方法文章

K562细胞的表观遗传工程：利用dCas9-DNMT3A和dCas9-HDAC1融合蛋白的双载体附加体策略实现稳定的靶向DNA甲基化

DOI：

10.3791/69328

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2025年10月31日

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1Biology Laboratory, School of Science and Technology, Hellenic Open University, 2Division of Pharmacology and Biosciences, Department of Pharmacy, School of Health Sciences, University of Patras

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种非整合型、附加体型的CRISPR/dCas9系统，用于在K562细胞中进行靶向表观遗传编辑。该系统结合dCas9-DNMT3A和dCas9-HDAC1效应蛋白与特异性sgRNA，可精确诱导位点特异性的DNA甲基化，并降低脱靶效应。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于缺乏能够诱导位点特异性且长期表观遗传修饰以调控基因表达的多功能工具，研究DNA甲基化在基因转录调控中的精确作用以及开发靶向特定基因甲基化模式的疗法面临重大挑战。本研究旨在开发并验证一种创新的基于附加体（episomal）的系统，以促进在特定基因位点实现稳定的DNA甲基化，该系统可能对基础表观遗传学研究和治疗应用均具有价值。为实现这一目标，K562细胞系被 共转染了两种不同的附加体载体。这两种载体均被设计用于表达靶向ZBTB7A基因上游CpG岛326内一段367 bp非甲基化区域的向导RNA（gRNA）。每种载体编码一种失活形式的核酸酶Cas9（即“死亡Cas9”或dCas9），该蛋白分别与DNA甲基转移酶DNMT3A的催化结构域（dCas-DNMT3A-CD）或全长组蛋白去乙酰化酶HDAC1（dCas-HDAC1）融合。dCas序列包含两个核定位信号（NLS），以确保蛋白进入细胞核。这种双系统表达盒可促进形成一种可能有利于长期表观遗传沉默的染色质状态，有望实现强效且持久的表观遗传效应。通过使用可自我复制的附加体载体干预宿主表观基因组具有多项优势：可在多次细胞分裂过程中以低拷贝数维持载体的存在与表达，且不整合入宿主基因组，从而最大限度减少脱靶效应并保持基因组完整性。我们报告了在靶向的ZBTB7A CpG岛326区域DNA甲基化的精确且显著增加。研究结果验证了所构建的附加体CRISPR/dCas系统能够诱导持久且位点特异性的DNA甲基化。因此，该系统是一种评估靶向甲基化变化功能效应的宝贵研究工具，也为未来表观遗传治疗的发展提供了有前景的平台。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

表观遗传调控，包括DNA甲基化和组蛋白修饰，在控制基因表达、细胞分化和基因组稳定性方面发挥着关键作用。这些机制的失调通常参与多种病理状态的发生发展，无论是作为原因还是结果，尤其在癌症、神经疾病和基因组印记综合征中尤为显著1,2,3。值得注意的是，利用表观基因组编辑技术——成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统，可对特定基因组位点的表观遗传景观进行精确干预，实现与基因敲除模型相当的基因抑制水平，同时不改变底层DNA序列4。因此，靶向表观遗传编辑已成为解析基因调控机制和开发精准治疗策略的一种极具前景的方法。

DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂是目前已被批准用于临床的表观遗传治疗手段。然而，这些药物会非选择性地靶向全基因组范围内的表观遗传标记，改变整体的染色质状态，从而导致患者出现脱靶效应和毒性反应5。为克服传统表观遗传调控药物的局限性，研究人员已开发出基于催化失活的Cas9（dCas9）与效应结构域融合的可编程表观遗传编辑工具，这些效应结构域包括DNA甲基转移酶（例如DNMT3A）、去甲基化酶（例如TET1）、组蛋白乙酰转移酶（例如p300）或去乙酰化酶（例如HDAC3）6,7,8,9。dCas9-效应因子系统可在小RNA分子——即单导向RNA（sgRNA）——的引导下，实现对特定基因组位点的表观基因组修饰，且不会在目标序列处引入双链断裂。近期研究已证实，该系统可用于调控基因表达、重塑染色质可及性，甚至重编程细胞表型10,11,12。

尽管取得了快速进展，基于 dCas9 的表观基因组编辑系统仍面临一些局限性。最常见的挑战是由于表观遗传效应结构域缺乏特异性而导致的脱靶效应，尤其是在 dCas9 融合工具强表达或长期表达的情况下13,14。此外，dCas9 融合蛋白分子量较大，给递送带来显著困难。Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）序列的大小约为 4.2 kb15，接近腺相关病毒（AAV）载体的最大承载容量。虽然慢病毒载体具有相对较大的承载能力（~12-1 kb），能够递送全长的 SpCas9 与表观遗传效应因子的融合体，但仍存在随机整合到基因组的风险，可能导致插入突变，从而限制其临床应用16。另一方面，非病毒方法（如质粒转染）在分裂细胞中保留率较低。瞬时或"击即离去"的递送策略虽可避免基因组整合，但通常难以在细胞分裂过程中维持稳定的甲基化改变，除非与染色质重塑因子或协同效应因子联用17,18,19。

为应对这些挑战，我们采用了一种非整合型、可自我复制的附加体质粒系统（pEPI-S/MAR）来递送与dCas9融合的表观遗传效应因子。该质粒在分裂细胞中以低拷贝数（约每细胞1-2个）在染色体外持续存在，从而实现持续但适度的表达，以最大限度地减少因过表达引起的非预期功能20,21。附加体中的支架/基质附着区（S/MAR）元件可与核基质相互作用，有助于在细胞分裂过程中使附加体在细胞核内稳定维持22,23。此外，pEPI质粒系统避免了病毒整合相关的风险，并可在不超出包装容量限制的情况下递送构建体。

近期研究表明，带有活性组蛋白修饰（特别是H3K27乙酰化，H3K27ac）的启动子区域通常对工程化DNA甲基化具有抗性。已有研究显示，采用组合策略，即利用组蛋白修饰的“书写”酶或“擦除”酶来去除或添加组蛋白修饰，同时通过DNMT3A引入DNA甲基化，可提高基因沉默的稳定性和持久性，即使在瞬时干预中也是如此19,24。基于这些发现，我们提出假设：共递送dCas9-HDAC1和dCas9-DNMT3A，并靶向邻近的遗传区域，将促进染色质重塑，从而在目标调控元件上实现更高效且持久的甲基化。

本研究旨在设计并构建一个能够靶向且稳定地对 ZBTB7A 基因的CpG岛326区域进行DNA甲基化的系统，该区域在K562细胞中具有内源性甲基化水平低和H3K27ac异常修饰的特征。本研究的目标是利用低表达、稳定且非整合型的pEPI系统，递送两个分别编码dCas9与不同表观遗传效应蛋白融合的附加体质粒，同时递送靶向 ZBTB7A 基因上游富含CpG的调控区域的sgRNA。如图1所示，将这些附加体质粒共转染至K562细胞后，可实现编辑复合物在目标CpG岛上的双重招募：其中HDAC1去除局部组蛋白乙酰化修饰，从而促进DNMT3A介导的后续DNA甲基化，最终实现协调且位点特异性的表观遗传修饰。

此处描述的系统适用于因构建体大小、安全问题或成本限制而不适合采用病毒递送的应用场景。该系统支持不同sgRNA和效应蛋白融合体的模块化克隆，可灵活适用于多种靶位点。目前最适用于 体外 或在能够耐受质粒转染和抗生素筛选的细胞系中进行的临床前研究。在本实验中，通过基于脂质体转染试剂的方法将附加体质粒递送至K562细胞，并在G-418筛选条件下维持培养。

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方案

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1. sgRNA 的设计

  1. 使用基因组浏览器（例如 UCSC 基因组浏览器）识别目标基因启动子区域内的目标 CpG 岛或调控性 CpG 位点。本实验设计针对 ZBTB7A 基因的 CpG 岛 326（GRCh38）进行。
  2. 使用在线 CRISPR sgRNA 设计平台（例如 CHOPCHOP 网络工具，版本 3）设计单导向 RNA（sgRNA）。设计 sgRNA 时，请遵循以下建议，以确保较高的靶向活性和最小的脱靶效应：
    1. 选择 SpCas9 蛋白作为核酸内切酶，以 5'-NGG-3' 作为 3' 端的前间隔序列邻近基序（PAM-3'）。
    2. 选择 sgRNA 长度为 20 bp（不包括 PAM 序列）。允许在前间隔序列中存在最多三个错配的脱靶匹配。
    3. 当选择靶向基因的特定区域时，选择“启动子”选项，并定义上游范围（例如，对于 CpG 岛 326，选择上游 1500 bp 至 3000 bp 范围），以将 sgRNA 定位于调控区域。
    4. 使用 Doench 等人开发的靶向效率评分25来评估 sgRNA 活性。
  3. 在选择用于实验的 sgRNA 时，考虑以下标准：
    1. 根据目标区域的效率对所有候选 sgRNA 进行排序，选择预测效率位于前 10%-20% 的 sgRNA。在选择时，避免在潜在脱靶位点存在错配（MM0、MM1、MM2、MM3）的 sgRNA。
    2. 选择原本未甲基化或弱甲基化区域的 sgRNA，用于 dCas9-DNMTs 介导的转录抑制。对于使用 dCas9-HDACs 进行转录抑制，应靶向高度乙酰化的区域以提高效率。使用在线数据库（例如 ChIP-Atlas）确认 K562 细胞中目标位点的 DNA 甲基化和组蛋白乙酰化修饰状态。
    3. 对于大于 100-200 bp 的目标区域，使用多个 sgRNA 进行覆盖26。
      注：表观遗传修饰（甲基化和去乙酰化）会影响 sgRNA 结合位点上下游的区域，且这些效应可能局限于较短的基因组片段。
    4. 选择 GC 含量在 40% 至 80% 之间的 sgRNA。
      注：sgRNA 的 GC 含量至关重要，较高的 GC 含量可增强 RNA 稳定性和 dCas 蛋白的结合能力。
    5. 避免含有四个或更多连续胸腺嘧啶（T）的 sgRNA，并选择在 PAM 位点上游第四个碱基位置含有腺嘌呤（A）或胸腺嘧啶（T）的 sgRNA。
      注：四个或更多连续的 T 可能导致提前转录终止。在 PAM 位点上游第四个碱基位置含有 A 或 T 的 sgRNA 可能表现出更强的 dCas 结合能力。
    6. 检查并避免具有高自互补性的 sgRNA，以降低形成二级结构的风险。
    7. 最终确定少数几个 sgRNA 序列。
      注：共设计了四个覆盖 CpG 岛 326 的 sgRNA。sgRNA1-4 的靶序列及其在 CpG 岛 326 上的靶向位置见补充表 1。
  4. 将选定的 sgRNA 序列（不包括 PAM 三联体）转换为其反向互补序列。在正向序列的 5' 端添加 GATCG，在 3' 端添加 G；在反向互补序列的 5' 端添加 AAAAC，在 3' 端添加 C。向商业寡核苷酸供应商订购每个 sgRNA 对应的两条最终寡核苷酸。

2. 克隆

注意：本节描述了对质粒 pEPI-1 进行改造，以生成携带 dCas-表观遗传效应因子融合蛋白和 sgRNA 表达盒的附加体质粒载体。有关克隆流程和载体结构的全面概述，请参见图 2。下文所述的所有限制性酶切和连接反应均按照所用每种酶和试剂的制造商推荐方案进行，反应条件详情列于补充表 2中。

  1. 使用 AgeI 和 BspEI 酶切 pEPI-1 质粒，这两个酶切位点位于增强型绿色荧光蛋白（eGFP）编码序列的两侧。限制性酶切后，使用 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段将产生的黏性末端补平。利用 T4 DNA 连接酶连接平末端的质粒骨架，构建缺失 eGFP 的载体。
    注意：eGFP 基因的删除旨在减小载体整体大小。较大的载体可能限制后续的克隆和转染步骤。
  2. 获取 DNMT3A 基因催化结构域（CD）和 HDAC1 基因全长的编码序列。在每个编码序列的 3' 端（下游）添加终止密码子。在序列两侧分别引入 BglII（5' 端）和 AseI（3' 端）限制性酶切位点。
  3. 用 BglII 和 AseI 酶切缺失 eGFP 的 pEPI-1 载体。同时，用相同的酶分别酶切已准备好的 DNMT3A(CD) 和 HDAC1 编码序列。进行两个独立的连接反应：
    1. 将 DNMT3A(CD) 片段连接至酶切后的载体中，构建 pEPI-1-DNMT3A 载体。
    2. 将 HDAC1 片段连接至酶切后的载体中，构建 pEPI-1-HDAC1 载体。
      注意：BglII 和 AseI 位点可使插入片段位于 pCMV 启动子下游和 S/MAR 元件上游，以实现最佳表达。
  4. 将每种载体的连接产物分别转化至化学感受态的大肠杆菌（Escherichia coli，例如 NEB 5-alpha 感受态 E. coli，高效率型）中。将转化后的细胞涂布于含有卡那霉素（50 µg/mL）的 LB 琼脂平板上，37 °C 过夜培养。挑选阳性克隆，并采用快速煮沸法小量提取质粒 DNA27,28。
  5. 获取催化失活的 SpCas9（dCas9）的编码序列。按以下顺序引入下列元件：
    1. 5' 端：AscI 限制性酶切位点、Kozak 共识序列和起始密码子（ATG）。
    2. 3' 端：核定位信号（NLS），可选 HA 标签，随后为 BamHI 限制性酶切位点。
  6. 用 AscI 和 BamHI 分别酶切 pEPI-1-DNMT3A 和 pEPI-1-HDAC1 载体，同时对 dCas9 插入片段进行相同酶切。将 dCas9 片段连接至各自对应的载体中。
    注意：AscI/BamHI 位点确保 dCas9 插入在 DNMT3A 或 HDAC1 的上游，紧接在 pCMV 启动子下游。需确保 dCas9 与表观遗传效应子之间存在短连接子或若干核苷酸，以维持正确的阅读框。
  7. 将最终的连接产物转化至对质粒表达具有严格调控能力的高效感受态 E. coli 菌株中（例如 NEB 5-alpha F'Iq 感受态 E. coli，高效率型）。在卡那霉素平板上筛选转化子。使用快速煮沸法小量提取阳性克隆的高质量质粒 DNA。
  8. 对最终的质粒构建体（pEPI-1-dCas9-DNMT3A 和 pEPI-1-dCas9-HDAC1）进行纳米孔测序，确认所有组件的正确组装，使用在线翻译工具（例如 Expasy translate tool 3.0）验证阅读框，并使用在线比对工具（例如 BLAST 比对工具）检测潜在的突变或重组事件。
    注意：较大的载体更容易发生重组，并可能积累突变，因此必须进行充分的序列验证。
  9. 使用 T4 多核苷酸激酶对正向和反向 sgRNA 寡核苷酸的 5' 羟基进行磷酸化处理。通过将混合物加热至 90 °C 数分钟以变性二级结构，然后缓慢冷却至室温过夜，使两条互补链完全退火形成双链 DNA。
  10. 用 BamHI 和 Esp3I 酶切选定的 pGuide sgRNA 表达载体。使用 T4 DNA 连接酶将退火后的双链 sgRNA 片段连接至线性化载体中。
  11. 使用特异性 PCR 引物（补充表 3），扩增完整的 gRNA 表达盒，包括（1）U6 启动子，（2）克隆的 sgRNA 序列，以及（3）sgRNA 支架序列。使用不产生 3' 突出端的高保真 DNA 聚合酶（即具有校对功能的聚合酶），以确保获得干净的平末端 PCR 产物，适用于后续克隆。
  12. 对第 1 节中设计的每条独立 sgRNA 重复步骤 2.9–2.11。确保每条 gRNA 表达盒分别制备和扩增，以保持靶向特异性。
  13. 用 SacII 酶切 pEPI-1-dCas9-DNMT3A 和 pEPI-1-dCas9-HDAC1 载体。使用 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段将黏性末端补平。利用 T4 连接酶将先前扩增的 U6 启动子-sgRNA-支架表达盒克隆至这些载体中。
    注意：在实验阶段构建了多种 gRNA-表观遗传效应子组合（例如 sgRNA1-dCas9-DNMT3A、sgRNA2-dCas9-HDAC1 等）。然而，仅有两种选定的组合被用于后续章节所展示的实验。
  14. 将最终的连接产物转化至对质粒表达具有严格调控能力的高效感受态 E. coli 菌株中。在卡那霉素平板上筛选转化子。使用快速煮沸法小量提取阳性克隆的高质量质粒 DNA。
  15. 使用纳米孔测序对最终的质粒构建体进行测序，验证阅读框，并检测潜在的突变或重组事件。

3. 细胞培养与转染

  1. 将 K562 细胞在 37 °C、5% CO2 和湿度条件下，于 T-75 培养瓶中进行培养。使用添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 1× 青霉素/链霉素溶液（Pen/Strep）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
  2. 准备用于转染的质粒：
    1. 每次转染使用 8 µg 总质粒 DNA，因此共转染两个质粒时，每个质粒使用 4 µg。通过 260 nm 处的吸光度定量 DNA，然后将所需量的 DNA 溶解于 90 µL 超纯水中。
    2. 向稀释后的 DNA 中加入 10 µL 3 M 醋酸钠溶液和 2.5 倍体积的 100% 乙醇。
    3. 充分混匀后，在 -20 °C 下孵育过夜以沉淀 DNA。
      注意：当共转染两个含有不同 gRNA-表观遗传效应子组合的质粒（例如 gRNA1-dCas9-DNMT3A 和 gRNA2-dCas9-HDAC1）时，建议将两个质粒合并至同一沉淀管中，以便简化后续操作。
    4. 次日，在 4 °C 下以 11,000 × g 离心 15 分钟，收集 DNA 沉淀。
      注意：所有后续步骤均需在生物安全柜中的无菌条件下进行，因为此阶段还将涉及活细胞的操作。
    5. 小心弃去上清液。加入 500 µL 70% 乙醇洗涤沉淀，在 4 °C 下以 11,000 × g 离心 5 分钟。
    6. 彻底去除乙醇上清液。让沉淀在空气中干燥，直至无可见乙醇残留。
    7. 将干燥的 DNA 沉淀充分重悬于 50 µL DMEM 中。将质粒-DMEM 溶液置于 4 °C 保存，直至使用。
    8. 取约 400 ng 制备好的附加体质粒 DNA（约 2.5 µL 重悬液）在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，以验证转染前 DNA 纯化效果及完整性。
  3. 准备细胞：
    1. 当 K562 细胞培养至 50–60% 汇合度时，从 T-75 培养瓶中收集细胞，以确保转染效率。
    2. 使用血细胞计数板计数细胞。将含有 2 × 105 个细胞的体积转移至含有 900 µL 无 FBS 和抗生素的 DMEM 的 35 mm 培养皿中。
      注意：转染过程中的所有步骤均应使用无血清 DMEM。仅在转染孵育期结束后恢复完全培养基培养条件。
    3. 将培养皿放入培养箱（37 °C，5% CO2）中，使细胞保持在适合转染的状态。
  4. 使用基于 Lipofectamine 的转染试剂盒进行质粒递送。根据所用试剂盒的说明书操作，必要时调整体积。
    1. 向已准备好的质粒-DMEM 溶液中加入 3 µL P3000 试剂（试剂盒提供）。轻轻混匀后，室温孵育质粒-P3000 试剂混合物 5 分钟。
    2. 加入 5 µL Lipofectamine 3000 试剂（试剂盒提供），并加入适量 DMEM 使总体积达到 100 µL。室温孵育 15 分钟。
    3. 将全部 100 µL 转染混合物加入含有细胞的 35 mm 培养皿中。轻轻摇动培养板以分散混合物，然后将培养皿放回培养箱。
  5. 转染后 24 小时，向每个 35 mm 培养皿中加入 3 mL 完全培养基（含 10% FBS 和 1× Pen/Strep 的 DMEM），以启动转染细胞的增殖。转染后 72 小时，通过添加 G-418 抗生素至终浓度 1 mg/mL 开始筛选程序。
  6. 当筛选充分建立且总细胞数超过 1 × 106 时，使用荧光激活细胞分选（FACS）分离单克隆（图 3A）：
    1. 在 25 °C 下以 300 × g 离心 6 分钟收集细胞。用 1× 无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH ~7.4）洗涤一次，并在相同条件下再次离心。
    2. 将细胞沉淀重悬于 1× PBS 中，使用血细胞计数板测定细胞浓度。将悬液稀释至 1 × 106 个细胞/mL，并确保充分重悬。
    3. 将 FACS 设置为单细胞模式（确保每液滴含一个细胞），使用经组织培养处理的 96 孔板作为收集装置。根据所用仪器调整软件设置（图 3B）。
    4. 根据预期的细胞大小（FSC）和颗粒度（SSC）对主要细胞群进行设门。排除碎片（低 FSC/SSC）以及高颗粒度或死亡物质（高 SSC）。使用 FSC-A 与 FSC-H 或 SSC-A 与 SSC-H 点图对单细胞进行设门。
    5. 在分选前，向 96 孔板每孔预加含 1 mg/mL G-418 的完全培养基 100 µL，并将板置于培养箱中预热。
    6. 以单细胞模式进行分选，保持分选速率低于 300 事件/秒，以提高分选准确性。
    7. 分选后，在显微镜下检查各孔，确认每孔含有一个细胞。将板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。
  7. 让单细胞克隆在 96 孔板中独立扩增。一旦克隆生长稳定，将 G-418 浓度降低至 400 µg/mL 以维持筛选压力。
  8. 将生长良好的克隆依次转移至 12 孔板，随后根据需要转移至 T-25 和 T-75 培养瓶，直至每个克隆达到约 1 × 106 个细胞。
  9. 定期收集双份细胞沉淀。将一份沉淀储存于 -20 °C 用于基因组 DNA 提取；另一份用 500 µL Trizol 试剂匀浆后储存于 -20 °C，用于 RNA 提取和 cDNA 合成。
    警告：Trizol 试剂具有毒性和腐蚀性，操作时应在化学通风橱中佩戴个人防护装备，且污染材料必须标记为危险废物进行处置。
  10. 采用传统的酚-氯仿抽提法提取所选克隆的基因组 DNA，随后进行乙醇沉淀。
    警告：酚:氯仿具有毒性和腐蚀性，应在化学通风橱中佩戴个人防护装备进行操作。含酚和氯仿的废液应作为危险化学废物处理。
  11. 确保 DNA 完全重悬于无核酸酶水或 TE 缓冲液中。在进行下游应用前，使用分光光度计测定 DNA 浓度和纯度。
    注意：该 DNA 将用于 PCR 和焦磷酸测序等下游实验，以评估表观遗传编辑效率。
  12. 使用 Trizol 试剂从细胞沉淀中提取总 RNA，随后进行异丙醇沉淀29。操作 RNA 样本时应使用无 RNase 的试剂和耗材，并在操作过程中保持样本处于 4 °C。
    注意：总 RNA 将用于通过逆转录试剂盒进行 cDNA 合成。

4. 通过PCR确认克隆中两种附加体质粒的存在

  1. 充分重悬细胞后，从每种培养克隆中收集约 5 × 105 个细胞。在 25 °C 下以 7,000 x g 离心 3 分钟，弃去上清液。
  2. 用 1× PBS 重悬细胞进行洗涤，并在相同条件下再次离心。
  3. 弃去上清液，仅保留少量液体，液面略高于沉淀。直接取 1 µL 细胞悬液作为 PCR 模板。
  4. 或者，使用从转染克隆中提取的 200 ng 纯化基因组 DNA。
    注意：直接以洗涤后的细胞进行 PCR 可实现快速筛选，但结果可能具有变异性。为获得更高的特异性和灵敏度，建议使用纯化的基因组 DNA 作为模板。
  5. 根据 表 1 配制 PCR 主混合液。
  6. 使用两组引物，其中正向引物为靶向 dCas9 序列的通用引物，反向引物则分别为针对各表观遗传效应因子载体的特异性引物（补充表 3）。
  7. 按照 表 2 所示的循环条件进行扩增。
  8. 通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析 PCR 产物，以确认产物大小：含 DNMT3A 的载体为 230 bp，含 HDAC1 的载体为 205 bp（图 3C）。设置阳性对照（两种质粒混合物，浓度为 10–20 ng）以验证预期条带大小并确认 PCR 效率。同时设置无模板对照（NTC）。
试剂终浓度/用量
10× Buffer 1×
正向引物1 μΜ
反向引物0.5 μM
DNA200 ng
聚合酶1.25 U
dNTPs每种 200 μM
无核酸酶水 加至 50 μL

表1：用于附加体验证的PCR反应体系。

步骤 温度, °C 时间 循环次数 
初始变性953 min1
变性9530 s30
退火5830 s
延伸721 min
最终延伸725 min1

表2：附加体质粒验证的PCR扩增循环条件。

5. 靶向焦磷酸测序分析

  1. 根据制造商说明书，使用亚硫酸氢盐转化试剂盒处理从转染克隆中提取的基因组DNA（1.5 µg）。
  2. 设计引物以扩增构建体所靶向的调控区域内CpG位点的侧翼序列。使用专用的亚硫酸氢盐引物设计工具，并遵循以下设计原则：
    1. 将CpG岛或CpG位点所在的调控区域转换为亚硫酸氢盐处理后的序列版本。
    2. 为亚硫酸氢盐转化后的DNA设计正向和反向引物用于PCR扩增。在其中一个引物（通常为反向引物）上标记生物素，以便固定于链霉亲和素包被的磁珠上。
    3. 在PCR产物内部设计测序引物（18–25 bp），位置应位于目标CpG位点上游，选择sgRNA结合位点上下游100 bp范围内的区域作为目标区域，以评估可能存在的局部表观遗传修饰。
    4. 引物序列中应避免包含CpG位点，以确保扩增无偏倚。
    5. 选择经引物设计软件评估得分高于75%，且质量评级为“高”（蓝色）的引物对，表明软件分析未发现任何问题或潜在风险。
      注意：针对CpG岛326设计的引物序列，请参见补充表3。这些引物设计用于结合sgRNA1和sgRNA2结合位点侧翼区域，从而实现对靶向位点周围CpG位点的测序。
  3. 使用专为亚硫酸氢盐模板优化的高保真热启动DNA聚合酶建立PCR反应体系。
  4. 焦磷酸测序操作步骤：
    1. 将生物素标记的PCR产物与链霉亲和素包被的Sepharose磁珠结合，并利用焦磷酸测序工作站分离单链DNA。
    2. 在退火缓冲液中加入测序引物至单链DNA中。将混合物加热至80 °C维持2分钟，随后缓慢冷却至室温。
    3. 使用焦磷酸测序仪并按照引物设计时确定的试剂添加顺序进行测序反应。
  5. 数据分析：
    1. 使用专用焦磷酸测序软件定量每个CpG位点的甲基化百分比。
    2. 比较转染克隆与未转染克隆之间的甲基化水平，评估编辑效率（图3D）。建议对未处理对照组与每个转染克隆在各个单独CpG位点的甲基化水平进行双尾非配对t检验以进行统计学比较。

6. dCas表达分析的cDNA合成与数字PCR

  1. 将转染克隆中提取的总RNA（每反应1,100 ng）溶于12 µL无RNase的水中。样品置于冰上保存。
  2. 在冰上配制基因组DNA消除体系：将2 µL gDNA去除缓冲液、含1,100 ng总RNA的RNA样品以及无RNase水混合，终体积为14 µL。42 °C孵育2分钟，然后置于冰上。
  3. 在冰上配制反转录主混合液：将4 µL RT缓冲液与1 µL RT引物混合，再加入1 µL反转录酶。
  4. 将14 µL基因组DNA消除混合液与6 µL反转录主混合液混合，总体积为20 µL。轻轻混匀后，于42 °C孵育15分钟。随后在95 °C加热3分钟以灭活反转录酶。
    注意：将cDNA储存于-20 °C，待后续使用。
  5. 用无核酸酶水将所有样品的cDNA按1:1比例稀释。使用稀释后的cDNA进行下游数字PCR分析，采用配备dCas特异性引物的数字PCR系统（补充表3）：
    1. 根据表3配制4×主混合液和反应混合液。将稀释后的cDNA加入混合液中，并轻轻吹打以确保充分混匀。
      注意：所有克隆的反应至少设置两个重复。需包括阴性对照（未处理K562细胞的cDNA）和NTC（无模板对照）。
    2. 将9 µL反应混合液加入PCR板的每个孔中。按照表4所示的循环条件设置PCR程序。
    3. 选择FAM荧光染料通道进行检测，并启动运行。
    4. 运行完成后取出样品并分析数据。
      注意：数字PCR报告结果为每µL反应体系中的拷贝数。
    5. 将报告值（拷贝数/µL）乘以反应体积（10 µL），得到每反应的总拷贝数；再将该值除以反应中cDNA的量，得到每ng cDNA的拷贝数（相当于ng RNA输入量）。
      注意：若严格按照本方案操作，每个样品起始RNA量为1,100 ng，进行20 µL反转录反应（浓度为55 ng/µL）。经1:1稀释后，工作浓度为27.5 ng/µL；由于每PCR反应加入1 µL，因此每反应对应27.5 ng cDNA（RNA当量）。
主混合液（4×）
试剂终浓度/用量
25× SYBR Green 染料2×
5× 数字PCR混合液4×
无核酸酶水 加至 100 μL
反应混合液
试剂终浓度/用量
4× 主混合液1×
正向引物1 μΜ
反向引物1 μΜ
cDNA（已稀释）1 μL
无核酸酶水 加至 10 μL

表3：dCas表达数字PCR分析的4×主混合液及反应混合液。

步骤 温度, °C 时间 循环次数 
初始变性9610 min1
变性965 s40
退火/延伸6015 s

表4：数字PCR的循环条件。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了研究我们设计的靶向表观遗传编辑工具是否能够在ZBTB7A CpG岛326位点诱导特异性的DNA甲基化改变，我们首先构建了编码dCas9与DNMT3A(CD)或HDAC1融合蛋白的附加体型载体，并设计了多种靶向CpG岛326区域内不同位点的sgRNA。我们最初将这些质粒组合共转染至K562细胞中，以评估sgRNA与效应模块同时递送是否能够引起可重复的表观遗传修饰。

初始的附加体质粒共转染策略及其局限性
我们首先尝试同时共转染四种附加体性质粒。最初使用了两种表达dCas9融合表观遗传效应因子的载体（pEPI-1-dCas9-DNMT3A 和 pEPI-1-dCas9-HDAC1），以及两种仅携带靶向CpG岛326的sgRNA表达盒的独立pEPI-1质粒（图2）。测试了不同组合的sgRNA（1-4），每次转染共递送两种sgRNA，以覆盖CpG岛326上的调控位点。sgRNA在CpG岛326上的靶位点如图3D...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方案中最关键的步骤之一是设计高度特异性的sgRNA。脱靶效应是基于CRISPR的表观遗传编辑系统已知的局限性，通常源于dCas9结合的不忠实性以及效应结构域的非特异性活性。为最大限度减少脱靶效应，必须使用生物信息学工具设计sgRNA，以优化其靶向活性并最小化脱靶结合30。建议采用sgRNA设计工具并对预测的潜在脱靶位点进行验证，同时比较携带不同sgRNA的克隆，有助于进一步区分真实的靶向效应。另一个关键步骤是仅使用表观遗传修饰酶的催化结构域，以避免全长酶的残余功能引发内源性相互作用31。需要注意的是，dCas融合系统的有效性受多种因素影响，而这些因素并不总是可预测的，例如染色质状态、靶区域在细胞核三维结构中的周围位点以及细胞类型。sgRNA靶位点的选择通常需要通过实验进行试错探索，耗时较长。设计多个覆盖目标CpG区域的sgRNA，并优先选择内源性甲基化水平较低和/或乙酰化水平较高的位点用于HDAC靶向，可提高获得有效克隆的可能性。目前，一些可在线使用的工具也正在逐步开发，用于预测sgRNA活性及CRISPR-Cas9表观遗传编辑系统的效果<...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性的财务或非财务利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Irene Dereki 和 Vasiliki Chondrou 获得希腊开放大学研究基金特别账户（ELKE）为期三年的资助（资助编号：80706）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Absolute Q DNA 数字PCR预混液（5倍浓度）Applied BiosystemsA52490
AgeI-HF NEBR3552
AscINEBR0558
AseINEBR0526
BamHI-HFNEBR3136
BD FACS Melody 细胞分选仪BD
BglllNEBR0144
BspEINEBR0540
脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物（每种10 mM）NEBN0447
DMEM 高糖培养基，含稳定型谷氨酰胺和丙酮酸钠BiowestL0103
DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）NEBM0210
DNMT3A（CD）、HDAC1序列IDT
DreamTaq DNA聚合酶 Thermo ScientificEP0712
EpiTectQiagen59104亚硫酸氢盐转化试剂盒 
Epitect 亚硫酸氢盐试剂盒Qiagen59104
Esp3INEBR0734
胎牛血清GibcoA5256701
遗传霉素选择性抗生素（G418硫酸盐）Gibco11811031
Lipofectamine 3000 转染试剂盒InvitrogenL3000015
NEB® 5-alpha 感受态 E. coli （高效率）NEBC2987I
NEB® 5-alpha F'Iq 感受态 E. coli （高效率）NEBC2992H
Nucleospin 组织DNA提取试剂盒 Macherey-Nagel740952.50
PBS，10倍浓缩液，pH 7.4LonzaBE17-517Q
青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩BiowestL0022
pGuide载体OriGene TechnologiesGE100042
苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1，用含10 mM Tris（pH 8.0）和1 mM EDTA的溶液饱和Sigma-AldrichP2069
引物，sgRNA Eurofins
PyroMark 引物设计软件 QiagenVersion 2.0亚硫酸氢盐引物设计工具 
PyroMark Gold Q24 试剂Qiagen970802
PyroMark PCR试剂盒 Qiagen978703
PyroMark Q24 MDxQiagen焦磷酸测序工作站 
PyroMark Q24 软件 Qiagenv2.0.8焦磷酸测序软件 
Q5® 高保真DNA聚合酶NEBM0491
QuantiTect 反转录试剂盒Qiagen205311
QuantStudio Absolute Q MAP16 板试剂盒Applied BiosystemsA52865数字PCR系统 
SYBR Green I 核酸凝胶染料，DMSO中10,000倍浓缩液InvitrogenS7563
T4 DNA连接酶NEBM0202
T4 多核苷酸激酶NEBM0201
TRIzol 试剂Invitrogen15596026

参考文献

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dCas9 HDAC1 CRISPR

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