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方法文章

以SMAD2/SMURF2为模型在哺乳动物细胞裂解液中检测泛素化的比较策略

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DOI：

10.3791/69321

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2026年4月17日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency Surgery, Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Department of Medical Genetics, School of Basic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

本文内容

摘要

泛素化是细胞内蛋白质功能的关键调控机制。本文介绍了两种用于检测哺乳动物细胞中底物蛋白泛素化水平的细胞裂解方法，并比较了它们在分析泛素化水平方面的有效性。通过瞬时转染在HEK293T细胞中诱导蛋白过表达，并通过蛋白质印迹分析检测泛素化蛋白。

摘要

泛素化是一种翻译后修饰，对细胞内蛋白质功能具有关键调控作用。泛素化通过促进蛋白酶体降解或通过泛素链依赖性信号通路改变蛋白质的亚细胞定位，从而调节蛋白质功能。本文描述了两种用于检测HEK293T细胞中SMAD2泛素化水平的细胞裂解方法，并比较了它们在分析蛋白质泛素化水平方面的有效性。通过瞬时转染在细胞中诱导蛋白质过表达。将质粒（HA-Ub、FLAG-SMAD2和MYC-SMURF2）与转染试剂分别加入基础培养基中，混合后添加至细胞中。在收获细胞前，加入MG132以抑制蛋白酶体降解，从而增强泛素化蛋白的积累。两种实验方法的主要区别在于细胞裂解方式：冰浴法（在4 °C下进行）和热处理法（在95 °C下孵育），这两种方法对蛋白质裂解效率有显著影响。完成细胞裂解后，将细胞裂解液、琼脂糖珠和FLAG抗体混合，并在4 °C下孵育过夜。随后通过蛋白质印迹分析检测泛素化蛋白。在检测泛素化蛋白前，使用轻链抗体进行二抗孵育，然后检测泛素化条带。结果表明，冰浴法和热处理法均可用于检测泛素化水平，而热处理法可能更有利于检测SMAD2的泛素化。本研究以SMURF2/SMAD2为模型，系统描述并比较了两种用于测定哺乳动物细胞中泛素化水平的细胞裂解方法，以帮助研究人员选择更合适的方法来检测底物蛋白的泛素化水平。

引言

泛素化是一种不可或缺的翻译后修饰，是细胞内蛋白质功能的关键调控机制1。介导真核生物中超过80%蛋白质降解的泛素-蛋白酶体系统（UPS）由泛素（Ub）、E1激活酶、E2结合酶、E3连接酶、去泛素化酶（DUBs）以及26S蛋白酶体组成2。该系统以高度特异性调控蛋白质的 turnover，从而控制细胞周期进程3、信号转导4,5和应激反应6,7等重要的细胞过程。泛素化是一个多步骤的酶促过程。E1利用ATP水解使泛素C末端腺苷酸化，形成Ub-AMP中间产物；随后，活化的泛素从E1转移至E2结合酶的活性位点半胱氨酸残基上，形成硫酯键；最后，E3连接酶同时招募E2-Ub复合物和靶蛋白，催化泛素从E2转移至底物蛋白的赖氨酸残基上8。

泛素可通过其七个赖氨酸残基（Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48、Lys63）或甲硫氨酸1（Met1，M1）4形成多种多聚泛素链。每种连接类型介导不同的生物学效应：K48连接的泛素链主要介导蛋白质的蛋白酶体降解9，K63连接的泛素链调控信号转导和DNA修复10,11，而M1连接的泛素链在先天免疫应答中起关键作用12。泛素化与去泛素化是重要的翻译后修饰过程，调控多种细胞活动，从蛋白质降解到信号转导均受其影响。例如，在结直肠癌中，MDM2介导的p53泛素化异常激活，导致p53过度降解，削弱其诱导细胞周期阻滞和凋亡的能力，从而促进肿瘤进展和化疗耐药13,14。在肝缺血-再灌注损伤中，OTUD1通过去除NRF2的K48连接多聚泛素化修饰来稳定NRF2，从而缓解细胞内氧化应激水平15,16。多种蛋白酶体抑制剂，如硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米，已逐步应用于多发性骨髓瘤等疾病的临床治疗17,18,19。

目前，检测泛素化蛋白的方法众多，包括蛋白质印迹法（western blotting）、基于放射性的检测法以及荧光检测法20。然而，在科学研究中，由于蛋白质印迹法具有相对快速且操作简便的实验流程，仍是检测蛋白泛素化的首选方法。传统检测泛素化蛋白的方法类似于共免疫沉淀（co-IP）技术：使用裂解缓冲液在低温下孵育并裂解细胞沉淀，以释放蛋白，随后利用抗体检测底物蛋白的泛素化状态21,22。然而，该实验方案通常需要大量细胞。此外，由于低温下相对温和的裂解方式无法完全破坏蛋白质之间的相互作用，从而增加了检测结果中出现假阳性的可能性。加热及SDS的使用可显著破坏蛋白质结构，诱导其完全变性，从而有效减少由蛋白质-蛋白质相互作用引起的假阳性结果23,24,25。同样，细胞在加热和SDS处理后可实现更充分的裂解，释放出更多的蛋白质，相应地减少了实验所需的细胞数量。综上所述，冰浴法与加热处理法均通过抗体孵育来裂解细胞并检测底物蛋白的泛素化水平；但加热法可实现更彻底的细胞裂解和更强的蛋白质变性效果。

TGF-β 在多种疾病的病理生理过程中发挥双重作用26,27。SMAD2 是 TGF-β 信号通路中关键的下游转录因子。SMURF2 介导的 SMAD2 泛素化可使其靶向蛋白酶体降解，从而精细调控 TGF-β 信号强度28。本研究以 SMURF2/SMAD2 为模型，系统描述并比较了两种用于检测哺乳动物细胞中泛素化水平的细胞裂解方法。实验中，通过瞬时转染 HA-Ub、FLAG-SMAD2 和 MYC-SMURF2 质粒，在 HEK293T 细胞中诱导蛋白过表达。随后分别采用冰浴法和加热处理法裂解细胞，并通过蛋白质印迹法检测泛素化蛋白。研究发现，冰浴法和加热处理法均可用于检测泛素化水平，而加热处理法可能更有利于 SMAD2 泛素化的检测。本实验方案为泛素化蛋白的检测提供了新的选择。此外，对于某些与泛素化紧密结合的底物蛋白，加热处理法具有更高的裂解效率，从而更易于实现泛素化的检测。

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方案

1. 裂解缓冲液与试剂的准备

注意：请按照所示浓度配制所有缓冲液。为避免浓度差异，请遵循试剂粉末生产商的说明书进行操作。

  1. 配制裂解缓冲液，其中含 20 mM Tris-HCl (pH 7.4)、50 mM NaCl、1 mM EDTA (pH 8.0) 和 1% Triton X-100。如需要，可将 NaCl 浓度调整至 50–150 mM。所有缓冲液均使用重蒸水（double-distilled H₂O）配制。
  2. 通过向裂解缓冲液中添加 1% 蛋白酶抑制剂混合物（不含 EDTA）来制备工作液。充分混匀后置于冰上，现用现取。
  3. 通过将 1 g SDS 粉末溶解于 10 mL PBS 中来制备 10% SDS 溶液。搅拌至完全溶解，室温保存。
  4. 制备 5× 蛋白上样缓冲液，其中含 250 mM Tris-HCl (pH 6.8)、10% SDS、50% 甘油、0.5% 溴酚蓝和 5% β-巯基乙醇。将各组分溶解于重蒸水（double-distilled H2O）中，使用前充分混匀。
    注意：操作 SDS 和 β-巯基乙醇时应在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备。受污染的材料应按照机构的化学废弃物处理指南进行处置。

2. 细胞的制备

  1. 在补充有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基中培养HEK293T细胞。于37 °C、5% CO₂条件下无菌孵育。当细胞融合度达到约90%时进行传代。
  2.  以每孔5 × 10⁵个细胞的密度将细胞接种至6孔板中。合并两个孔的细胞以制备一个样本。
  3. 配制转染混合物，总体积为细胞培养总体积的10%，并以SMAD2泛素化作为实验模型。在100 µL无血清DMEM中加入1 µg HA-Ub质粒、1 µg FLAG-SMAD2质粒以及0.5 µg空载体或MYC-SMURF2质粒。另取一管，将3.75 µL转染试剂溶于100 µL无血清DMEM中。将试剂混合物逐滴加入质粒溶液中，室温孵育15分钟，然后均匀滴加至细胞中。
  4. 转染6–8小时后，每孔更换为2 mL新鲜完全DMEM培养基。继续孵育细胞48小时。
  5. 收获细胞前，用5 µM MG132处理12小时。
    注意：操作MG132时应在生物安全柜内佩戴手套进行。受污染材料应按照机构安全规程处理。

3. 细胞收集

  1. 在细胞融合度达到90-100%时收集细胞（约3 × 10⁶个细胞）。吸除培养基，每孔加入1 mL预冷的PBS洗涤，彻底移除PBS。
  2. 每孔加入1 mL PBS，轻柔重悬细胞，将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中，置于冰上。
  3. 在4 °C下以380 × g离心5分钟，弃去上清液，保留沉淀。

4. 琼脂糖微珠制备

  1. 将每份样品的50 µL Protein A/G琼脂糖珠转移至新管中。用1 mL裂解缓冲液洗涤珠子3次。每次洗涤之间在4 °C下以100 × g离心1分钟。
  2. 去除残留缓冲液，注意不要扰动沉淀。加入100 µL工作溶液和5 µL抗FLAG抗体。在4 °C下轻轻旋转孵育6小时。

5. 细胞裂解

  1. 冰浴法
    1. 向沉淀中加入 500 µL 预冷的工作液。冰上孵育 30 分钟。
    2. 以 2 W 功率进行超声处理，采用 4 秒开启/4 秒关闭的循环模式，重复 5 次。超声过程中保持样品置于冰上。超声结束后将样品放回冰上继续孵育。
      ​注意：对于较弱的蛋白质相互作用，应将 NaCl 浓度降低至 50–75 mM，并省略超声步骤。
  2. 加热处理法
    1. 向沉淀中加入 45 µL 工作液。在持续混匀的同时加入 5 µL 10% SDS。
    2. 短暂涡旋振荡，然后在 95 °C 加热至悬浮液变为透明且完全液化。间歇性颠倒混合，以确保变性均匀。
    3. 加入 450 µL 工作液。保持样品在冰上，以 2 W 功率进行超声处理，采用 4 秒开启/4 秒关闭的循环模式，重复 5 次。
      注意：确保最终 SDS 浓度保持在 <0.1%。通过观察沉淀是否完全消失以及溶液是否均匀澄清，确认裂解完全。

6. 免疫沉淀与泛素化检测

  1. 在 4 °C 条件下，以 13,680 × g 离心裂解液 15 分钟。将上清液转移至新离心管中。
  2. 保留 60 µL 裂解液，加入 15 µL 5× 上样缓冲液。在 95 °C 加热 15 分钟，标记为输入样品（input）。
  3. 向剩余裂解液（终体积 540 µL）中加入 100 µL 抗体偶联磁珠。在 4 °C 旋转孵育 8–12 小时。
  4. 在 4 °C 以 100 × g 离心磁珠 1 分钟，弃上清液。用裂解缓冲液洗涤磁珠 3 次。加入 75 µL 1× SDS 上样缓冲液，在 95 °C 加热 15 分钟以洗脱蛋白，标记为免疫沉淀样品（IP）。
  5. 根据 JoVE 标准实验方案，通过蛋白质印迹法检测泛素化蛋白。
    注意：详细的转膜和检测步骤请参见蛋白质印迹实验方案29。完整未裁剪的印迹图像及分子量标记见补充文件 1。

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结果

在TGF-β信号通路中，SMAD2作为“分子信使”，在被TGF-β受体磷酸化后，与SMAD3和SMAD4形成复合物，转位至细胞核，并启动下游靶基因的转录30。因此，它是连接胞外信号与胞内基因表达的关键分子。SMAD2的降解由E3泛素连接酶SMURF2介导，后者催化靶蛋白的多聚泛素化，从而使其靶向蛋白酶体降解。SMURF2介导的SMAD2降解对于终止TGF-β信号、防止下游基因过度激活以及维持细胞稳态至关重要。SMURF2降解SMAD2的过程在多种疾病中发挥功能作用，例如在肺纤维化中31，SMURF2介导的SMAD2降解减少会导致SMAD2过度积累以及促纤维化基因的过表达32。在癌症中，增强的SMURF2介导的SMAD2降解会削弱其在癌症早期的抑瘤作用33。

在HEK293T细胞中，通过使用抗HA抗体检测与底物偶联的HA-Ub，观察到由MYC-SMURF2介导的FLAG-SMAD2特异性泛素化。...

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讨论

本研究介绍并比较了两种专门优化用于检测E3连接酶介导的底物泛素化的详细蛋白质裂解方案。为确保可检测性，我们在细胞中采用质粒介导的过表达（例如，带标签的SMAD2、SMURF2或Ub），以提供足够的蛋白水平来观察特异性的泛素化信号，这对于验证本研究中E3连接酶与底物之间的相互作用至关重要。在收集细胞前，加入强效的蛋白酶体抑制剂MG132，以阻断泛素化蛋白的蛋白酶体降解途径。该步骤可促进泛素-蛋白偶联物的积累，从而增强后续实验中泛素化信号的可检测性。MG132的工作浓度范围通常为5–50 µM，处理时间不应超过24小时。由于MG132是一种起效迅速但半衰期较短的蛋白酶体抑制剂，若需长期抑制蛋白酶体活性，则需考虑使用其他蛋白酶体抑制剂，或在实验过程中更换含新鲜MG132的培养基。通过在裂解缓冲液中添加20 mM N-乙基马来酰亚胺，可抑制去泛素化作用。

在裂解缓冲液的配制过程中，应根据实验需求调整 NaCl 浓度，以优化目标蛋白复合物的溶解性，同时尽量减少非特异性蛋白相互作用。这一调整至关重要，因为高盐浓度可能破坏较弱的蛋白质-蛋白质相互作用，而低盐浓度则可能导致非特异性聚集体产生过高的...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（项目编号：82370647（W.H.）、82170642（J-X.Z）、81801923（X-F.Z）、81670575（J-X.Z）、81570570（W.H.）和81070355（J-X.Z））、华中科技大学学术前沿青年团队计划（2018QYTD02）以及湖北省再生医学与多学科转化研究重点实验室开放基金（2022zsyx003）和中国国家重点研发计划（2024YFA1107601）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管ServicebioEP-150-M
100 mm 经组织培养处理的培养皿ServicebioCCD-100
6 孔板ServicebioCCP-6H
抗 FLAG 抗体Proteintech20543-1-AP免疫沉淀使用稀释比例为 1:200，Western blot 使用稀释比例为 1:10000
抗 GAPDH 抗体ProteintechMA5-15738使用稀释比例为 1:10000
抗 HA 抗体Proteintech51064-2-AP使用稀释比例为 1:10000
抗 IgG 抗体CST#3900免疫沉淀使用稀释比例为 1:200
抗 MYC 抗体Proteintech60003-2-Ig使用稀释比例为 1:10000
抗 SMAD2 抗体CST#5339免疫沉淀使用稀释比例为 1:200，Western blot 使用稀释比例为 1:2000
溴酚蓝ServicebioGC307006-5g
EDTA (pH=8.0)ServicebioG1207-1L
FBSABW
甘油国药集团10010618
加热/冷却干浴器国诚
HEK293T 细胞ATCCCRL-3216
高糖 DMEMServicebioG4515-500ML
HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 轻链 AbclonalAS062使用稀释比例为 1:5000
HRP 标记的小鼠抗兔 IgG 轻链 AbclonalAS061使用稀释比例为 1:10000
Lipo8000碧云天C0533
MG132阿拉丁M421264
微量离心机LabgicCF1524R
NaCl 粉末ServicebioGC102004
PBS ServicebioG4202-500ML
pCMV-FLAG-SMAD2用于哺乳动物表达
pCMV-HA-Ub用于哺乳动物表达
pCMV-MYC用于哺乳动物表达
pCMV-MYC-SMURF2用于哺乳动物表达
青霉素-链霉素ServicebioG4003-100ML
不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物TargetMolC0001
Protein A/G 琼脂糖珠碧云天P2017
PVDF 膜VayzmeE801
SDS 粉末SolarbioS8010-500g
SDS-PAGE 系统AervicebioBVE4-BVT4
超声破碎仪Uibra cell
Tris-HCl 粉末BiotoppedHST-0372
Triton X-100ServicebioGC204003-100ml
胰蛋白酶ServicebioG4021-100ML
涡旋混合器由 Vayzme 慷慨捐赠
β-巯基乙醇阿拉丁M301573

参考文献

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