优化的增强子RNA在小鼠胚胎干细胞中稳定性的定量评估

Summary

该方案通过放线霉素D处理、RT-qPCR和非线性回归分析，定量测量小鼠胚胎干细胞中基因间和基因内增强子RNA的稳定性和半衰期。采用位置特异性归一化策略，以上下文依赖性准确建模eRNA衰变动态。

Abstract

增强子RNA（eRNA）是由转录活性增强子区域产生的非编码转录本，且越来越被认可为基因表达的关键调控因子。尽管具有功能重要性，但eRNA的稳定性和降解动态仍被充分表征，尤其是在胚胎干细胞（ESC）中，转录程序高度动态且依赖环境。本方案采用定量方法评估小鼠胚胎胚胎细胞中基因间和基因内eRNA的衰变动力学和半衰期。利用放线霉素D抑制转录，并在多个确定时间点采集总RNA。cDNA通过随机六聚体和寡核（dT）引物合成，以检测聚腺苷酸和非聚腺苷酸转录本。对于基因间eRNA，归一化使用家务基因或0分钟时的Ct值进行。对于基因内eRNA，采用双重归一化方法以最大限度减少重叠的前mRNA干扰。衰变曲线采用单相指数衰减模型进行分析，从而实现半衰期的准确估计。该方案显示，mESC中的eRNA具有快速的周转，半衰期约为2-3分钟。该方法为研究eRNA稳定性提供了一个稳健且可重复的框架，揭示了增强子活性和RNA动态在多能干细胞环境中的表现。

Introduction

增强子是顺式调控元件（CRE），通过作为转录因子和共调控因子^{1、2、3、4、5、6}的结合平台，调控组织和刺激特异性的基因表达。虽然增强子可以在线性基因组层面远离目标基因，但染色质环机制使得与启动子的空间接近成为可能，促进转录调控。活性增强子通过RNA聚合酶II（Pol II）双向转录，产生称为增强子RNA（eRNA）的长非编码RNA，其中位长度通常约为1 kb 1,2,7,8,9。eRNA的表达与附近靶基因的激活高度^{相关，功能}性研究一再表明eRNA的耗竭会减少其目标基因的转录，表明eRNA作为功能调节者而非转录副产物发挥作用 13,14,15,16,17.尽管具有功能重要性，但可靠的检测和定量eRNA的实验方案仍然有限。

在干细胞中，增强子活性在维持多能性和推动发育转变方面起着关键作用^18,19。增强子可以存在于基因间区域（基因间或外基因增强子），也可以嵌入基因体中，作为基因内增强^子8。尽管基因间增强子在多种细胞类型中已被广泛研究，但由于与宿主基因前mRNA的转录重叠以及与转录延长相关的组蛋白修饰存在等技术挑战，基因内增强子仍相对未被充分探索^20,21。然而，最新研究表明，基因间和基因内增强子都参与参与ESC多能性^22,23和早期分化²⁴的基因调控网络。值得注意的是，近一半的注释增强子为基因内增强子^20,25，其活性在发育阶段变化，通常在分^{化组织8,26,27,28}中增加。然而，基因内增强子在ESC中的普遍性和功能作用仍未完全明了。特别地，基因间eRNA是在基因间转录的，而基因内eRNA是在基因体内转录的，并且可能与前mRNA转录本重叠。这种位置差异要求在解释和定量基因间和基因内eRNA时采用不同的分析方法。

与mRNA不同，eRNA通常没有3′多（A）尾，导致稳定性低^且降解迅速，1,2,7,8,9。这种内在不稳定性使得分析eRNA表达变得困难，尤其是在时间周期实验中。在神经元中，eRNA的半衰期被报道短至7.5分¹⁷秒。然而，目前尚不清楚这种不稳定性是否在不同细胞类型间一致，尤其是在ESC中，增强子活性和eRNA转录高度依赖细胞类型，7,17,29,30。ESC依赖动态基因调控程序维持多能性或启动分化，使其成为检测eRNA周转的独特系统（^31,32）。鉴于ESC的快速转录转变，理解eRNA在这一背景下的衰变可能揭示增强子活性如何被时间调控¹⁷。此外，基因间和基因内eRNA之间的差异，如与宿主基因转录本的重叠，需要不同的分析方法²⁰。尽管这些问题重要，但目前很少有标准化方法用于测量ESC中的eRNA半衰期或比较不同eRNA类型衰变动力学。

本研究提出了定量方案，用于评估mESC中从基因间和基因内增强子转录的eRNA的稳定性和半衰期。通过在特定时间间隔使用放线霉素D（ActD）实现转录抑制，随后进行实时定量PCR（RT-qPCR）和非线性回归分析以定量eRNA衰变。为解决基因间和基因内增强子的位置差异，该方法采用了不同的规范化策略，实现了eRNA降解动力学的系统且准确的比较。这一结构化分析框架为多能干细胞中eRNA更替提供了宝贵见解。

Protocol

本研究的所有实验均使用小鼠胚胎干细胞（mESC;E14Tg2A）并非直接在我们实验室合成，而是从已建立的细胞系中获得，该细胞系也可通过ATCC（CRL-1821）商业获得。因此，本文所述的工作无需忠南国立大学的机构动物护理与使用委员会（IACUC）审查。试剂和所用设备列于 材料表中。

1. mESCs的细胞培养

1. 在6孔细胞培养板上预涂0.1%明胶（每孔2毫升）。将平板在37°C下孵育10分钟。
2. 吸入明胶后，用1毫升PBS清洗每个井一次。用紫外线照射对板材进行至少15分钟的消毒。
3. 使用完整的2毫升细胞培养基将mESC种子撒到明胶涂层板上（见表1）。
   注意：在使用前，根据实验所需的总培养液体积，立即以所需浓度新鲜添加LIF到培养基中。

组件	最终专攻	使用量
格拉斯哥最低必需介质（GMEM）	-	500毫升
击倒™血清替代（KOSR）	10%	50毫升
青霉素-链霉素	0.50%	2.5毫升
胎儿牛血清（FBS）	1%	5毫升
丙酮酸钠	0.1 mM / 1%	5毫升
MEM非必需氨基酸溶液（MnEA）	0.1 mM/1%	5毫升
2-巯基乙醇	0.1 毫米	910 uL
白血病抑制因子（LIF）	1000 U/mL	-

表1：mESC培养基的组成。 用于制备mESC培养基的组分及其最终浓度。典型体积以总培养基500毫升为单位列出。

4. 在37°C的加湿培养箱中保持细胞，使用5%_CO2（见图1A）。

图1：eRNA稳定性分析的实验设计。 （A）转录停止实验示意图。细胞在0.1%明胶涂层的6孔板上进行板化，并在采集后指定时间点（0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟和30分钟）用actD（最终浓度：5 μg/mL）处理。（B） RT-qPCR检测布局。总RNA采用随机六聚体或寡核（dT）引物逆转录。每个时间点的cDNA样本均使用RT-qPCR分析了指示靶点： Tbp_mRNA、基因间eRNA和基因内eRNA。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 放线霉素D（ActD）治疗

1. 将actD溶解于DMSO中，制备1 mg/mL浓度的存液³³。
   注意：虽然放线霉素D用于短期转录抑制，但未来研究中也可能使用曲替内胺等替代抑制剂阻断转录起始。由于放线霉素D和DMSO都对光敏感，将存制溶液装入琥珀微管中，保护其免受光照影响，并在-20°C下保存至使用。
2. 细胞播种后两天（或采集当天），将actD存活液加入培养基，最终浓度为5 μg/mL³³。处理后0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟和30分钟采集样本（图1A）。
   注意：虽然大多数eRNA在0-30分钟内表现出快速衰变，但有些eRNA可能表现出更长的半衰期。根据目标位点的特性，可能会在较长时间点（如1小时、3小时或6小时）进行额外采样，以更准确地捕捉衰变动力学。本研究中，放线霉素D以5 μg/mL浓度进行短期（≤30分钟）转录阻断;但对于较长的孵育期（>1小时），建议将浓度降至1-2 μg/mL，以减少细胞应激反应。由于DMSO本身会影响转录活性，因此应包含仅DMSO的对照。

3. RNA提取与cDNA合成

1. 通过吸取取出细胞培养基，并在每个孔中加入1毫升TRIzol试剂。将洗涤板在室温（RT）^34,35下在摇床上孵育10分钟，然后将裂解液转移到新的1.5毫升管中。
   注意：TRIzol处理后，样本可在-80°C下保存，最多一周后再提取RNA。由于TRIzol试剂含有酚和二硫氰铀，这些都极具毒性和腐蚀性，因此必须非常小心地处理。所有TRIzol废弃物应收集在指定的有机溶剂废弃物容器中，以便妥善处置。
2. 每个样品加入500微升氯仿。用力摇晃管子，并在RT下孵育3分钟。
3. 在13,500× 克 下，4°C离心10分钟。
4. 小心地将水相转移到一个新的1.5毫升管子中，内含等量异丙醇。将混合物在RT下孵育10分钟，以增强RNA沉淀。
   注意：仅需谨慎转移透明的上层水相，以避免与中间相污染。为提高RNA产率，添加异丙醇后，在-20°C下培养样品1小时至过夜（O/N）。对于低输入样品，在添加异丙醇前添加糖原（最终10-20 μg/mL）或GlycoBlue，以提高RNA沉淀的可见性和回收效率。异丙醇高度易燃，可能对人体健康有害;吸入蒸汽或接触皮肤或眼睛可能会引起刺激、头痛、头晕或中枢神经系统抑制。请谨慎处理，并将所有剩余溶液收集到经过批准的有机溶剂废弃物容器中妥善处理。
5. 再次以13,500× g 离心，4°C离心10分钟，然后丢弃上清液。
6. 用1毫升75%乙醇清洗所得的RNA沉淀。离心机在6800× 克 下，4°C离心5分钟。
   注意：加入乙醇后轻轻倒置管子以抬起颗粒。
7. 小心去除上清液，并在42°C下将沉睡颗粒晾干10分钟。 将干燥沉淀重新悬浮在无RNase水中，并在55°C下培养10分钟。
   注意：当RNA纯度较高时，白色沉淀在风干过程中可能会变得半透明。避免颗粒过度干燥超过10分钟，因为过度干燥会降低续吸效率。
8. 使用纳米滴光度计测量RNA浓度和纯度。
9. 按照制造商说明，使用M-MLV cDNA合成套件从RNA的μg合成cDNA（见表2）。

组件	使用量
10X M-MLV RT缓冲区	2 uL
dNTP	2 uL
引发剂（随机 / Olido dT）	1uL
M-MLV RT	1uL
RN酶抑制剂	0.5 uL
RNA样本	2微克（根据RNA样品浓度调整体积）
DW	根据RNA样本浓度调整体积（以构成最终体积）
总量	20 uL

表2：cDNA合成反应（M-MLV逆转录酶）的组成。 详细的体积和试剂，用于利用M-MLV cDNA合成套件逆转录2 μg总RNA。根据RNA样本的浓度调整体积，并加入无核酸酶DW，使最终反应体积达到20微升。

10. 将cDNA反应在37°C下孵育2小时，然后在85°C下加热灭活酶5分钟。
    注意：合成的cDNA应储存在-20°C。 典型的cDNA浓度约为100 ng/μL。为了检测基因内eRNA，使用随机六聚体引物和寡核苷酸引物，从同一RNA样本合成cDNA。

4. 实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）

1. 准备一个10微升的反应混合物，包含15 ng的cDNA、5微升的Power SYBR Green PCR主混合液、每种引物5 pmol，以及蒸馏水（DW）。
   注意：eRNA基因座通常包含或邻接重复序列，因此需要精心设计引物。使用重复掩蔽序列限制候选区域，并利用BLAST验证引子对在基因组中的特异性。如有可能，包含附近的控制区以排除非特异性扩增³⁶.
2. 使用实时PCR系统进行放大，热循环条件如下：初始活化和变性步骤为50°C，2分钟，95°C为10分钟，随后在95°C进行40个变性循环，持续15秒，然后在60°C进行退火、伸展和荧光测量，持续1分^34秒。37 （表3）。

阶段	步	温度（°C）	时间	周期
暂停舞台	反转录	50	2分钟	1
	初始变性	95	10分钟	1
PCR阶段	变性	95	15秒	40
	退火/延展	60	1分钟	40
熔融曲线阶段	变性	95	15秒	1
	退火	60	1分钟	1
	解离（熔融曲线）	95	15秒	1

表3：RT-qPCR的热循环条件。 逆转录的温度、时间和循环条件总结，40周期qPCR（10微升反应）及标准熔融曲线分析。

3. 对于基因内eRNA定量，使用用少核（dT）引物合成的cDNA，分析 Tbp （或其他管理/对照基因）和基因内增强子区域。对于基因间eRNA，仅使用随机六聚体引子合成的cDNA（见表4 和 图1B）。
   注意：每个样本应分技术重复运行（两口井），以便数据分析时进行平均。

基因名称	引火探针	序列（5'-3'）	扩增子尺寸
简而言之	向前	TGACTCCTGGAATTCCCATC	122年前
	反向	TTGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTT
Nsun2_mRNA	向前	GGATGAAGCAGTGATCGCAG	93年前
	反向	特卡特卡特卡特卡卡
Pou5f1_mRNA	向前	TCCCTACAGCAGATCACTCAC	80 BP
	反向	CGCCGGT塔卡加卡塔克
Sox2_mRNA	向前	阿卡加特加特加克	105年前
	反向	TGGAGTTGTACTGCAGGGCG
Nsun2_eRNA	向前	CCTGAGGTGTGTGTGTGTGT	110年前
	反向	AGGTTAACACACATCACCCCCA
Pou5f1_eRNA	向前	猫咪咪咪	107年前
	反向	卡加卡特格
Sox2_eRNA	向前	AGTCAGCTACATGGGCAGAG	119 年前
	反向	CCCCTCTTCTCACCGTACAG
Nsun2_negative控制	向前	CCCCGTGTTTAAGAGGAATGA	88 年前
	反向	ACTGAGAACACACCCACTAGCA

表4：用于RT-qPCR分析的引物序列。 用于RT-qPCR实验中每个目标基因特异扩增的正向和反向引子序列。这些引物经过优化，以确保mRNA和eRNA表达的准确定量。

5. eRNA稳定性数据分析 ²²

1. 使用ΔCt方法分析所有数据，并将相对eRNA水平归一化为 Tbp_mRNA（补充文件1 和 图2A）。
   注意：如果两次技术重复的Cot值差异超过0.5，则排除该数据进行进一步分析。通过用ΔCt方法从目标基因的Ct值（如 Tbp_mRNA）减去相对基因表达水平（ΔCt = Control_Ct - Target_Ct）。相对表达式随后可计算为2^-ΔCt（补充文件2B）。
2. 对于基因内eRNA定量，通过将用随机六聚体合成的cDNA值与用寡核苷酸（dT）引物合成的cDNA的值相除，来规范表达值。
   注意：所有qPCR反应均使用三个独立的生物复制（n=3个）。
3. 将每个时间点的表达水平（ 通过ΔCt方法获得）归一化为0最小值，并绘制衰减曲线。
   注意：尽管该方案采用短时间放线霉素D处理，长期暴露于转录抑制剂（如ActD）也可能降低基因表达。为了实现更高精度的定量，我们建议在细胞裂解步骤添加外源性突增RNA（如ERCC），以校正RNA提取效率、逆转录效率和移液精度的差异，从而实现样本间更一致的规范化^38,39。
4. 绘制eRNA水平随时间归一化，并使用GraphPad Prism（补充文件3）中的非线性回归模型（单相指数衰变）拟合。
5. 从单个生物复制品估算eRNA半衰期。
   1. 打开GraphPad Prism，选择 创建>XY （选项：X = 数字;Y = 为每个点输入并绘制一个 Y 值）。
   2. 输入时间点（0、5、10、15、20和30分钟）作为X轴值。
   3. 在Y轴（组）上列出样本名称，并为每个时间点输入对应的单一数据值。
   4. 选择分析>回归与曲线>非线性回归（曲线拟合）。
   5. 在 指数标签 中，选择 单相衰变 模型。
   6. 在“ 结果表 ”中，使用Excel或类似软件计算每个样品半衰期的平均和标准差。绘制出得到的数值。
6. 95%置信区间的拟合衰减曲线
   1. 打开GraphPad Prism，选择 创建>XY （选项：X = 数字;Y = 在并排子列中输入3个复制值）。
   2. 输入时间点（0、5、10、15、20和30分钟）作为X轴值。
   3. 在Y轴（基团）上列出样本名称，并将每个eRNA样本的三个复制值输入相应的数据表。
   4. 选择分析>回归与曲线>非线性回归（曲线拟合）。
   5. 在 指数标签 中，选择 单相衰变 模型进行分析。
   6. 在 结果表中，提取从三份样本分析中获得的95%置信区间（CI）值。
      注意：使用以下衰变方程：Y = （Y₀ - Plaau） • ^e-kt + Plateau，其中Y为时间t时的相对eRNA水平，Y₀为初始eRNA水平，k为衰变常数。在eRNA曲线拟合期间，不要将平台固定为零，因为以往研究表明eRNA可能持续存在，不会随时间完全降解^17,40。然而，在分析mRNA衰变时，按照之前的mRNA协议^41,42，将高原定为零。允许GraphPad Prism自动计算eRNA半衰期（t₁/₂），公式为：t_1/2 = In（2）/ k。输入时间（min）;报告所得的半衰期值（最小值）。

Results

为评估转录停滞后RNA稳定性，mESCs与actD处理，并在指定时间点（0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟和30分钟）采集总RNA。cDNA合成后，进行了RT-qPCR以定量 Nsun2 和 Sox2的基因内eRNA、 Pou5f1的基因间eRNA及其对应的mRNA。这些数据被用来生成时间相关的降解曲线（见图2）。在成功的实验中，mESC中的eRNA通常在actD处理后5分钟内表达迅速下降，而mRNA则更稳定，下降程度较小，且保持相对稳定的水平超过30分钟。

Discussion

该方案提出了一种可靠且可重复的mESC中eRNA稳定性测量方法。图示及补充文件清晰展示了关键实验步骤，包括细胞培养、放线霉素D处理、RNA提取和RT-qPCR定量，指导用户完成工作流程。此外，补充 文件4 中还提供了详细的分析程序，如非线性回归建模和置信区间的解释，以支持准确的半衰期估计。在这些步骤中，精确的时机和一致的actD处理至关重要，因为它们直接影响检测不稳定转录本如eRNA。样本采集的延迟或不一致会显著扭曲衰变动力学，降低结果的可重复性。因此，严格遵循指定的时序策略对于生成有意义且可解释的数据至关重要。

虽然该方案优化用于分析半衰期低于30分钟的短寿命eRNA，但也可以通过延长采样时间线或在保留基因外加入突增RNA来提升归一化准确性，以适应更稳定的增强子转录本（^38,39）。此外，该方案侧重于使用放射霉素D测量半衰期，但也可与其他转录抑制剂结合使用，以便对...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-巯基乙醇	吉布科	21985023
放线霉素D	西格玛-奥尔德里奇	A9415
氯仿	大中化工	2548-4105
DMSO	GenDEPOT	D2680
胎儿牛血清（FBS）	西格玛-奥尔德里奇	F0392
明胶	西格玛-奥尔德里奇	G1890-100G
格拉斯哥最低必需介质（GMEM）	吉布科	11710035
GraphPad 棱镜（版本9）	GraphPad 软件
异丙醇	大中化工	5035-4105
击倒血清替代（KOSR）	Gibco，及nbsp;	10828028
白血病抑制因子（LIF）	默克	ESG1106
MEM非必需氨基酸溶液（MnEA）	韦尔根	LS005
M-MLV cDNA合成套件	酶学	EZ006S
OPTIZEN NanoQ Plus	KLAB	01-QI685-M-16-C
青霉素-链霉素	韦尔根	LS202-02
Power SYBR-Green PCR主混音	应用生物系统	4368708
QuanStudio1 实时PCR系统及nbsp;	应用生物系统	A40425
丙酮酸钠	韦尔根	LS013
TRIzol	Invitrogen	15596018