或克隆柱进行单克隆分离，或进行荧光激活细胞分选（FACS）。可使用 FACSAria III 或 Fusion（BD Biosciences）对转导后的 HeLa α 细胞进行 FACS，根据荧光强度富集 GFP 表达均一的细胞群体。
    注意：HeLa α 细胞中 GFP 报告基因的表达可通过固定细胞荧光显微镜观察或使用抗 GFP 抗体进行免疫印迹进一步验证（另见 图 2C）。

6. 用于活细胞成像的VHH-mCherry在培养细胞中的摄取

注意：所有细胞培养操作均在活细胞显微镜观察前于超净工作台内无菌条件下进行。

1. 在无菌超净工作台中，将约 50,000 至 110,000 个稳定表达 GFP 标记的 CDMPR 或 TfR 报告基因构建体的 HeLa 细胞接种至 µ-slide 4 孔 ibiTreat 培养小室的每个孔中。每孔加入 700 µL 含抗生素的完全培养基（高糖 DMEM，无酚红），并补充 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素/链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和 1.5 µg/mL 嘌呤霉素。
2. 将细胞置于 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育 13–15 小时，以促进细胞充分贴壁和增殖。次日细胞融合度应达到约 80%。
3. 成像当天，在实验开始前，轻轻将每孔中的培养基替换为 350 µL 新鲜的无酚红完全培养基。
4. 同时，在预热的无酚红培养基中配制 VHH-mCherry 工作液，终浓度为 2.5 µg/mL（约 50 nM），并在使用前维持于 37 °C。
5. 启动自动活细胞成像系统（例如 FEI MORE 或 Nikon Ti2 X-Light V3）后，在将 ibidi 显微成像小室转移至显微镜载物台前，先将显微镜的培养舱预热至 37 °C 并维持 5% CO₂，然后按以下方式设置采集参数：
   1. 选用 U PlanS Apo 100x NA 1.4 物镜，并将 ibidi 显微成像小室放置于显微镜载物台上。
   2. 设置两个通道，分别使用适合 EGFP（激发：470/20 nm，发射：517/20 nm）和 mCherry（激发：550/15 nm，发射：590/20 nm）的激发波长及单一带通发射滤光片。
   3. 选择较短的曝光时间和较低的照明强度以避免光漂白（例如 EGFP 为 50 ms 和 5% 光强，mCherry 为 160 ms 和 25% 光强）。所有实验中必须保持所选参数恒定。
   4. 针对每个条件（= 每孔），在点列表中保存 10 个不同视野的坐标，每个视野中包含 3–4 个处于焦平面的细胞。
   5. 对点列表中的每个位置进行一次单帧成像，作为添加 VHH-mCherry 前的参考图像。
   6. 为启动内吞摄取过程，轻轻向每孔加入 350 µL 预热的 VHH-mCherry 溶液，注意尽量减少对细胞单层的扰动。继续在 37 °C、含 5% CO₂ 条件下孵育。
   7. 在 37 °C、含 5% CO₂ 条件下，以每帧间隔 36 秒、共采集 100 帧的方式，对点列表中的每个位置进行重复的时间序列成像。
   8. 为减少光漂白，应按先 mCherry 通道、后 EGFP 通道的顺序进行通道采集。
   9. 为提高通量，应按先顺序采集所有位置，再重复下一时间点的方式进行采集。

7. VHH-mCherry 内吞作用的图像分析

1. 使用 Fiji 进行采集后图像预处理与数据提取
   1. 使用 Bio-Formats 导入插件并启用通道分离选项加载延时图像。
   2. 使用 MultiStackReg 插件校正横向漂移。以 EGFP 通道作为参考，并将变换同时应用于 mCherry 通道。
   3. 每个细胞使用多边形工具绘制一个感兴趣区域（ROI）（例如，在核周区域周围），并将其添加到ROI管理器中。
   4. 对于两个通道，使用 ROI 管理器的多测量功能，测量所有 ROI 及各时间点的平均荧光强度，并将结果表格保存为文本文件。
   5. 打开相应的参考图像，并对每个 ROI 重复测量。
2. 确定内吞摄取曲线的数据分析
   1. 打开文本文件，将每个帧编号减去 1，使其从 0 开始，然后将每个帧编号乘以帧间延迟时间（单位：s，即 36）。
   2. 对于每个 ROI，从 VHH-mCherry 通道对应的时间序列图像的每一帧中减去参考图像中 VHH-mCherry 通道的平均强度，以去除自发荧光和背景信号。
   3. 对每个图像帧和感兴趣区域（ROI），将减去背景后的VHH-mCherry信号强度除以EGFP通道的平均强度，以校正由VHH-mCherry以外因素引起的ROI内信号强度波动，例如高尔基体移动、细胞收缩、z轴漂移或照明不稳定。
   4. 将所得曲线归一化至其自身最大值。
   5. 选择一定范围的帧，以排除延时成像开始阶段（如添加培养基）或结束阶段（如漂移、漂白）可能出现的伪影。
   6. 使用单指数衰减函数拟合曲线数据，该函数用于模拟一级动力学过程：
      
      其中，I(t) 表示时间 t 时的归一化强度，t₀ 计算从添加 VHH-mCherry 到开始记录之间的时间延迟。根据速率常数 k 计算半衰期 τ_1/2 该过程的：
      
      注意：在每个时间点对多个后续成像的视野（FOV）进行实验时，各个对应的 t0 可能略有不同，但应从一个 FOV 到下一个 FOV 逐渐递增。
   7. 对所有数据集重复该步骤，并以箱线图报告半衰期值。

结果

为了研究蛋白质向不同细胞内区室的逆向转运过程，我们近期建立了一种基于抗GFP纳米抗体的工具，用于对来自细胞表面的重组融合蛋白进行标记和追踪¹⁷。本文描述了此类修饰型纳米抗体的细菌表达生产方法，并展示了其在活细胞成像中监测内吞摄取过程的应用价值。结合一种定位于高尔基体的荧光报告分子，该实验方案提供了一个可靠的平台，可对特定货物蛋白向反式高尔基网络（TGN）的逆向运输过程进行实时定量研究。

我们利用标准的分子克隆技术，构建了一系列具有共同模块化结构的不同功能化抗GFP纳米抗体¹⁷。尽管本研究主要关注荧光变体VHH-mCherry，但我们还提供了其他衍生的纳米抗体，以展示该工具集的多功能性，并突出其在未来应用中的潜力。我们最基础的构建体VHH-std（std代表标准）包含VHH结构域、用于基于抗体检测的T7和HA表位、用于纯化的C端六组氨酸（His₆）标签，以及一段生物素受体肽（BAP）序列，以实现酶促生物素标记和高亲和力链霉亲和素介导的pull-down实验（图1A）。基于这一核心设计，我们开发了多种纳米抗体衍生物，以促进通过生化分析、固定细胞与活细胞成像以及电子显微镜对内吞作用和逆向转运过程的研究。

为了对内吞运输进行活细胞成像，我们设计了一种带有荧光团的抗GFP纳米抗体，该荧光团的激发和发射光谱与GFP明显不同，从而确保在荧光显微镜下实现最佳的光谱分离。根据其在IPTG诱导的E. coli中优异的折叠特性以及已被充分表征的光物理性质，我们选择mCherry作为首选的荧光标签。其他红移荧光团（如单体红色荧光蛋白mRFP）在原则上也可作为替代方案，但mCherry在此系统中表现出尤为优异的稳定性和有效性。

除VHH-mCherry外，其他功能化纳米抗体具有怎样的潜力？为了研究蛋白质从质膜到反式高尔基网络（TGN）的转运过程，我们利用了TPSTs的区室特异性定位特性，这些酶仅存在于TGN和反式高尔基体囊膜中。为此，我们将源自大鼠胆囊收缩素原的串联酪氨酸硫酸化基序（2xTS）引入VHH-std中进行改造²⁹，从而实现对货物到达这些区室的生化检测。虽然将 VHH-std 与 mCherry 融合可通过对固定细胞或活细胞成像直接观察逆向运输过程，但通过与 APEX2 等过氧化物酶功能化结合³⁰ 可通过透射电镜实现超微结构定位、靶向细胞化学消融或基于邻近性的生物素化检测。此外，在纳米抗体支架中引入烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切割位点，可提供一种生化手段以区分内化与细胞表面结合的纳米抗体图1A我们先前使用 VHH-tev 构建体来监测纳米抗体结合的 EGFP-CDMPR 和 TfR-EGFP 的再循环动力学¹⁷通过在细胞外施加重组TEV蛋白酶，可轻易检测到纳米抗体标记的受体在细胞表面的重新出现，导致纳米抗体C端表位盒的特异性丢失。类似地，在本研究中所呈现的mCherry功能化的纳米抗体VHH-mCherry中引入TEV切割位点，可实现通过活细胞成像对EGFP报告分子再循环的动态评估。通过SpeI和EcoRI限制性酶切位点，将所需插入片段亚克隆至VHH-std骨架中，可轻松实现以其他蛋白结构域（如额外的荧光团、酶标签或翻译后修饰序列基序）对纳米抗体进行功能化修饰。原始研究中使用的所有功能化抗GFP纳米抗体构建体¹⁷ 已存入Addgene供公众分发。

使用上述方案，本文所示的所有纳米抗体变体均被高效、高纯度地纯化（图1B）。只有mCherry融合蛋白在纯化后表现出轻微的蛋白结构域蛋白水解剪切（图1B，第5泳道）。根据其表观分子量并通过表位特异性免疫印迹检测验证，这两种观察到的降解产物很可能对应于单独的VHH和mCherry结构域（图1C）。在未共表达BirA的情况下，VHH-mCherry的产量通常约为每次制备20 mg。根据我们的经验，共表达BirA会使纳米抗体的产量稳定减少约1/3。^rd 至1/2。由于与BSA以1:1混合的纳米抗体可被链霉亲和素-琼脂糖完全回收，表明生物素化反应基本完全（图1D).

为了评估该纳米抗体工具包在研究内吞运输中的适用性，我们构建了稳定表达EGFP标记的细胞表面受体蛋白的HeLa细胞系，这些受体具有不同的细胞内运输途径。其中包括TfR，它在质膜与早期内体（分选和再循环内体）之间循环；TGN46，通过早期内体在质膜与反式高尔基网络（TGN）之间运输；以及两种MPR（CDMPR和CIMPR），它们在TGN、质膜以及早期内体和晚期内体之间穿梭¹⁷。EGFP被融合至各受体的胞外结构域——具体而言，对于CDMPR、CIMPR和TGN46，EGFP被插入信号肽与受体序列之间；而对于TfR，则融合在其C末端。该设计保留了天然的胞质结构域，确保所有已知的分选信号保持完整，同时使EGFP标签可被胞外抗GFP纳米抗体识别结合（图1E）。对于胞外结构域异常大的CIMPR，采用了截短版本，这与先前研究结果一致，表明此类截短仍可维持正常的运输行为^31,32。

通过逆转录病毒转导建立稳定细胞系，随后进行荧光激活细胞分选（FACS），以分离表达水平适中且可比的均一细胞群体。值得注意的是，EGFP-CDMPR在免疫印迹中始终呈现为双条带，与其内源性对应物相似³³，提示存在异质性糖基化。为了评估EGFP融合蛋白是否能够重现内源性蛋白的稳态定位和表达模式，将稳定表达的细胞与亲本HeLa细胞共培养，并通过共聚焦荧光显微镜进行分析（图2B）。EGFP信号忠实地反映了相应内源性蛋白的分布。如预期所示，CDMPR、CIMPR及其EGFP标记版本主要定位于核周区域——对应反式高尔基网络（TGN）和晚期内体区室——并在外周内体中也有额外标记。内源性和EGFP标记的TGN46几乎完全定位于核周TGN，而TfR及TfR-EGFP则表现出典型的早期内体分布特征，具有明显的外周分选结构和核周再循环内体。尽管所用抗体可同时检测内源性和EGFP标记的蛋白形式（CIMPR除外），但在表达融合蛋白的细胞中，整体染色强度并未显著增强，表明EGFP构建体并未显著过表达。我们在图2B中纳入了EGFP-TGN46和EGFP-CIMPR，以便与EGFP-CDMPR和TfR-EGFP进行直接比较。细胞固定和荧光显微成像所用的实验方案已在先前的研究中描述^17,19。

利用VHH-mCherry，可通过活细胞成像监测EGFP标记的报告蛋白的内吞运输过程。为此，我们以表达EGFP-CDMPR和TfR-EGFP的细胞为例进行实验。在向培养基中加入VHH-mCherry后，使用倒置宽场荧光显微镜对细胞进行时间序列成像（视频1和视频2）。不同时间点的静态图像如图3所示。通过测量mCherry通道信号、扣除自发荧光背景，并将结果归一化至EGFP信号，以消除由于标记区室移动或焦平面轻微偏移所引起的信号波动，从而对摄取过程进行定量分析。在25 nM浓度下，培养基中VHH-mCherry的荧光信号可忽略不计，不会干扰测量结果。对报告蛋白从细胞表面运输至其细胞内区室并达到稳态分布的动力学分析，所得结果与先前发表文献中图2所示的生化实验结果一致¹⁷，其中EGFP-CDMPR的表观摄取半衰期约为9分钟，TfR-EGFP约为4分钟，分别在约43分钟和约20分钟后达到饱和。这些数值与使用免疫印迹法进行的生化摄取实验所得结果具有可比性¹⁷。原则上，也可分析纳米抗体逆行运输至特定亚细胞区域（例如MPR浓度最高的核周区域）的动力学。然而，核周区域不仅包含高尔基体/反式高尔基网络（TGN），还富集了晚期内体和循环内体。因此，纳米抗体进入核周区域的动力学特异性不足以用于分析向特定细胞器的逆行运输。为了更可靠地评估质膜到TGN的运输过程，需要稳定共表达另一种荧光蛋白标记的TGN驻留跨膜蛋白，且确保其荧光特性与GFP报告蛋白无光谱重叠。通过引入这一额外标记物，可实现对报告蛋白导入的VHH-mCherry的检测，其原理类似于此前报道的由TPSTs介导的酪氨酸硫酸化过程¹⁹。

图1设计与制备用于追踪EGFP标记细胞表面蛋白的衍生化纳米抗体。 (A) 衍生化纳米抗体的示意图概述。标准纳米抗体构建体包含一个特异性识别GFP的VHH结构域、T7和HA表位标签、生物素受体肽（BAP）以及C端六聚组氨酸（His₆) 标签用于纯化。其他纳米抗体变体包括含有串联酪氨酸硫酸化位点（2xTS）、工程化过氧化物酶 APEX2 或荧光蛋白 mCherry 的修饰。比例尺表示氨基酸（aa）长度。B细菌表达并经亲和纯化后的纳米抗体（20–50 µg）通过梯度SDS-PAGE分析，并经考马斯亮蓝染色显影。左侧标注了分子量标准（单位为kDa）。仅在VHH-mCherry中观察到轻微的蛋白水解剪切，可能发生在VHH与mCherry结构域之间。C) 使用抗 T7、HA 或 His 抗体对纳米抗体样品（10 ng）进行免疫印迹分析₆ 表位，或通过链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）检测以评估生物素化情况。D通过将纳米抗体与BSA以1:1比例孵育，随后进行链霉亲和素-琼脂糖沉淀、离心收集沉淀物并洗涤珠子，评估纳米抗体生物素化的程度。取等体积的上清液（S）和珠子结合组分（B），经SDS-PAGE分离及考马斯亮蓝染色分析。纳米抗体在珠子结合组分中的定量回收表明生物素化完全。结合组分中同时出现VHH和mCherry片段提示存在部分降解，可能发生在SDS-PAGE样品制备过程中。第2道与第3道之间的白色线条表示删除了两个无关的泳道。该图已从原文修改而来¹⁷. 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2荧光标记的EGFP标签货物受体的表达及细胞内定位。 (AEGFP融合构建体的示意图。源自分泌型跨膜蛋白的序列以黑色表示，N端信号肽和内部跨膜结构域以黄色标出，EGFP部分以绿色表示。CDMPR、TfR和TGN46构建了全长融合体，而CIMPR则采用已充分表征的截短变体，以维持正常的运输行为。比例尺表示氨基酸（aa）长度。EGFP-CDMPR和TfR-EGFP此前已有描述¹⁷. (B为了评估亚细胞定位，将稳定表达EGFP融合蛋白的HeLa细胞与亲本HeLa细胞共培养，并通过荧光显微镜进行分析。比例尺表示10 µm。C) 稳定表达EGFP标记报告蛋白的HeLa细胞经裂解后，提取蛋白并进行SDS-PAGE电泳，随后使用抗GFP和肌动蛋白（actin）抗体进行免疫印迹检测。右侧所示为分子量标记（单位：kDa）。该图已修改自¹⁷. 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 3：EGFP-CDMPR 和 TfR-EGFP 介导的纳米抗体胞吞摄取动力学的活细胞成像。在含 25 nM VHH-mCherry 的无酚红完全培养基中，于 37 °C 条件下孵育稳定表达（A）EGFP-CDMPR 或（B）TfR-EGFP 的 HeLa 细胞后，进行活细胞成像。使用半自动宽场荧光显微镜，以 36 秒为间隔，在 GFP 和 mCherry 通道中对细胞进行成像。图中显示了代表性合并静态图像，并在下方展示了各通道中核周区域的放大视图（放大倍数：2.2 倍）。（比例尺：10 µm。）另见 视频 1 和 视频 2。对（C）EGFP-CDMPR 和（D）TfR-EGFP 的纳米抗体摄取动力学进行定量分析，数据来自三次独立实验，每次实验捕获约 40 个单个细胞。为校正细胞器运动和焦平面变化的影响，将 mCherry 荧光强度相对于 GFP 信号进行归一化（norm），并以三次实验中所有细胞的均值 ± 标准差（SD）形式绘图。平均最大摄取信号被归一化至 1。对每个细胞的摄取动力学单独采用一级动力学模型进行拟合，图中曲线表示由相应速率常数的均值计算得到的平均拟合曲线。本图改编自¹⁷。请点击此处查看此图的放大版本。

视频 1：EGFP-CDMPR 介导的 mCherry 纳米抗体摄取的活细胞成像。 稳定表达 EGFP-CDMPR 的 HeLa 细胞在含有 25 nM VHH-mCherry 的完全培养基中于 37 °C 孵育，并以每 36 秒一次的间隔在 EGFP 和 mCherry 荧光通道中进行成像。该视频以每秒 5 帧的速度播放，相当于每秒压缩 3 分钟的真实时间。本视频改编自¹⁷。请点击此处下载该视频。

视频 2：TfR-EGFP 摄取 mCherry 纳米抗体的活细胞成像。 稳定表达 TfR-EGFP 的 HeLa 细胞在含 25 nM VHH-mCherry 的完全培养基中于 37 °C 培养，并以 36 秒间隔对 EGFP 和 mCherry 荧光进行成像。该视频以每秒 5 帧的速度生成，对应的时间压缩速率为 3 分钟/秒。本视频改编自¹⁷。 请点击此处下载该视频。

讨论

纳米抗体是一类快速兴起的蛋白质结合支架，相较于传统抗体具有诸多优势：分子量小、高度稳定、呈单体形式、不发生交联、不含二硫键，并且可筛选出高亲和力结合特性²⁴。在我们之前的研究中，开发并应用了通过细菌表达产生的功能化纳米抗体，用于标记细胞表面暴露的蛋白质，并监测其向细胞内不同区室的转运过程，尤其聚焦于逆向转运至反式高尔基网络（TGN）的过程¹⁷。我们采用了一种抗GFP纳米抗体以确保通用性，从而能够靶向带有细胞外GFP、YFP或mCerulean标签的融合蛋白——这些荧光标签广泛可用，且通常已有充分表征。通过将抗GFP纳米抗体功能化修饰为mCherry、APEX2或酪氨酸硫酸化基序，我们实现了对固定细胞和活细胞成像中货物摄取的可视化，可在超微结构水平上定位逆向转运区室，执行靶向区室消融，并定量评估向TGN的转运动力学。该方法的一个局限性在于需要预先对目标细胞系进行遗传改造——即通过稳定过表达或内源性标记——才能有效使用功能化的抗GFP纳米抗体。然而，该策略可轻松扩展至日益增多的针对未标记内源性靶蛋白的纳米抗体，这些纳米抗体可通过动物免疫或利用核糖体展示或噬菌体展示技术从合成VHH文库中进行in vitro筛选获得³⁴。此外，近年来已开发出针对常用表位标签（如mCherry、V5或ALFA）的纳米抗体^35,36,37。值得注意的是，我们最近利用一种具备硫酸化能力的抗mCherry纳米抗体，通过快速功能性失活，研究了GGA2缺失的HeLa细胞中CDMPR的逆向运输过程²⁸。小分子表位标签的优势在于能够保持靶蛋白的天然构象和功能，因其较少干扰关键结构域。识别这些紧凑表位（例如ALFA、V5）的纳米抗体可无缝整合到功能化纳米抗体工具包中，从而拓展其在研究内吞及逆向转运机制中的应用范围。

在本研究中，我们展示了VHH-mCherry在活细胞成像实验中的应用。通过使用EGFP-CDMPR和TfR-EGFP作为报告蛋白，我们能够可视化受体特异性的内吞摄取过程及其向稳态分布的动态进展。对这些报告蛋白从质膜到各自细胞内区室的转运过程进行定量分析，结果显示其动力学特征与先前研究中生化实验所得结果一致，相关数据见于之前研究的图2¹⁷。我们发现，EGFP-CDMPR的表观半衰期明显长于TfR-EGFP（分别为约9分钟和约4分钟），其信号分别在约43分钟和20分钟后达到饱和。这些定量结果与已发表的关于MPR和TfR转运动力学的研究数据高度一致^38,39,40。值得注意的是，VHH-mCherry构建体已引起研究领域的广泛关注，这一点从Addgene平台上的大量分发请求中可见一斑，并且该工具已在多项独立研究中成功应用^{28,41,42,43,44}。

根据显微镜配置或实验需求，mCherry标记的抗GFP纳米抗体可能并非始终最优选择。在这些情况下，使用其他荧光染料或荧光蛋白变体可能在与GFP报告细胞系联用时提供更合适的光谱特性。为解决这一问题，我们构建了一个功能化纳米抗体文库，其中包含多种荧光蛋白，如mTagBFP2、mNeptune2.5、mCardinal2、TagRFP657和iRFP670（243764-68）。这些额外的纳米抗体构建体将通过Addgene提供。使用光谱特性不同的荧光染料可实现激发光与发射光信号的清晰分离，从而在光谱重叠最小的情况下，实现最多三个荧光通道的活细胞实时成像。

尽管监测内吞作用达到稳态看似直接，但追踪蛋白质逆行运输至反式高尔基网络（TGN）则带来了更大的实验挑战。除了VHH-mCherry和一种GFP标记的报告蛋白外，还需要一种额外的荧光或可偶联染料的TGN驻留标记物，以实现可视化与定量分析。然而，某些高尔基体驻留蛋白会部分泄漏至细胞表面，这种现象在细胞内运输通路受到干扰时可能进一步加剧，例如实验操作中对运输机制组分的干预即可能引发此类问题。例如，TGN46尽管发挥作为介导特定分泌性货物从TGN向细胞表面运输的载体受体功能，仍常被用作高尔基体驻留标记物^16,45。类似地，诸如β-1,4-半乳糖基转移酶等糖基转移酶也已在质膜上被检测到⁴¹。尽管这些蛋白可循环至细胞表面，其主要的稳态定位仍保留在TGN内。将此类标记物与光谱上可区分的荧光蛋白或可兼容染料的标签（如SNAP、Halo等）融合，并与GFP标记的跨膜报告蛋白稳定共表达，即可实现对TGN到达过程的定量活细胞成像。该过程可参照上述实验流程进行测量，通过量化mCherry信号在对应于高尔基体驻留融合蛋白的荧光通道中的积累来进行分析。目前研究固定或活细胞中逆行运输的常用策略，通常依赖于嵌合受体构建体与IgG抗体（如CD8）的联合使用^46,47。然而，由于传统IgG在细胞表面标记时具有双价性，其内在的交联风险可能显著改变标记蛋白的细胞内命运，通常在内吞后将其导向溶酶体降解^48,49。相比之下，纳米抗体（nanobody）因其单价性质和1:1的结合化学计量比，不会诱导交联，从而保持了目标蛋白的生理运输路径。这使得基于纳米抗体的方法在研究真实的逆行运输动力学时尤为有价值，避免了人为引入的运输路径偏差。

进行活细胞成像时，为使本实验方案达到最佳效果，需仔细滴定纳米抗体浓度，因为过量的纳米抗体会导致培养基中未结合的纳米抗体产生较高的背景荧光。此外，在滴定过程中必须考虑不同GFP报告细胞系表达水平的差异，以确保定量比较的准确性。在纳米抗体的表达过程中，大肠杆菌（E. coli）的低温诱导至关重要，有助于mCherry结构域的正确折叠。较高的诱导温度通常会导致蛋白错误折叠或降解，因此不推荐使用。

该方案的成功关键取决于以下三个方面：首先，功能性纳米抗体构建体的高产量表达和高纯度，以确保标记的一致性并最大限度减少背景信号；其次，使用经过充分表征的、稳定表达GFP标记报告蛋白且该蛋白定位于细胞表面的细胞系，以重现生理状态下的运输途径；第三，荧光显微镜系统的优化操作与配置，包括成像参数和光谱分离，以实现对货物运输动态的准确定性和定量分析。

本文所述方法与实验方案以使用mCherry标记的抗GFP纳米抗体为核心，能够在培养的哺乳动物细胞中对货物蛋白从细胞表面到内吞区室的转运过程进行定性和定量追踪。当与荧光标记的高尔基体定位标志物共表达时，该方法还可用于分析逆行运输通路。因此，该工具为监测细胞表面跨膜蛋白和受体的细胞内运输提供了强有力的策略，而这些蛋白和受体由于缺乏特异性配体或兼容的单体结合试剂，此前难以进行标记。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗GFP抗体	Sigma-Aldrich	118144600001	产品由 Sigma-Aldrich 销售，但由 Roche 生产
100毫米细胞培养皿	TPP	TPP93100
抗肌动蛋白抗体	EMD Millipore	MAB1501
抗HA抗体	从实验室	由12CA5杂交瘤制备
抗His6抗体	Bethyl Laboratories	A190-114A
抗T7抗体	Bethyl Laboratories	A190-117A
BL21(DE3) 感受态细胞 E. coli	NEB	C2527H
二水合氯化钙	默克密理博	102382	溶于无菌水，储存液浓度为 1 M
羧苄西林二钠盐	Applichem	A1491	溶于无菌水，储存液浓度为100 mg/mL
考马斯亮蓝R（Brilliant Blue）	Sigma-Aldrich	B-0149
D-生物素	Sigma-Aldrich	B4501	溶于无菌的500 mM NaH2PO4 或 DMSO
一次性PD10脱盐柱	GE Healthcare	GE17-0851-01
DMEM GlutaMAX-I	赛默飞世尔科技	61965026
DMEM，高糖，无谷氨酰胺，无酚红	赛默飞世尔科技	31053028
DNase I	Applichem	A3778	溶于无菌水
杜尔贝科’无钙杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）2+/毫克2+	Sigma-Aldrich	D8537
胎牛血清（FBS）	赛默飞世尔科技	A5256701
Filtropur S，PES，孔径öße：0.45 µm	Sarstedt	83.1826
FuGENE HD 转染试剂	Promega	E2311
玻璃盖玻片（No. 1.5H）	VWR	631-0153
山羊抗小鼠 HRP	Sigma-Aldrich	A-0168
辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊抗体	Sigma-Aldrich	A-0545
His缓冲液试剂盒	Cytvia	11003400
His GraviTrap 柱	Cytvia	11003399
ibidi µ-滑动4孔板，ibiTreat	80426-IBI	ibidi
异丙基-β异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）	Applichem	A1008	溶于无菌水，贮存液浓度为 1 M
硫酸卡那霉素	Applichem	A1493	溶于无菌水，储存液浓度为100 mg/mL
L-谷氨酰胺	Applichem	A3704
溶菌酶	Sigma-Aldrich	18037059001	产品由 Sigma-Aldrich 销售，但由 Roche 生产
六水合氯化镁	默克密理博	105833	溶于无菌水，储备液浓度为 1 M
Mini-Protean TGX 凝胶，4-20%，15 孔	Bio-Rad	4561096
改良的HeLa京都细胞	从实验室
NEB5-alpha 感受态细胞 大肠杆菌	NEB	C2987U
NucleoBond Xtra Midi Plus，10次制备	Macherey-Nagel	740412.1
青霉素/链霉素	生物概念	4-01F00-H
苯甲基磺酰氟（PMSF）	Applichem	A0999.0025	溶于40% DMSO和60%异丙醇中，储存液浓度为500 mM
Phoenix ampho细胞系	诺兰实验室
Polybrene（六亚甲基溴化铵）	Sigma-Aldrich	H9268
嘌呤霉素	Invivogen	ant-pr-1
氯化钠	默克密理博	106404	溶于无菌水，贮存液浓度为 5 M
丙酮酸钠	赛默飞世尔科技	11360039
Trans-Blot Turbo 小型装	Bio-Rad	1704158
胰蛋白胨	Applichem	A1553
酵母提取物	Applichem	A1552