方法文章

用于拟南芥单细胞分析的组织特异性高质量原生质分离

DOI：

10.3791/69330

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2026年2月6日

 ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究提出了拟 南芥根部、叶片、茎部和花部组织的增强原生体分离方案。它采用优化的酶消化和纯化步骤，最大限度地减少细胞损伤和残渣，从而提高产率，并获得高质量的原生质体，用于单细胞方法，如单细胞RNA测序。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单细胞RNA测序（scRNAseq）已成为植物生物学中获取细胞类型特异性基因表达、发育动态及组织对环境因素反应的高分辨率信息的重要工具。将scRNAseq应用于植物的一个主要技术挑战是高效且可重复地分离出无细胞壁的可活单细胞，这反映了植物组织的异质性。原生质体分离通过酶促去除细胞壁，生成单个活体植物细胞，是广泛用于此目的的方法。然而，成功的原生体分离需要精心优化，以维持细胞存活率并保留细胞类型特异性的转录组谱。本文介绍了一个稳健且可重复的方案，用于从多种 拟南芥 组织中分离高质量原生体，包括地面上层（叶片、茎、花）和根组织。该方案考虑了组织类型的独特生理特性，优化酶消化条件和纯化步骤，确保高产率且广泛代表多样细胞类型。由此产生的原生体适用于如scRNA测序、流式细胞术（FACS）和瞬时基因表达分析等应用。它允许从多种组织类型产生单细胞悬浮液。该方法支持细胞异质性的探索，并增强单细胞方法在植物研究中的可靠性。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单细胞RNA测序（scRNAseq）通过以前所未有的分辨率分析基因表达，彻底改变了植物生物学。scRNAseq以细胞类型特异性分辨率1,2,3提供关于细胞异质性、发育轨迹及对环境刺激反应的转录组信息。

与动物系统不同，植物细胞壁坚硬且结构复杂，是高效分离单细胞进行转录组分析的重要障碍。在现有方法中，酶切切除细胞壁以产生原生质体已成为广泛应用的方法，该方法在60多年前开发完成。尽管应用广泛，原生体分离仍是一项技术要求极高的过程，需要针对组织进行优化，以平衡细胞产量、存活率和稳定的转录组。其他方法如单核RNA测序（snRNA-seq）通过分离细胞核7，避免了细胞壁的消化需求。然而，这也意味着失去细胞质中成熟转录本的信息。其他物理解离方法，如机械和激光辅助显微切割，避免酶促细胞壁的消化，但常常易受交叉污染影响，可能导致细胞存活率降低和通量受限 8,9,10。

近年来，许多植物细胞图谱被开发出来，尤其是针对拟南芥，为各种组织的转录组景观提供了重要见解 2,11,12,13,14,15,16,17,18 .然而，这些图谱主要基于幼苗或幼苗阶段的植物，主要关注根部或叶片组织。这些研究所采用的方案需要对较老拟南芥组织（如成熟叶片、花朵和茎）进行优化。此外，在采用细胞类型特异测序研究（如scRNAseq或荧光激活细胞分选（FACS）结合RNA测序之前，原生体分离引起的转录组变化尚未被完全解释。

本文所展示的方法在之前努力基础上进行了改进，同时引入了若干关键改进：它通过优化根部和地面上组织（叶、茎、花）的缓冲浓度，考虑了植物组织间的生理和解剖变异性，并结合了温和的纯净步骤，以最大限度地减少细胞损伤，提高原生体的纯度。与基于核的方法相比，该方法有潜力保留全细胞转录组，从而获得细胞质中成熟mRNA分子的更高分辨率信息。重要的是，该方法具有高的原生质存活率、异质性及组织间的可重复浓度，花中约为9.8 ×10 3 细胞/mg，叶片中为2.2 ×10 2 cells/mg。

本方法的总体目标是提出一种稳健且可重复的原生质体分离方案，适用于多种拟 南芥组织，满足植物单细胞研究对高质量输入的紧迫需求，涵盖多种细胞类型。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究所用试剂和设备详列于 材料表中。

1. 缓冲液制备

  1. 根据表1，在15毫升离心管中制备相应的原生质体分离缓冲液17,18;用于根组织的根质分离缓冲液，或用于花/茎/叶的原生质分离缓冲液，用于地面以上组织。
    注：五株收获的 拟南芥 开花植物（11-12阶段闭花芽）所需的原生质分离缓冲液约量：根部（~ 375 mg）：7 mL，叶片（~930 mg）：5 mL，茎部（~215 mg）：3 mL，花（~10 mg）：2 mL。
  2. 在使用根/叶质分离缓冲液前，加入2%（含/v）纤维素酶RS和1%（含）Macerozyme R10新鲜液。将原生质体分离缓冲液放在旋转器上充分混合，直到粉末完全溶解（约10分钟，25°C）。避免产生气泡，并确保缓冲器内没有粉末结块。

2. 组织消化

  1. 使用前，先用0.2微米滤光器过滤相应的原生质质分离缓冲液。叶子和根部使用标准尺寸的培养皿（100毫米 x 15毫米），少量如花卉则使用小型培养皿（30毫米 x 15毫米）。在转移组织前，在培养皿中加入几滴原生质体分离缓冲液。
  2. 将相应组织转移到培养皿中，并用剃须刀片以尽可能细且快速的垂直划法将其切成更小的块（见图1A）。
    注意：每次样品使用不同的刀片和镊子，以避免交叉污染。使用剃须刀片时请戴上防护手套。
  3. 将剩余的原生质分离缓冲液加入相应培养皿，将切碎组织浸入水中，并在25°C下培养1小时。将地面组织放在台地上（不晃动），并将根组织转移到轨道震动平台（60转/分钟）。

3. 过滤

  1. 孵育后根部样本：
    1. 使用巴斯德移液器，将培养皿中的原生质体转移到放置在预冷开放50毫升离心管顶部的40微米细胞滤网。
    2. 要收集剩余的原生体，将完全相同的W5溶液（2 mM MES pH 5.7,154 mM NaCl，125 mM CaCl2,5 mM KCl）加入同一培养皿，收集附着在培养皿底部的原生质体。将重新悬浮在W5溶液中的原生质体转移到放置在预冷开放50毫升离心管顶部的40微米细胞滤网中。
    3. 再通过一个新的40微米细胞滤网，再一次进入新的预冷50毫升离心管。从现在开始，保持样本冰藏，处理原生质时要非常温柔。
  2. 培养后地面样本：
    1. 使用巴斯德移液器，将培养皿中的原生质体转移到放置在预冷开放50毫升离心管顶部的70微米细胞滤网。
    2. 为了收集剩余的原生体，在同一培养皿中加入完全相同的W5溶液（2 mM MES pH 5.7,154 mM NaCl，125 mM CaCl2,5 mM KCl），以收集附着在培养皿底部的原生质体。将重新悬浮在W5溶液中的原生质体转移到放置在预冷开放50毫升离心管顶部的70微米细胞滤网中。从现在开始，保持样本冰藏，对原生质体要非常温柔。

4. 洗涤与菲科尔净化

  1. 将离心机预冷至4°C，并在离心机零制动设置下，在500× 克 下收集（颗粒）质体5分钟。
  2. 离心后的根样：
    1. 在不扰动质体沉淀的情况下丢弃上清液。
    2. 用巴斯德移液器或1毫升Gilson移液器（带切口）非常温和地将原质体重新悬浮于预冷（4°C）600-700微升根部悬浮缓冲液（等量为根部原生质体分离缓冲液（不含酶）和W5溶液），以避免剪切。
    3. 将悬浮液转移到1.5毫升预冷（4°C）管内。
  3. 离心后地面样品：
    1. 在不扰动沉淀的情况下丢弃上清液。
    2. 将沉淀轻轻地重新悬浮于预冷（4°C）600-700微升的花/茎/叶片再悬浮缓冲液中（等量花茎/叶质分离缓冲液（不含酶）和W5溶液），使用巴斯德移液管或1毫升Gilson移液器，带切头以避免剪切。
    3. 将悬浮液转移到1.5毫升预冷（4°C）管内。
    4. 在1.5毫升管中制备300微升13.3%（w/v）Ficoll PM 400溶液。搅拌后保持冰镇。
    5. 缓慢将重悬质质样本（600-700微升）加入已制备的Ficoll溶液上，且不接触或混合Ficoll层。
    6. 离心机在4°C、700 × g 下离心5分钟，离心机零断裂设置。
    7. 收集存在于中间层（界面）的原生体，以及上相（第一层）（图1B）。注意不要收集含有菲科尔和分离碎片的下三分之一层。保存在4°C，等待进一步使用。

5. 计数与质量检查

  1. 使用10微升的原生质体溶液，用诺伊鲍尔血细胞计计数分离的原生质体数量。
    可选：可添加1%（无量）Evans蓝染料以评估原生质的生存能力（见图1C）。
  2. 将原生质体溶液稀释至所需的原生质体浓度，使用预冷（4°C）的再悬浮缓冲液（根部的步骤4.2.2，地面上组织的步骤4.3.2）稀释至所需的原生质体/毫升浓度。
  3. 尽快进行预定实验，例如单细胞RNA测序和/或FACS15,19。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

针对地面和根部组织实施的原生质体分离方案成功实现了细胞壁的高效消化，并释放出所有拟南芥组织中完整的单细胞。在受测的组织类型中，包括花、茎、叶和根，酶促消化过程产生了分离良好的原生质体，未消化细胞组数量极少（见图2A-D）。Evans Blue染料检测证实，具有球形形态且质膜边缘光滑的原生体是可存活的细胞（见图1C）。每种组织类型都计数球形原生体。花平均含97,875±7,531个（9,788个细胞/mg，n=3个），茎119,025个±22,508个（550细胞/mg，n=4），叶210,483个±15,572个（225细胞/mg，n=3），根225,363个±52,561个（599细胞/mg，n=4）。

原生质体悬浮液显示细胞大小分布广泛，且存在绿色或浅色质体，反映了每个采集组织的异质细胞组成（见图3A-D）。为证实这一点，进行了带有转基因伴随细胞特异性YFP报告线的原生体分离，悬浮液中含有具有YFP信号的可存活小质体（图3E）。这强调了所采用的原生体分离方案适用于难以分离且细胞壁刚性强的血管细胞。

通过上述优化方法，可以从各种成年植物组织中以极少的碎屑分离出大量可存活的原生质体。为提升地上样本的纯化，我们采用了Ficoll缓冲清洗步骤，去除消化样品中释放的细胞器及其他细胞碎片，同时保持转录组质量（见图4）。

在由原生质体生成的scRNAseq cDNA文库中，通过特定的cDNA PCR测定法检测到高表达的家务转录本如ACTIN2，以及稀有/低表达的转录本如特异于形成层细胞和分生细胞的同源域转录因子 KNAT1，以及伴随细胞标记 SUC2 和 PARCL1， 均被特异性cDNA PCR测定15 检测到（见图5).这表明获得的原生体群体具有广泛的细胞类型代表性和异质性，这一点通过分析该方法产生的scRNAseq数据得到了进一步证实15。

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图1：原生质分离步骤的工作流程。 展示六个主要步骤：（1）缓冲液制备，（2）组织消化，（3）过滤，（4）洗净和Ficoll纯化，（5）计数与质量控制，（6）继续下游实验。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：原生质胚处理步骤的图像。 （A） 叶片样本切碎阶段的代表性图像（步骤2.1）。上图展示了采集的组织，配以几滴缓冲液，置于标准大小的培养皿中，并配有用于切割的剃刀片。下方左侧的图片显示了剃刀经过几次垂直划击后的组织（见箭头）。下方右侧的图片代表切碎后的样本，准备进行下一步。（B）离心后Ficoll缓冲器在1.5 mL管内的图像（步骤4.3.7）。白色箭头表示中间层，包含原生质体。（C）在Evans Blue染料中孵育叶质体的代表性显微镜图像。比例尺：250微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：生成原生体的显微图像。 显示每种组织类型的原生质体图像。（a）花，（b）茎，（c）叶子，（d）根。比例尺：250微米。（E） 伴随细胞特异性YFP报告线的共焦显微镜图像。 第一张图（左）代表了叶片血管中YFP伴随细胞报告者的表达（绿色）。第二张图（右）代表表达YFP报告蛋白（绿色信号）细胞的原生质体。紫色/蓝色代表叶绿体自发荧光。比例尺为10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：叶片原生质体在（A）和（B）Ficoll垫清洗前后的显微图像。 比例杆：250微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：scRNAseq文库的质量控制PCR。 根部和地上组织单细胞RNA测序文库质量控制PCR的代表性凝胶图像。检测基因SUC2、 PARCL、 KNAT1、 ACT2 （分别为A到D），以及每个组织的基因：花、茎、叶、根，从左到右。cDNA（+）作为正对照，水作为负对照。 请点击此处查看该图的放大版本。

根质缓冲液花/茎/叶子原生质缓冲剂
600 mM 甘露醇400 mM 甘露醇
2 mM MgCl2-
0.1% BSA0.1% BSA
2 mM CaCl210 mM CaCl2
2 mM MES pH 5.720 mM MES pH 5.7
10 mM KCl20 mM KCl
如有必要，用1M Tris碱基将pH调到5.5如有必要，用1M Tris碱基将pH调到5.5

表1：原生质分离缓冲区组成。 提供根部及地上（花、茎、叶）组织的原生质体分离缓冲配方。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这一优化的拟 南芥 组织原生质分离方案专为scRNAseq应用量身定制，分析细胞质和细胞核中存在的整个转录组。针对组织的缓冲液优化以及额外的消化和纯化步骤，使得不同组织间的产量稳健且可重复。具体来说，花原生质体平均每个样本有~98,000个细胞（~9,788个细胞/mg组织），干原生质体~119,000个细胞（~550个细胞/mg），叶原生质体~210,500个细胞（~225个细胞/mg），根原生质体~225,000个细胞（~599细胞/mg），反映了这些组织的结构和生理多样性。

该方案的一个关键改进是采用基于Ficoll的缓冲器，取代了更常用的蔗糖基梯度/缓冲器进行净化。与蔗糖被细胞吸收并对转录组13,20,21有重大影响不同，Ficoll具有渗透惰性和膜不透性，因此在分离过程中保持RNA完整性。这一步骤还减少了悬浮液中破碎细胞和细胞碎片中游离细胞器（如叶绿体）的数量。此类碎片的存在可能干扰液滴形成，堵塞微流控器件的通道，或导致液滴中存在多个细胞，从而加剧环境RNA污染。所有这些因素都可能导致scRNA-seq数据分析中出现错误结论或偏差。

研究表明，原生体的分离可以改变植物细胞的转录组2,15,16,19。该方案中为减少该伪影，关键策略是在酶消化后将原生质体保持在4°C（冰藏）以下，这会减缓代谢和转录活性，从而减少已知与原生质体分离相关的转录变化。此外，保持复制间组织采集时间一致并与研究目标保持一致至关重要，因为时间变化已证明会影响原生质体诱导基因和scRNA-seq数据集中昼夜节律调控的转录本15。

在这种方法中，除了以最小的残渣产生单细胞外，另一个非常重要的点是保持组织的异质性，以可能代表所有细胞类型。通过检测到不同形态的原生质体，包括不同大小以及在获得的种群中存在细胞类型特异性报告细胞系的信号，证实了原生质体悬浮物悬浮物的多样性（见图2）。此外，通过PCR检测scRNA-seqcDNA文库中的稀有细胞类型特异性及家务转录本，评估了原生体群体（见图4）。这些包括芽顶分裂组织的罕见标记基因，以及伴随细胞的标记15。这些转录本的成功捕获证实了该方法能够高完整性分离出多种细胞类型，是推动植物单细胞研究的宝贵工具。除了scRNAseq外，该方法还可用于流式细胞术、瞬时基因表达分析和植物再生检测。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文是欧盟“地平线2020”研究与创新计划（拨款协议编号810131）下获得欧洲研究理事会（ERC）资助的一个项目的一部分。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
纤维素酶RS 杜谢法生物化学C8003
离心机5810R型号埃彭多夫5810000010
菲科尔PM 400 西格玛-奥尔德里奇26873-85-8
Macerozyme R10杜谢法生物化学M8002
微离心机5417R型号埃彭多夫已停产
Puradisc 30无菌注射器滤芯，0.2及微型;m西提瓦10462200称为0.2 & micro;协议中的 m 滤波器
无菌细胞滤网40号及微量检测;m 尼龙网 费舍尔布兰德22363547
无菌细胞滤网70及微型;m 尼龙网 费舍尔布兰德22363548

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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RNA

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