以SMAD2/SMURF2为模型在哺乳动物细胞裂解液中检测泛素化的比较策略

摘要

泛素化是细胞内蛋白质功能的关键调控机制。本文介绍了两种用于检测哺乳动物细胞中底物蛋白泛素化水平的细胞裂解方法，并比较了它们在分析泛素化水平方面的有效性。通过瞬时转染在HEK293T细胞中诱导蛋白过表达，并通过蛋白质印迹分析检测泛素化蛋白。

摘要

泛素化是一种翻译后修饰，对细胞内蛋白质功能具有关键调控作用。泛素化通过促进蛋白酶体降解或通过泛素链依赖性信号通路改变蛋白质的亚细胞定位，从而调节蛋白质功能。本文描述了两种用于检测HEK293T细胞中SMAD2泛素化水平的细胞裂解方法，并比较了它们在分析蛋白质泛素化水平方面的有效性。通过瞬时转染在细胞中诱导蛋白质过表达。将质粒（HA-Ub、FLAG-SMAD2和MYC-SMURF2）与转染试剂分别加入基础培养基中，混合后添加至细胞中。在收获细胞前，加入MG132以抑制蛋白酶体降解，从而增强泛素化蛋白的积累。两种实验方法的主要区别在于细胞裂解方式：冰浴法（在4 °C下进行）和热处理法（在95 °C下孵育），这两种方法对蛋白质裂解效率有显著影响。完成细胞裂解后，将细胞裂解液、琼脂糖珠和FLAG抗体混合，并在4 °C下孵育过夜。随后通过蛋白质印迹分析检测泛素化蛋白。在检测泛素化蛋白前，使用轻链抗体进行二抗孵育，然后检测泛素化条带。结果表明，冰浴法和热处理法均可用于检测泛素化水平，而热处理法可能更有利于检测SMAD2的泛素化。本研究以SMURF2/SMAD2为模型，系统描述并比较了两种用于测定哺乳动物细胞中泛素化水平的细胞裂解方法，以帮助研究人员选择更合适的方法来检测底物蛋白的泛素化水平。

引言

泛素化是一种不可或缺的翻译后修饰，是细胞内蛋白质功能的关键调控机制¹。介导真核生物中超过80%蛋白质降解的泛素-蛋白酶体系统（UPS）由泛素（Ub）、E1激活酶、E2结合酶、E3连接酶、去泛素化酶（DUBs）以及26S蛋白酶体组成²。该系统以高度特异性调控蛋白质的 turnover，从而控制细胞周期进程³、信号转导^4,5和应激反应^6,7等重要的细胞过程。泛素化是一个多步骤的酶促过程。E1利用ATP水解使泛素C末端腺苷酸化，形成Ub-AMP中间产物；随后，活化的泛素从E1转移至E2结合酶的活性位点半胱氨酸残基上，形成硫酯键；最后，E3连接酶同时招募E2-Ub复合物和靶蛋白，催化泛素从E2转移至底物蛋白的赖氨酸残基上⁸。

泛素可通过其七个赖氨酸残基（Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48、Lys63）或甲硫氨酸1（Met1，M1）⁴形成多种多聚泛素链。每种连接类型介导不同的生物学效应....

方案

1. 裂解缓冲液与试剂的准备

注意：请按照所示浓度配制所有缓冲液。为避免浓度差异，请遵循试剂粉末生产商的说明书进行操作。

1. 配制裂解缓冲液，其中含 20 mM Tris-HCl (pH 7.4)、50 mM NaCl、1 mM EDTA (pH 8.0) 和 1% Triton X-100。如需要，可将 NaCl 浓度调整至 50–150 mM。所有缓冲液均使用重蒸水（double-distilled H₂O）配制。
2. 通过向裂解缓冲液中添加 1% 蛋白酶抑制剂混合物（不含 EDTA）来制备工作液。充分混匀后置于冰上，现用现取。
3. 通过将 1 g SDS 粉末溶解于 10 mL PBS 中来制备 10% SDS 溶液。搅拌至完全溶解，室温保存。
4. 制备 5× 蛋白上样缓冲液，其中含 250 mM Tris-HCl (pH 6.8)、10% SDS、50% 甘油、0.5% 溴酚蓝和 5% β-巯基乙醇。将各组分溶解于重蒸水（double-distilled H₂O）中，使用前充分混匀。
   注意：操作 SDS 和 β-巯基乙醇时应在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备。受污染的材料应按照机构的化学废弃物处理指南进行处置。

2. 细胞的制备....

结果

在TGF-β信号通路中，SMAD2作为“分子信使”，在被TGF-β受体磷酸化后，与SMAD3和SMAD4形成复合物，转位至细胞核，并启动下游靶基因的转录³⁰。因此，它是连接胞外信号与胞内基因表达的关键分子。SMAD2的降解由E3泛素连接酶SMURF2介导，后者催化靶蛋白的多聚泛素化，从而使其靶向蛋白酶体降解。SMURF2介导的SMAD2降解对于终止TGF-β信号、防止下游基因过度激活以及维持细胞稳态至关重要。SMURF2降解SMAD2的过程在多种疾病中发挥功能作用，例如在肺纤维化中³¹，SMURF2介导的SMAD2降解减少会导致SMAD2过度积累以及促纤维化基因的过表达³²。在癌症中，增强的SMURF2介导的SMAD2降解会削弱其在癌症早期的抑瘤作用³³。

在HEK293T细胞中，通过使用抗HA抗体检测与底物偶联的HA-Ub，观察到由MYC-SMURF2介导的FLAG-SMAD2特异性泛素化。.......

讨论

本研究介绍并比较了两种专门优化用于检测E3连接酶介导的底物泛素化的详细蛋白质裂解方案。为确保可检测性，我们在细胞中采用质粒介导的过表达（例如，带标签的SMAD2、SMURF2或Ub），以提供足够的蛋白水平来观察特异性的泛素化信号，这对于验证本研究中E3连接酶与底物之间的相互作用至关重要。在收集细胞前，加入强效的蛋白酶体抑制剂MG132，以阻断泛素化蛋白的蛋白酶体降解途径。该步骤可促进泛素-蛋白偶联物的积累，从而增强后续实验中泛素化信号的可检测性。MG132的工作浓度范围通常为5–50 µM，处理时间不应超过24小时。由于MG132是一种起效迅速但半衰期较短的蛋白酶体抑制剂，若需长期抑制蛋白酶体活性，则需考虑使用其他蛋白酶体抑制剂，或在实验过程中更换含新鲜MG132的培养基。通过在裂解缓冲液中添加20 mM N-乙基马来酰亚胺，可抑制去泛素化作用。

在裂解缓冲液的配制过程中，应根据实验需求调整 NaCl 浓度，以优化目标蛋白复合物的溶解性，同时尽量减少非特异性蛋白相互作用。这一调整至关重要，因为高盐浓度可能破坏较弱的蛋白质-蛋白质相互作用，而低盐浓度则可能导致非特异性聚集体产生过高的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Servicebio	EP-150-M
100 mm 经组织培养处理的培养皿	Servicebio	CCD-100
6 孔板	Servicebio	CCP-6H
抗 FLAG 抗体	Proteintech	20543-1-AP	免疫沉淀使用稀释比例为 1:200，Western blot 使用稀释比例为 1:10000
抗 GAPDH 抗体	Proteintech	MA5-15738	使用稀释比例为 1:10000
抗 HA 抗体	Proteintech	51064-2-AP	使用稀释比例为 1:10000
抗 IgG 抗体	CST	#3900	免疫沉淀使用稀释比例为 1:200
抗 MYC 抗体	Proteintech	60003-2-Ig	使用稀释比例为 1:10000
抗 SMAD2 抗体	CST	#5339	免疫沉淀使用稀释比例为 1:200，Western blot 使用稀释比例为 1:2000
溴酚蓝	Servicebio	GC307006-5g
EDTA (pH=8.0)	Servicebio	G1207-1L
FBS	ABW
甘油	国药集团	10010618
加热/冷却干浴器	国诚
HEK293T 细胞	ATCC	CRL-3216
高糖 DMEM	Servicebio	G4515-500ML
HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 轻链	Abclonal	AS062	使用稀释比例为 1:5000
HRP 标记的小鼠抗兔 IgG 轻链	Abclonal	AS061	使用稀释比例为 1:10000
Lipo8000	碧云天	C0533
MG132	阿拉丁	M421264
微量离心机	Labgic	CF1524R
NaCl 粉末	Servicebio	GC102004
PBS	Servicebio	G4202-500ML
pCMV-FLAG-SMAD2			用于哺乳动物表达
pCMV-HA-Ub			用于哺乳动物表达
pCMV-MYC			用于哺乳动物表达
pCMV-MYC-SMURF2			用于哺乳动物表达
青霉素-链霉素	Servicebio	G4003-100ML
不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物	TargetMol	C0001
Protein A/G 琼脂糖珠	碧云天	P2017
PVDF 膜	Vayzme	E801
SDS 粉末	Solarbio	S8010-500g
SDS-PAGE 系统	Aervicebio	BVE4-BVT4
超声破碎仪	Uibra cell
Tris-HCl 粉末	Biotopped	HST-0372
Triton X-100	Servicebio	GC204003-100ml
胰蛋白酶	Servicebio	G4021-100ML
涡旋混合器	由 Vayzme 慷慨捐赠
β-巯基乙醇	阿拉丁	M301573