K562细胞的表观遗传工程：利用dCas9-DNMT3A和dCas9-HDAC1融合蛋白的双载体附加体策略实现稳定的靶向DNA甲基化

摘要

本方案描述了一种非整合型、附加体型的CRISPR/dCas9系统，用于在K562细胞中进行靶向表观遗传编辑。该系统结合dCas9-DNMT3A和dCas9-HDAC1效应蛋白与特异性sgRNA，可精确诱导位点特异性的DNA甲基化，并降低脱靶效应。

摘要

由于缺乏能够诱导位点特异性且长期表观遗传修饰以调控基因表达的多功能工具，研究DNA甲基化在基因转录调控中的精确作用以及开发靶向特定基因甲基化模式的疗法面临重大挑战。本研究旨在开发并验证一种创新的基于附加体（episomal）的系统，以促进在特定基因位点实现稳定的DNA甲基化，该系统可能对基础表观遗传学研究和治疗应用均具有价值。为实现这一目标，K562细胞系被 共转染了两种不同的附加体载体。这两种载体均被设计用于表达靶向ZBTB7A基因上游CpG岛326内一段367 bp非甲基化区域的向导RNA（gRNA）。每种载体编码一种失活形式的核酸酶Cas9（即“死亡Cas9”或dCas9），该蛋白分别与DNA甲基转移酶DNMT3A的催化结构域（dCas-DNMT3A-CD）或全长组蛋白去乙酰化酶HDAC1（dCas-HDAC1）融合。dCas序列包含两个核定位信号（NLS），以确保蛋白进入细胞核。这种双系统表达盒可促进形成一种可能有利于长期表观遗传沉默的染色质状态，有望实现强效且持久的表观遗传效应。通过使用可自我复制的附加体载体干预宿主表观基因组具有多项优势：可在多次细胞分裂过程中以低拷贝数维持载体的存在与表达，且不整合入宿主基因组，从而最大限度减少脱靶效应并保持基因组完整性。我们报告了在靶向的ZBTB7A CpG岛326区域DNA甲基化的精确且显著增加。研究结果验证了所构建的附加体CRISPR/dCas系统能够诱导持久且位点特异性的DNA甲基化。因此，该系统是一种评估靶向甲基化变化功能效应的宝贵研究工具，也为未来表观遗传治疗的发展提供了有前景的平台。

引言

表观遗传调控，包括DNA甲基化和组蛋白修饰，在控制基因表达、细胞分化和基因组稳定性方面发挥着关键作用。这些机制的失调通常参与多种病理状态的发生发展，无论是作为原因还是结果，尤其在癌症、神经疾病和基因组印记综合征中尤为显著^1,2,3。值得注意的是，利用表观基因组编辑技术——成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统，可对特定基因组位点的表观遗传景观进行精确干预，实现与基因敲除模型相当的基因抑制水平，同时不改变底层DNA序列⁴。因此，靶向表观遗传编辑已成为解析基因调控机制和开发精准治疗策略的一种极具前景的方法。

DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂是目前已被批准用于临床的表观遗传治疗手段。然而，这些药物会非选择性地靶向全基因组范围内的表观遗传标记，改变整体的染色质状态，从而导致患者出现脱靶效应和毒性反应⁵。为克服传统表观遗传调控药物的局限性，研究人员已开发出基于催化失活的Cas9（dCas9）与效应结构域融合的可编程表观遗传编辑工具，这些效应结构域包括DNA甲基转移酶（例如DNMT3A）、去甲基化酶（例如TET1）、组蛋白乙酰转移酶（例如p300）或去乙酰化酶（例....

方案

1. sgRNA 的设计

1. 使用基因组浏览器（例如 UCSC 基因组浏览器）识别目标基因启动子区域内的目标 CpG 岛或调控性 CpG 位点。本实验设计针对 ZBTB7A 基因的 CpG 岛 326（GRCh38）进行。
2. 使用在线 CRISPR sgRNA 设计平台（例如 CHOPCHOP 网络工具，版本 3）设计单导向 RNA（sgRNA）。设计 sgRNA 时，请遵循以下建议，以确保较高的靶向活性和最小的脱靶效应：
   1. 选择 SpCas9 蛋白作为核酸内切酶，以 5'-NGG-3' 作为 3' 端的前间隔序列邻近基序（PAM-3'）。
   2. 选择 sgRNA 长度为 20 bp（不包括 PAM 序列）。允许在前间隔序列中存在最多三个错配的脱靶匹配。
   3. 当选择靶向基因的特定区域时，选择“启动子”选项，并定义上游范围（例如，对于 CpG 岛 326，选择上游 1500 bp 至 3000 bp 范围），以将 sgRNA 定位于调控区域。
   4. 使用 Doench 等人开发的靶向效率评分²⁵来评估 sgRNA 活性。
3. 在选择用于实验的 sgRNA 时，考虑以下标准：
   1. 根据目标区域的效率对所有候选 sgRNA 进行排序，选择预测效率位于....

结果

为了研究我们设计的靶向表观遗传编辑工具是否能够在ZBTB7A CpG岛326位点诱导特异性的DNA甲基化改变，我们首先构建了编码dCas9与DNMT3A(CD)或HDAC1融合蛋白的附加体型载体，并设计了多种靶向CpG岛326区域内不同位点的sgRNA。我们最初将这些质粒组合共转染至K562细胞中，以评估sgRNA与效应模块同时递送是否能够引起可重复的表观遗传修饰。

初始的附加体质粒共转染策略及其局限性
我们首先尝试同时共转染四种附加体性质粒。最初使用了两种表达dCas9融合表观遗传效应因子的载体（pEPI-1-dCas9-DNMT3A 和 pEPI-1-dCas9-HDAC1），以及两种仅携带靶向CpG岛326的sgRNA表达盒的独立pEPI-1质粒（图2）。测试了不同组合的sgRNA（1-4），每次转染共递送两种sgRNA，以覆盖CpG岛326上的调控位点。sgRNA在CpG岛326上的靶位点如图3D.......

讨论

该方案中最关键的步骤之一是设计高度特异性的sgRNA。脱靶效应是基于CRISPR的表观遗传编辑系统已知的局限性，通常源于dCas9结合的不忠实性以及效应结构域的非特异性活性。为最大限度减少脱靶效应，必须使用生物信息学工具设计sgRNA，以优化其靶向活性并最小化脱靶结合³⁰。建议采用sgRNA设计工具并对预测的潜在脱靶位点进行验证，同时比较携带不同sgRNA的克隆，有助于进一步区分真实的靶向效应。另一个关键步骤是仅使用表观遗传修饰酶的催化结构域，以避免全长酶的残余功能引发内源性相互作用³¹。需要注意的是，dCas融合系统的有效性受多种因素影响，而这些因素并不总是可预测的，例如染色质状态、靶区域在细胞核三维结构中的周围位点以及细胞类型。sgRNA靶位点的选择通常需要通过实验进行试错探索，耗时较长。设计多个覆盖目标CpG区域的sgRNA，并优先选择内源性甲基化水平较低和/或乙酰化水平较高的位点用于HDAC靶向，可提高获得有效克隆的可能性。目前，一些可在线使用的工具也正在逐步开发，用于预测sgRNA活性及CRISPR-Cas9表观遗传编辑系统的效果<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Absolute Q DNA 数字PCR预混液（5倍浓度）	Applied Biosystems	A52490
AgeI-HF	NEB	R3552
AscI	NEB	R0558
AseI	NEB	R0526
BamHI-HF	NEB	R3136
BD FACS Melody 细胞分选仪	BD
Bglll	NEB	R0144
BspEI	NEB	R0540
脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物（每种10 mM）	NEB	N0447
DMEM 高糖培养基，含稳定型谷氨酰胺和丙酮酸钠	Biowest	L0103
DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）	NEB	M0210
DNMT3A（CD）、HDAC1序列	IDT
DreamTaq DNA聚合酶	Thermo Scientific	EP0712
EpiTect	Qiagen	59104	亚硫酸氢盐转化试剂盒
Epitect 亚硫酸氢盐试剂盒	Qiagen	59104
Esp3I	NEB	R0734
胎牛血清	Gibco	A5256701
遗传霉素选择性抗生素（G418硫酸盐）	Gibco	11811031
Lipofectamine 3000 转染试剂盒	Invitrogen	L3000015
NEB® 5-alpha 感受态 E. coli （高效率）	NEB	C2987I
NEB® 5-alpha F'Iq 感受态 E. coli （高效率）	NEB	C2992H
Nucleospin 组织DNA提取试剂盒	Macherey-Nagel	740952.50
PBS，10倍浓缩液，pH 7.4	Lonza	BE17-517Q
青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩	Biowest	L0022
pGuide载体	OriGene Technologies	GE100042
苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1，用含10 mM Tris（pH 8.0）和1 mM EDTA的溶液饱和	Sigma-Aldrich	P2069
引物，sgRNA	Eurofins
PyroMark 引物设计软件	Qiagen	Version 2.0	亚硫酸氢盐引物设计工具
PyroMark Gold Q24 试剂	Qiagen	970802
PyroMark PCR试剂盒	Qiagen	978703
PyroMark Q24 MDx	Qiagen		焦磷酸测序工作站
PyroMark Q24 软件	Qiagen	v2.0.8	焦磷酸测序软件
Q5® 高保真DNA聚合酶	NEB	M0491
QuantiTect 反转录试剂盒	Qiagen	205311
QuantStudio Absolute Q MAP16 板试剂盒	Applied Biosystems	A52865	数字PCR系统
SYBR Green I 核酸凝胶染料，DMSO中10,000倍浓缩液	Invitrogen	S7563
T4 DNA连接酶	NEB	M0202
T4 多核苷酸激酶	NEB	M0201
TRIzol 试剂	Invitrogen	15596026