小鼠胚胎干细胞中增强子RNA稳定性的优化定量评估

摘要

本方案通过放线菌素D处理、逆转录定量PCR及非线性回归分析，定量测定小鼠胚胎干细胞中基因间和基因内增强子RNA的稳定性和半衰期。采用位置特异性标准化策略，以准确建模依赖于上下文的增强子RNA降解动力学。

摘要

增强子RNA（eRNAs）是由转录活跃的增强子区域产生的非编码转录本，现已被越来越多地认为是基因表达的关键调控因子。尽管其功能重要，eRNA的稳定性及其降解动态仍缺乏充分表征，尤其是在胚胎干细胞（ESCs）中，其转录程序具有高度动态性和环境依赖性。本实验方案提供了一种定量方法，用于评估小鼠ESCs中间基因区和基因内eRNA的衰变动力学及半衰期。通过使用放线菌素D抑制转录，并在多个预设时间点收集总RNA。使用随机六聚体引物和寡聚(dT)引物合成cDNA，以检测聚腺苷酸化和非聚腺苷酸化转录本。对于间基因区eRNA，归一化可采用看家基因或0分钟时的Ct值进行；对于基因内eRNA，则采用双重归一化策略，以最大限度减少重叠前体mRNA的干扰。衰变曲线采用单相指数衰变模型进行分析，从而准确估算半衰期。该方案显示，小鼠ESCs中的eRNA turnover迅速，半衰期约为2-3分钟。该方法为研究eRNA稳定性提供了可靠且可重复的框架，有助于深入理解多能干细胞背景下增强子活性及RNA动态变化。

引言

增强子是一类cis-调控元件（CREs），通过作为转录因子和共调控因子的结合平台，调控组织特异性和刺激特异性的基因表达^1,2,3,4,5,6。尽管在基因组线性结构上增强子可能位于其靶基因较远的位置，但染色质成环机制使其在空间上与启动子接近，从而促进转录调控。活性增强子可被RNA聚合酶II（Pol II）双向转录，产生一类称为增强子RNA（eRNAs）的长链非编码RNA，其通常中位长度约为1 kb^1,2,7,8,9。eRNAs的表达水平与其邻近靶基因的激活状态高度相关^10,11....

方案

本研究中的所有实验均使用小鼠胚胎干细胞（mESC；E14Tg2A）进行，这些细胞并非由本实验室直接构建，而是来源于已建立的细胞系，该细胞系亦可从ATCC（CRL-1821）商业获取。因此，本文所述工作无需经由忠南国立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）审查。材料表中列出了所用的试剂和设备。

1. 小鼠胚胎干细胞的细胞培养

1. 用0.1%明胶预包被6孔细胞培养板（每孔2 mL），在37 °C孵育10分钟。
2. 吸除明胶溶液，每孔用1 mL PBS洗涤一次。通过紫外照射至少15分钟对培养板进行灭菌。
3. 使用2 mL完全细胞培养基将mESC接种至明胶包被的培养板中（表1）。
   注意：根据实验所需的培养基总体积，在使用前立即加入所需浓度的新鲜LIF。

组分	终浓度	使用体积
Glasgow’s Minim....

结果

为评估转录抑制后的RNA稳定性，对mESCs使用放线菌素D（actD）处理，并在指定时间点（0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟和30分钟）收集总RNA。经cDNA合成后，采用RT-qPCR定量检测Nsun2和Sox2基因内的eRNA、Pou5f1基因间的eRNA及其相应的mRNA。这些数据用于生成时间依赖性降解曲线（图2）。在成功的实验中，mESCs中的eRNA通常在actD处理5分钟内即表现出表达量的迅速下降，而mRNA则相对更稳定，其下降程度较小，并在30分钟以上时间内维持相对稳定的水平。

讨论

本方案概述了一种在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中测量增强子RNA（eRNA）稳定性的可靠且可重复的方法。关键实验步骤，包括细胞培养、放线菌素D处理、RNA提取和RT-qPCR定量，在图示及补充文件中均有清晰展示。 以指导用户完成工作流程。此外，还提供了详细的分析步骤，例如非线性回归建模以及置信区间解释 补充文件 4 以支持准确的半衰期估算。在这些步骤中，放线菌素D（actD）处理的精确计时和一致操作至关重要，因为它们直接影响不稳定转录本（如eRNAs）的检测。样品采集过程中的延迟或操作不一致会显著扭曲降解动力学，并降低实验结果的可重复性。因此，严格遵循规定的计时策略对于获得有意义且可解释的数据至关重要。

尽管本方案已针对半衰期小于30分钟的短寿命eRNA分析进行了优化，但通过延长取样时间线或在内参基因的基础上加入外源性 spike-in RNA 以提高归一化的准确性，也可适用于更稳定的增强子转录本的分析^38,39。此外，虽.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Gibco	21985023
放线菌素D	Sigma-Aldrich	A9415
氯仿	Daejung chemicals	2548-4105
DMSO	GenDEPOT	D2680
胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich	F0392
明胶	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Glasgow’s Minimum Essential Medium (GMEM)	Gibco	11710035
GraphPad Prism（版本9）	GraphPad Software
异丙醇	Daejung chemicals	5035-4105
KnockOut血清替代物（KOSR）	Gibco,	10828028
白血病抑制因子（LIF）	Merck	ESG1106
MEM非必需氨基酸溶液（MnEA）	Welgene	LS005
M-MLV cDNA合成试剂盒	Enzynomics	EZ006S
OPTIZEN NanoQ Plus	KLAB	01-QI685-M-16-C
青霉素-链霉素	Welgene	LS202-02
Power SYBR-Green PCR主混合液	Applied Biosystems	4368708
QuanStudio1实时PCR系统	Applied Biosystems	A40425
丙酮酸钠	Welgene	LS013
TRIzol	Invitrogen	15596018