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研究文章

姜黄素通过miR-22介导调控视网膜母细胞瘤中Wnt/β-catenin信号通路

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DOI：

10.3791/69300

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2025年9月26日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cataract, Tianjin Eye Hospital, 2Academy of Medical Engineering and Translational Medicine, Tianjin University, 3School of Medicine, Nankai University Affiliated Eye Hospital, 4Tianjin Key Laboratory of Ophthalmology and Visual Science, Tianjin Eye Institute, Tianjin Eye Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究提出了一种通过调控Wnt/β-catenin通路和miR-22表达来评估姜黄素对视网膜母细胞瘤细胞行为影响的实验方案。

摘要

视网膜母细胞瘤（RB）是一种常见的婴幼儿及儿童眼内恶性肿瘤，但其确切的病因和发病机制尚未完全阐明。姜黄素是一种生物活性多酚，可抑制肿瘤进展 通过 microRNA介导的Wnt/β-catenin信号通路调控。本研究旨在通过探讨姜黄素对视网膜母细胞瘤（RB）中miRNA-22（miR-22）表达的调控作用及其潜在的分子机制，阐明姜黄素在RB中发挥抗肿瘤效应的途径。采用两种经验证的视网膜母细胞瘤模型（SO-RB50/WERI-Rb-1），以不同浓度的姜黄素进行处理。为明确miR-22对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用，将靶细胞转导miR-22模拟物慢病毒或无功能对照慢病毒。通过将人视网膜母细胞瘤细胞接种于小鼠体内建立异种移植瘤模型，以观察其效应 体内 姜黄素对肿瘤大小、miR-22 表达以及 Wnt/β-catenin 蛋白水平的影响。细胞增殖、侵袭和凋亡分别通过 CCK-8、Transwell 和 Annexin V-APC-PI 双染法进行评估。miR-22 水平通过 RT-PCR 定量，Wnt1 和 β-catenin 的表达水平通过 Western blot 分析确定。姜黄素处理导致视网膜母细胞瘤（RB）细胞增殖和侵袭能力下降，同时促进细胞凋亡并上调 miR-22 表达。抑制 miR-22 可减弱姜黄素对 Wnt/β-catenin 信号通路的作用。在异种移植实验中，姜黄素显著减小肿瘤体积，并增强肿瘤内 miR-22 的表达，有效抑制 Wnt/β-catenin 信号传导。这些结果表明，姜黄素通过上调 miR-22 表达并进而抑制 Wnt/β-catenin 通路，从而抑制 RB 细胞的增殖和侵袭，并促进细胞凋亡。

引言

视网膜母细胞瘤（RB）是一种起源于视网膜组织的高度侵袭性儿童恶性肿瘤，对儿童健康构成重大威胁，尤其影响五岁以下儿童。遗传突变，特别是影响 RB1 基因的突变，与该疾病的发生密切相关1。鉴于视网膜母细胞瘤（RB）在婴幼儿和儿童中具有较高的发病率，且全球每年约报告9000例新发病例，其中主要集中在低收入和发展中地区，因此深入理解该疾病的发病机制对于开发有效的治疗策略并改善患者预后至关重要2。多年来，针对RB的研究主要集中于基因组改变，特别是miRNA表达的变化3。其中，miR-34a和miR-22已被证实是RB肿瘤发生过程中的关键调控因子4,5。在这些miRNA中，miR-22已被证明在多种癌症的肿瘤发生中发挥作用6,7,8，影响细胞增殖、侵袭和迁移能力6,9。此外，既往研究显示，在小鼠和人类的RB细胞系中，miR-22的表达水平均降低，进一步凸显了其在该疾病中的潜在作用10。

姜黄素是姜黄（Curcuma longa）根茎中主要的生物活性姜黄素类化合物，长期以来一直是传统医学和亚洲烹饪中的基本成分11。其广泛的药理学特性，包括抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗氧化和神经保护作用，在生物医学研究中受到广泛关注12,13,14。大量研究探讨了姜黄素在视网膜母细胞瘤（RB）中的抗肿瘤作用，揭示了其对多种信号通路的影响，包括NF-κB15、JAK/STAT16和MRP117。与这些先前研究的通路相比，姜黄素-miR-22/Wnt/β-catenin轴可能提供更精准和特异的作用途径，有望提高治疗效果并减少脱靶效应。

既往研究表明，姜黄素具有抗肿瘤作用 通过 调控肝细胞癌中的TET1/Wnt/β-catenin信号通路轴18 结肠癌细胞19然而，姜黄素是否能够通过影响Wnt/β-catenin信号通路来抑制视网膜母细胞瘤（RB）细胞的肿瘤进展，目前尚不清楚。近期研究报道，在视网膜母细胞瘤细胞和口腔鳞状细胞癌中，miR-22表达下调与Wnt/β-catenin信号通路活性的改变相关。20,21考虑到实际应用性，姜黄素在特定浓度范围（10–40 µM）内表现出有效的抗肿瘤活性 体外)15,22 并且可以给药 体内 具有可控的药代动力学特性，有利于转化研究。因此，本研究旨在建立一种视网膜母细胞瘤（RB）模型，以探究姜黄素是否能够上调miR-22水平，进而抑制Wnt/β-catenin信号通路活性，从而提供一种相较于传统的NF-κB、JAK/STAT或MRP1调控策略更具效率且更贴近临床应用的治疗方案。

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方案

所有涉及动物的实验程序均经过天津眼科医院动物伦理与福利委员会（AEWC）审查并批准（批准号：NKYY-DWLL-2023-054）。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 细胞培养

人视网膜母细胞瘤细胞系WERI-Rb-1和SO-RB50在添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的高糖Dulbecco改良Eagle培养基中培养。细胞以适当密度接种于培养瓶中，并在含5% CO2的湿润环境中37 °C条件下培养。每2-3天更换一次培养基，当细胞融合度达到70%-80%时，采用标准胰酶消化法进行传代。

2. 动物实验

共使用48只无特定病原体的Balb/c裸鼠（4周龄，16-18 g）。动物饲养在无菌、独立通风的笼具中，环境条件控制在26-28 °C，相对湿度40%-60%。饲料、水和垫料在使用前均经过灭菌处理。小鼠可自由摄食和饮水，实验前适应性饲养一周。

3. 动物分组与处理

采用稳定转染 miR-22 模拟物或阴性对照序列的 WERI-Rb-1 和 SO-RB50 细胞进行肿瘤接种。取对数生长期的细胞，收集后重悬于无菌磷酸盐缓冲液中，并调整细胞密度至 5 × 107 个细胞/mL。每只小鼠在右前肢皮下注射 0.1 mL 细胞悬液。将小鼠随机分为六组（每组 n = 6）：模型组、姜黄素组、miR-22 模拟物组、miR-22 模拟物 + 姜黄素组、miR-22 阴性对照组、miR-22 阴性对照 + 姜黄素组。对于接受姜黄素处理的组，自肿瘤细胞接种后立即开始，每日一次腹腔注射 15 mg/kg 姜黄素。其余各组给予等体积的 DMSO 作为溶剂对照。

4. 肿瘤重量和体积测量

在异种移植裸鼠中，肿瘤成瘤率约为80%–90%。每周使用数字卡尺测量肿瘤大小，以最长直径记录为长度（L），最短直径记录为宽度（W）。肿瘤体积通过公式 V = (L × W2)/2 计算。定期监测小鼠的肿瘤生长情况和健康状况，当肿瘤体积超过1,500 mm3，或动物出现痛苦迹象或体重下降时，实施人道终点。第4周结束时，小鼠通过吸入CO2实施安乐死，随后进行颈椎脱位以确保死亡。肿瘤组织在切除后立即分离并称重。

5. microRNA 转染

转染实验中使用的合成寡核苷酸包括：miR-22 模拟物、阴性对照、抗 miR-22（20-甲氧基修饰）、抗 miR 阴性对照、Wnt1 特异性 siRNA 以及对照 siRNA。转染前一天，将处于 70%–80% 汇合度的细胞接种于 6 孔板中。根据制造商说明书，使用脂质转染试剂进行转染。每个孔中的核酸用无血清培养基稀释，并按推荐比例与转染试剂混合形成转染复合物，室温孵育 15–20 分钟后，逐滴加入含完全培养基的细胞中，每孔终体积为 2 mL。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 6 小时后，更换为新鲜的完全培养基。细胞继续培养 48 小时后进行后续检测。转染效率通过定量实时 PCR 进行评估。针对 Wnt1 的三种不同 siRNA（si-Wnt1-1：5'-CCAAGAGTCTGCAACTGGTACTCGA-3'；si-Wnt1-2：5'-CGAGAAACGGCGTTTATCTTCGCTA-3'；si-Wnt1-3：5'-GCTTCCTCATGAACCTTCACAACAA-3'）被单独使用或等摩尔混合使用，以尽量减少脱靶效应。

6. 细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测

将细胞以每孔100 µL完全培养基中5 × 103个细胞的密度接种至96孔板中，过夜培养使其贴壁。随后用指定浓度的姜黄素处理一定时间后，每孔直接加入10 µL CCK-8工作液。仅含培养基的孔作为空白对照。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育4小时，然后使用酶标仪在490 nm波长处测定吸光度。细胞活力按如下公式计算：

存活率 (%) = 光密度计算公式，吸光度测量的比值方程。 × 100

绘制了剂量-反应曲线，并据此确定了姜黄素的半数抑制浓度（IC50）。

7. Transwell 实验

进行迁移实验时，将细胞悬浮于无血清培养基中，并以每孔200 µL接种至Transwell小室的上室（孔径8 µm），每孔接种量为3 × 105个细胞。下室加入600 µL含10%胎牛血清的完全培养基作为趋化因子。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。孵育结束后，用无菌棉签轻轻擦去膜上表面未迁移的细胞。Transwell小室用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗两次，随后在4 °C下用5%戊二醛固定30分钟，再次冲洗后于室温下用0.1%结晶紫染色30分钟。用PBS洗涤以去除多余染料。将膜自然晾干，在倒置显微镜下以400×放大倍数观察已迁移的细胞。定量分析时，每孔随机选取三个视野进行成像，并计算细胞的平均数量。

8. Annexin V-APC-PI 检测

收集各组细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，于4 °C下以300 × g 离心5分钟。将细胞沉淀重悬于300 µL 1×结合缓冲液中，细胞密度约为1 × 106 个细胞/mL。加入5 µL Annexin V-APC，样品在室温避光孵育15分钟。流式细胞术检测前立即向200 µL细胞悬液中加入5 µL碘化丙啶，室温孵育5分钟。使用配备适当检测通道（APC和PI）的流式细胞仪分析样品，并采用标准设门策略处理数据，以区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。

9. qRT-PCR 分析

采用苯酚-氯仿法提取总RNA，并通过紫外分光光度法测定其浓度和纯度。逆转录反应中，使用1 µg总RNA，在20 µL反应体系中加入逆转录预混液，按照制造商提供的说明书进行操作。定量PCR反应体系为20 µL，包含2 µL cDNA、10 µL SYBR Green预混液以及每种引物0.4 µM。反应在实时荧光定量PCR系统上运行，循环程序如下：95 °C 预变性1 min，随后进行40个循环，每个循环为95 °C 变性15 s，63 °C 退火延伸25 s，每轮循环结束时采集荧光信号。扩增结束后进行熔解曲线分析，温度范围为55 °C 至95 °C，以验证扩增产物的特异性。每个样本设三个重复孔，相对表达量采用2-ΔΔCt法进行计算。microRNA定量以U6作为内参基因，mRNA归一化则使用β-actin作为内参基因。

引物序列如下：U6：上游引物 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；miR-22：上游引物 5'-GCCTGAAGCTGCCAGTTGA-3'，下游引物 5'-GTGCAGGGTCGAGGT-3'；Wnt1：上游引物 5'-CGATGGTGGGGTATTGTGAAC-3'，下游引物 5'-CCGGATTTTGGCGTATCAGAC-3'；β-actin：上游引物 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'。扩增数据由系统软件进行处理。所有引物均购自商业供应商。

10. 蛋白质印迹（Western blot）

使用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液从培养的细胞或组织中提取蛋白质，并采用二辛可宁酸法测定蛋白质浓度。等量蛋白质（每泳道40 µg）在恒定电压下通过10% SDS-PAGE分离（浓缩胶80 V，分离胶120 V），然后使用湿转系统在100 V条件下转移至聚偏二氟乙烯膜上，转膜时间为90分钟。将膜置于含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBST）中，加入5%脱脂奶粉，室温封闭1小时。Wnt1、β-catenin和β-actin的一抗用含1%脱脂奶粉的TBST按1:1000稀释，4 °C下与膜孵育过夜。用TBST洗涤三次（每次10分钟）后，膜与辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5000稀释）在室温下孵育1小时。再次用TBST洗涤三次后，使用增强型化学发光检测试剂显色，并通过数字成像系统捕获信号。使用ImageJ软件对条带强度进行定量分析。

11. 荧光素酶检测

构建了含有Wnt1 3′非翻译区（3′UTR）及预测的miR-22结合位点的野生型报告质粒（Wnt1-WT），以及结合位点被破坏的突变型报告质粒（Wnt1-MUT）。将人视网膜母细胞瘤细胞以每孔1 × 105个细胞的密度接种于24孔板中，并使用脂质体转染试剂将Wnt1-WT或Wnt1-MUT报告质粒分别与miR-22模拟物（mimic）或阴性对照共同转染至细胞中。每孔使用500 ng报告质粒和50 nM miRNA模拟物或对照。在37 °C、5 % CO2条件下孵育48小时后，加入100 µL被动裂解缓冲液裂解细胞。按照制造商说明书，使用双荧光素酶报告基因检测系统依次检测海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶的活性。以海肾荧光素酶活性为内参对萤火虫荧光素酶活性进行归一化，以校正转染效率。每个实验条件设三个复孔，并独立重复三次生物学重复实验。

12. 统计分析

所有数据均以至少三次独立生物学重复实验的均值 ± 标准差（SD）表示。统计分析使用统计学软件进行。多个组之间的比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验。当p值小于<0.05 时，认为差异具有统计学意义。

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结果

姜黄素对人视网膜母细胞瘤细胞呈剂量依赖性的抗增殖和抗侵袭作用，并伴随Wnt/β-catenin通路的失活
在24小时时间内，用人视网膜母细胞瘤（RB）细胞经不同浓度姜黄素处理。研究结果表明，细胞活力和侵袭能力随姜黄素浓度增加而呈剂量依赖性下降，同时伴随细胞凋亡增加。具体而言，当姜黄素浓度从10 µM增加至50 µM时，与未处理组相比，SO-Rb50和WERI-Rb-1两种细胞系的细胞增殖均呈进行性降低（图1A）。姜黄素对SO-Rb50细胞的IC50为35 µM，对WERI-Rb-1细胞为38 µM。此外，在两种细胞系中，姜黄素均以剂量依赖方式显著抑制细胞侵袭（图1B），并提高细胞凋亡率（图1C）。重要的是，在使用10–50 µM姜黄素处理后，两种细胞系中Wnt1和β-catenin蛋白表达均呈现剂量依赖性下调（图2A、B）。<...

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讨论

姜黄素是一种从姜黄（Curcuma longa）根茎中提取的多酚类化合物，以其抗炎、抗血管生成、抗增殖和抗氧化特性而著称23,24。此外，姜黄素还具有抗肿瘤作用，尤其是能够诱导恶性细胞发生凋亡25。尽管先前的研究已强调了姜黄素对视网膜母细胞瘤（RB）细胞的生长抑制作用22,26,27，但目前对姜黄素在RB治疗中发挥抗肿瘤活性的具体分子机制仍了解有限。本研究证实了姜黄素对人视网膜母细胞瘤细胞具有细胞毒性作用，表现为剂量依赖性地抑制细胞增殖和侵袭，并促进细胞凋亡。此外，姜黄素在RB细胞及组织中均能上调miR-22的表达，同时抑制Wnt/β-catenin信号通路。这些分子变化与细胞增殖和侵袭能力下降以及凋亡增强相关。研究提示，miR-22的上调是介导姜黄素抗肿瘤效应的关键因素。2012年，Sr...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

国家自然科学基金（82271218）；天津市眼科医院科研基金（一般项目 ykyb1908）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Annexin V-APC/PI 双染试剂盒SolarbioCA1020通过流式细胞术定量评估视网膜母细胞瘤（RB）细胞的凋亡情况
CCK-8 检测试剂盒BeyotimeC0038在 490 nm 处测定吸光度，以评估细胞增殖能力
CO2 培养箱Eppendorf为视网膜母细胞瘤（RB）细胞的扩增提供最佳培养条件（37°C、5% CO2 及饱和湿度）
姜黄素SigmaC1386研究姜黄素对视网膜母细胞瘤（RB）的抗肿瘤作用
ECL 化学发光底物BiossC05-07004 用于 Western 印迹分析中蛋白条带的显影
胎牛血清（FBS）VivaCellC04001-500 C04002-500细胞培养
流式细胞仪Beckman CoulterGallios定量分析细胞凋亡率
ImageJ 软件美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）版本 6用于 Western 印迹条带分析，评估蛋白表达水平
倒置显微镜OlympusCKX53在 Transwell 实验中以 400× 放大倍数观察并计数侵袭细胞
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015细胞转染
酶标仪 ThermoK3酶联免疫吸附测定（ELISA）定量分析
miR-22 模拟物慢病毒Hanheng Biotechnologyhsa-miR-22建立稳定转染细胞系用于动物实验
多重实时荧光定量 PCR 系统Bio-RadCFX384进行定量 RT-PCR（qRT-PCR），实现基因表达的精确分析
青霉素-链霉素（PS）AbbkineBMC1030添加至细胞培养基中以防止细菌污染
蛋白提取试剂盒SolarbioBC3640-50T从细胞和组织样本中分离蛋白
psiCHECK-2 载体promegaJR20110328构建 Wnt1-WT（野生型）和 Wnt1-MUT（突变型）报告质粒，用于研究 miR-22 与 Wnt1 3'UTR 的相互作用
PVDF 膜MerckISEQ00010蛋白印迹
兔 IgG 二抗Cell Signaling Technologies14708通过结合一抗实现 Western 印迹检测
SPSS 统计分析软件IBMSPSS 20.0对实验数据进行统计学分析
SuperScript III 第一链合成 SuperMix 试剂盒Invitrogen11752-050 将 RNA 逆转录为 cDNA，用于后续 RT-PCR 分析
SYBR Premix Ex Taq II 试剂盒TaKaRa BioRR820A用于 RT-PCR 定量检测 Wnt1、β-actin 及其他目的基因的表达
TRIzol 试剂Invitrogen12183-555从细胞和组织样本中提取 RNA
紫外分光光度计BeckmanDU800测定 RNA 样本的浓度和纯度
Wnt1 抗体Abcamab15251通过 Western 印迹分析检测 Wnt1 蛋白表达
β-actin 抗体Abcamab8227作为内参用于 Western 印迹分析中蛋白上样量的标准化
β-catenin 抗体Cell Signaling Technologies37447通过 Western 印迹分析检测 β-catenin 蛋白表达

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