一种经济高效且微创的自由活动小鼠多部位慢性脑电图记录方案

摘要

本方案旨在建立一种可靠且易于操作的系统，用于记录自由活动啮齿类动物的脑电图（EEG）。

摘要

脑电图（EEG）是追踪大脑电活动的基本工具，在临床诊断和临床前动物研究中日益重要。尽管啮齿类动物脑电图是模拟人类神经系统疾病的有效平台，但长期记录常受限于现有系统的高成本、侵入性或技术复杂性。本文介绍一种可靠、易于获取、经济可行且侵入性最小的慢性多部位皮层脑电图记录方案，适用于自由活动的小鼠。该技术包括制作用铂铱合金导线连接至通用串行总线（USB）接口的螺钉电极，并通过颅骨螺钉将其固定于硬脑膜外，再使用粘合剂和牙科水泥加固。该系统可在数月内实现稳定的信号采集，在野生型C57BL/6J小鼠中验证显示术后存活率达85%（n = 20）。脑电信号以1,000 Hz采样频率采集，并通过差分放大器系统在1 Hz至500 Hz范围内进行滤波。为验证系统性能，给予戊四氮（20 mg/kg）以诱发类似癫痫发作的活动，结果显示发作间期放电显著增加——从基线水平的每分钟2–5次上升至注射后的每分钟20–51次，同时伴随信号幅度升高。放电事件的识别依据波形形态及符合公认电生理标准的信号特征。该系统可与行为视频追踪及开源分析流程兼容，支持与药理学、遗传学或神经调控研究相结合。该方法为研究啮齿类动物模型中的脑网络动态提供了稳定且可灵活调整的平台，在癫痫研究及其他领域具有广泛应用前景。

引言

脑电图（EEG）可直接测量大脑的电活动，广泛用于癫痫的诊断¹。近年来，EEG 技术 increasingly 被应用于小型动物模型，以研究神经系统疾病、睡眠生理学以及脑网络动态^2,3,4。随着基因修饰小鼠模型的出现以及记录技术的显著进步，啮齿类动物 EEG 已成为临床前研究的重要工具，为与人类脑健康相关的转化机制提供了宝贵的见解^5,6。

同时捕获和调控神经活动对于在宏观和微观神经环路水平上研究大脑动态至关重要。这种双重方法能够实时监测参与癫痫发作起始和进展的神经网络。癫痫以反复且常常不可预测的发作特征，源于复杂脑环路的功能紊乱⁴。尽管已有大量研究，但由于缺乏可在多个脑区同时进行记录的技术，关于癫痫发作传播和起始机制的理解仍不充分⁷。

在模拟人类神经系统疾病的动物模型中进行的脑电图记录，已揭示出与人类患者极为相似的发作间期尖波、尖慢波放电以及癫痫发作起始模式^8,9，从而推动了我们对人类大脑电生理变化的理解。类似地，在阿尔茨海默病、自闭症谱系障碍和精神分裂症模型中检测到的脑电图异常，为神经振荡活动的紊乱提供了关键见解，并提示了潜在的治疗靶点¹⁰。

尽管小鼠与人类在大脑解剖结构和规模上存在差异，两者的脑电图（EEG）却表现出显著的相似性^2,11。两者均表现出特征性的振荡频率波段——δ（delta）、θ（theta）、α（alpha）、β（beta）和γ（gamma）波，其功率谱通常遵循1/f分布规律^2,11。大脑状态之间的转换在物种间也具有保守性，例如非快速眼动（NREM）睡眠期间出现δ波活动，或在注意力和记忆任务中γ波同步性增强。此外，癫痫样活动（包括高频振荡（HFOs）和发作期放电模式）在小鼠与人类中也表现出相似的时间动态和频谱特征⁷。

啮齿类动物和人类脑电图（EEG）的保守特征使得小鼠模型在研究脑部疾病方面具有高度的可转化性。小鼠脑电图能够实现侵入性、高分辨率的记录，从而支持详细的神经环路水平分析¹²。它还可用于测试神经调节策略，包括药理学试剂、光遗传学控制以及闭环刺激^13,14，这些方法可与行为学和分子工具相结合，以精确探究神经功能障碍。

然而，在推断研究结果时必须谨慎。小鼠大脑体积较小且皮层结构较简单，可能影响信号传导，其认知事件相关电位（ERPs）可能不如人类显著¹⁵。确保电极放置、信号参考及分析流程的一致性，对于提高实验的可重复性及跨实验室有效性至关重要¹⁶。

在小型动物中记录脑电图（EEG）既带来机遇也面临挑战。小鼠的脑电图通常通过长期植入的电极获取，电极可置于颅骨表面的硬膜外，或作为深部电极插入皮层下结构^17,18。置于软脑膜上的表面电极（如螺钉电极或导线电极）具有较小的侵入性，适用于长期、纵向的记录。这类电极位于颅骨之下，而颅骨本身对信号记录构成高阻抗屏障。因此，啮齿类动物的软脑膜电极更接近于皮层脑电图（electrocorticography, eCoG），而非传统意义上的脑电图（EEG）。相比之下，深部电极具有更高的空间分辨率，能够进入海马体、丘脑或杏仁核等深脑区域，有助于研究癫痫网络以及跨脑区分布的振荡耦合^2,11。

用于啮齿类动物的现代脑电图（EEG）系统支持多通道记录，具有高时间分辨率，通常与视频监测相结合以进行行为相关性分析¹⁸。此外，无线EEG系统可在自由活动的动物中实现无束缚的实时数据采集，最大限度地减少运动限制和应激反应¹⁹。尽管随着时间推移，这些现代化技术已实现商业化，但它们要么价格昂贵，要么对啮齿类动物模型的长期研究具有过高的侵入性。

为弥补这一空白，我们提出了一种适用于啮齿类动物模型的多部位脑电图（EEG）采集的通用且经济高效的方案，该方案适用于侵入性最小的长期研究。这种脑电图记录方法特别适用于在受控实验条件下对小鼠皮层活动进行高分辨率评估的研究。该方法最适用于以下情况：（i）动物能够耐受电极植入过程中的短暂麻醉并完全恢复；（ii）记录期间可确保头部稳定固定或动物活动极少；（iii）需要对神经活动进行长期或重复监测；（iv）实验设计可根据放大器能力支持单只或有限数量的多只动物同步记录。研究人员应考虑这些限制条件，以判断该方法是否符合其具体的实验目标。

方案

本方案已获得奥古斯塔大学动物护理与使用委员会的批准。实验的每一步均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》。已采取一切可能的措施以尽量减少本研究中所使用的动物数量。本研究使用的小鼠为2月龄的野生型C57Bl6J小鼠。各步骤所需的操作时间已在相应步骤中注明。

1. 准备带电极的插头针（5 分钟）

1. 使用5针的USB B型母头插针与直径0.003"的铂铱合金丝进行焊接。焊接前需去除导线表面的绝缘涂层。五个插针中的第四个为接地针，不得用于连接电极（图1A）。其余4个插针用于连接电极。
2. 将插针弯曲约45°，并将导线在每个插针上缠绕两圈，以确保导线连接牢固，不会脱落（图1A）。
3. 在每个插针上添加少量焊锡松香助焊膏，以清洁插针表面，确保有效焊接。
4. 在每个插针上放置一小段焊锡丝，使用电烙铁将其熔化，从而将插针永久固定在铂铱合金丝上（图1B-D）。
   注意：使用45°角度的镊子夹持导线，并用另一把镊子辅助缠绕插针。整个操作应在明场显微镜下进行。完成缠绕和焊接后，剪去多余的导线，保留另一端与电极相连。手术前需对带有铂铑丝的连接器及电极进行灭菌处理。

2. 植入电极（30 分钟）

1. 将小鼠置于麻醉舱中进行麻醉，并将其固定在立体定位仪上。在将小鼠固定于立体定位仪之前，通过捏压后肢确认其已充分麻醉且无反应。迅速开启鼻部异氟烷/氧气挥发器，流速设为1.5%（v/v）。
2. 注射卡洛芬（5 mg/kg）以减轻炎症反应和疼痛，以及地塞米松（0.1 mg/kg，肌内注射）以减轻炎症和脑肿胀。使用眼膏保持眼睛湿润，因为长时间暴露于麻醉剂可能导致眼睛干燥并造成损伤。
3. 使用脱毛剂或剃刀去除颅骨顶部的毛发，暴露皮肤。采用无菌技术，使用70%乙醇和碘垫清洁切口区域。
4. 使用手术刀在头部中央做一次清晰的单一切口。沿切口剪开组织，暴露电极植入部位。确保不暴露肌肉组织（图2A）。
5. 用0.9% NaCl溶液冲洗并干燥表面。用浸有或蘸取过氧化氢的棉签擦拭表面。若骨面上有顽固的结缔组织，可用手术刀小心去除。擦拭后至少等待1分钟。
6. 在开始钻孔前，再次用0.9% NaCl溶液冲洗并干燥表面。
7. 使用牙科钻头将颅骨表面打磨粗糙，以增强丙烯酸树脂的粘附性。
8. 测量并标记电极植入位置（前囟后：+2，-4；外侧：±1.5）²⁰（图2B）。
9. 使用直径1.4 mm的钻头钻孔，并用精密螺丝刀将4枚骨螺钉（1.5 mm）旋入孔中。注意钻孔时不要穿透颅骨。螺钉不应刺入脑组织，而应仅接触颅骨表面（图2C）。
10. 如有出血，用0.9% NaCl溶液冲洗，并等待其完全干燥。必要时可使用真空吸除液体。
11. 将连接至USB接头的导线在每枚螺钉上缠绕2–4圈，并剪除多余导线（图2D）。
12. 在每枚螺钉顶部滴加少量瞬干胶（Loctite），待其干燥以增强连接强度。确保接头位于颅骨中央，且不接触颅骨或任何电极（图2E）。
13. 使用氰基丙烯酸酯胶水逐层缓慢构建头帽，避免一次性涂抹过厚，以防产热损伤颅骨。在接头的平坦面上（不与颅骨或动物接触的部分）用牙科水泥固定一个较大的螺钉，以便于后续插入USB电缆（图2F）。
14. 待头帽至少干燥2分钟后，方可将小鼠从立体定位仪上取下。随后24小时内，在加热垫上持续观察小鼠状态。
15. 术后连续7天给予卡洛芬治疗，剂量为5 mg/kg，每12小时一次。等待2周后，待丙烯酸树脂与颅骨界面处骨组织充分生长，小鼠即可进行脑电图（EEG）记录。
    注意：尽量使接头贴近颅骨，但不得接触颅骨或骨螺钉；确保导线两端彼此绝缘，互不接触；操作时需防止氰基丙烯酸酯进入USB接口或小鼠眼睛。

3. 记录脑电图（65 分钟）

1. 每只小鼠记录1小时脑电图（EEG），其中戊四氮（Pentylenetetrazol, PTZ）处理前记录30分钟，PTZ处理后（20 mg/kg）继续记录30分钟。
2. 将USB线插入连接器，使用鳄鱼夹将USB线连接至差分交流（AC）放大器，增益设为10k，滤波范围为0.1 Hz至250 Hz²¹，以1000 Hz采样率采集脑电信号（图3）。
3. 将放大器输出信号同步记录在计算机上，并在示波器上实时显示以进行监测。将放大器输出端连接至连接在计算机上的数据采集与信号调理设备（例如NIDAQ）USB装置（图3）。
4. 使用Python代码记录脑电信号（代码地址： https://github.com/schrodi159/blakelabeeg）。该代码对信号进行0.1 Hz和250 Hz的数字滤波。
   注意：在无电磁干扰的环境中记录脑电图可提高数据质量。

4. 数据解读

1. 使用 Python 代码可视化数据（代码可在 https://github.com/schrodi159/blakelabeeg 获取）。从每次记录中识别出痫样放电（图 4A）。
   注意：若波形幅度达到基线的两倍且持续时间小于 200 ms²²，并满足以下 5 项标准中的至少 4 项，则视为痫样放电——具有尖锐峰的双相或三相波、与背景活动持续时间不同、波形不对称、背景活动因该波形出现而中断，以及紧随其后出现一个慢波^8,20,22。

结果

在20只C57Bl6J背景的小鼠中植入了电极，其中包括5只野生型C57Bl6J小鼠，术后存活率在手术后6个月内维持在85%（图4B）。6个月后，头帽开始脱落，所有小鼠在8月龄时被实施安乐死。头帽组件（包括连接器和螺丝）的平均重量为1.13 g（n = 20）。小鼠在术后30分钟内恢复意识，并在12小时内恢复正常的活动和注视行为。

在给予戊四氮（PTZ）20 mg/kg 前后进行脑电图（EEG）记录，以验证植入电极能否检测到化学诱导惊厥相关的电生理变化。数据分析时，统计每只小鼠的痫样放电次数。如图4C所示，该系统可稳定地记录C57BL/6J小鼠中由PTZ诱导的变化。在未接受PTZ处理的小鼠中，30分钟的EEG记录显示每只小鼠出现2–5次痫样放电；而给予PTZ处理后，痫样放电次数增加至20–51次（图4A），且放电幅度也明显升高，该结果来自3个不同电极的记录。如前所述，PTZ注射前后识别痫样放电的标准保持一致...

讨论

本研究建立并验证了一种稳健、经济高效且微创的方案，用于在自由活动的小鼠中进行长期、多部位脑电图（EEG）记录。成功植入螺钉电极以及定制的铂铱电极（焊接至USB连接器），结合观察到的高存活率和良好的记录质量，证明了该技术在长期记录中的可行性和可靠性。值得注意的是，该方案能够在无需复杂外科手术或昂贵硬件设备的条件下，实现精确的电生理数据采集，因而适用于多种实验室条件和实验设计。

关键创新在于将简易性、耐用性和成本效益相结合。与现有商业系统相比，该方法克服了后者常因成本高昂⁸或技术复杂^23,24而受到的限制，能够在保障动物福利和实验可重复性的同时，实现对多个皮层区域神经元电生理活动的实时监测。实验结果证实，该装置能够稳定地检测到痫样放电以及药物诱导的神经活动变化。在注射戊四氮（PTZ）后，观察到痫样放电的频率和幅度均显著增加，表明植入式电极对类似癫痫发作的电生理事件具有敏感性。这些发现验证了该系统在癫痫模型研究中的适用性，并...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.003" 铂铱合金丝	AM systems	777000
1.5 mm 骨螺钉	Antrin Miniature specialities		000-120X1/16 SL BIND MS SST
交流放大器	AM Systems
卡洛芬	Covetrus	11695-6935-1
Coldpac 义齿丙烯酸基板	Yates Motloid Company	https://www.yates-motloid.com/collections/coldpac/denture-base
1.4 mm 牙科钻头	Volvere GX	N/A
地塞米松	VEDCO	50989-437-12
眼用润滑膏	Optix Care	https://theoptixcare.com/
过氧化氢	Sigma Aldrich	7722-84-1
NIDAQ USB	国家仪器公司（National Instruments）	https://www.ni.com/en/shop/data-acquisition/entry-level-usb-daq.html	数据采集与信号调理 USB
戊四氮	Caymen Chemicals	18682
焊锡松香助焊膏	Weller	https://www.weller-tools.com/us/en/consumer/products/soldering-accessories/
0.32" 焊锡丝	Radio Shack	N/A
超级胶水	Loctite	N/A
USB Type-B 母头插头	QM Seller	X00292ABU9