通过固体表面荧光监测蜂产品中的2,4-二氯苯氧基醋酸

Summary

本研究提出了一种替代传统技术的新方法，用于控制和监测阿根廷中北部蜂产品样本中的2,4-二氯苯氧羧酸。

Abstract

蜜蜂健康对蜂蜜生产和作物授粉至关重要。蜂蜜的生产可能会因使用除草剂而产生负面影响，因为蜜蜂在采集处理过的植物的花蜜和花粉时可能接触到这些化学物质，导致蜂蜜被这些有毒残留物污染。虽然2,4-二氯苯氧基醋酸（2,4-D）设计用于控制阔叶杂草，但它可能侵入花朵并污染蜜蜂的生产，可能影响蜜蜂的健康和生活质量。因此，定期分析蜂蜜以检测除草剂残留，并在必要时采取纠正措施非常重要。本研究提出了一种替代传统技术的新方法，用于控制和监测阿根廷中北部蜂产品样本中的2,4-D。样品在pH=7.0条件下，使用阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）进行调理，系统通过蓝带过滤纸作为固体支撑体，然后通过固相荧光法确定。在最佳工作条件下，检测和定量限分别为0.33 ng/L和0.90 ng/L，线性范围为0.90 x 10³ ng/L至1.13 x 10³ ng/L。新方法的优点包括使用廉价仪器和环保溶剂，低废弃物产生，从而保护了绿色化学的一些原则。

Introduction

蜜蜂健康对蜂蜜生产和作物授粉至关重要。健康的群体依赖于全面的健康管理，包括适当的营养、卫生措施以及疾病预防和治疗。如果蜂蜜生产负责任，不会伤害蜜蜂，因为养蜂人只提取总蜂蜜的一小部分，为蜂群保留了^1,2。

使用除草剂可能会对蜂蜜生产产生负面影响，因为蜜蜂在采集处理过的植物中的花蜜和花粉时可能接触到这些化学物质，导致农药残留物污染蜂蜜。此外，一些除草剂，如草甘膦，会直接影响蜜蜂的发育和行为，降低它们的觅食能力和^生理发育 3,4,5,6。尽管2,4-二氯苯氧基醋酸（2,4-D）除草剂被设计用于控制阔叶杂草，但它可能侵入花朵并污染蜂蜜，可能影响蜜蜂健康和蜂蜜质量 ^7,8,9。

近年来，国内外蜂蜜及其他蜂产品贸易显著且持续增长，产量增长^10、11、12。根据联合国粮农组织（FAO）的数据，全球有五个主要的蜂蜜生产国：中国、阿根廷、土耳其、美国和乌克兰，¹³个。养蜂业在阿根廷极为重要，近年来随着出口市场机遇的出现，养蜂业持续增长。阿根廷的环境条件（气候、植物等）以及投入的生产技术，使该国在全球占据了重要地位。另一方面，外生物质的存在令人关注，需要监测，与其他国家一样，因为它影响蜂蜜的营销和消费者健康，因其毒性影响^14,15。

2,4-D是一种广泛使用的选择性系统性除草剂，通过合成生长素有效控制阔叶杂草，导致其失控生长和死亡。它被用于农业、园艺和林业，尤其适合控制小麦、玉米和水稻等作物的杂草，因为它不会伤害草类或谷物¹⁶。2,4-D也可用作植物生长调节剂，并有多种配方，包括胺盐和酯盐，以满足多种应用需求。2,4-D功能受所给剂量及特定物种和组织类型的易感性影响^17,18。例如，2,4-D接触被认为会导致小鼠不良生殖结果和显著遗传改变，表明其显著的基因毒性效应¹⁹。

作为研究真社会性、学习和记忆的关键传粉者和模式生物，蜜蜂极易受到^田间农用化学品的直接中毒影响。在花期空中施用除草剂和杀虫剂可能导致蜜蜂大量死亡，并大幅减少蜂蜜产量。即使是亚致死剂量的农药混合物，也会让觅食蜜蜂迷失方向，影响记忆，降低采集效率。这反过来通过减少花粉和花蜜的收集，削弱了群体，导致营养缺乏。此外，2,4-D在蜂蜜样本中检测到，受污染的花粉和花蜜可能在蜂巢配偶之间^传播。

定期分析蜂蜜中是否有除草剂残留物非常重要，并在必要时采取纠正措施。对于检测和定量除草剂等食品污染物（本例为2,4-D），最常用的仪器方法是色谱法，即高性能液相色谱（HPLC）、液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）和气相色谱串联质谱（GC-MS/MS）^{22,23,24,25,26}.然而，研究人员定期提出新的2,4-D监测方法，这些方法相较于传统量化方法^27、28、29具有优势，例如：使用更便宜的仪器、作简便、减少溶剂使用、应用于更复杂样品等。

固相荧光是一种多功能技术，通过结合分子荧光与固相提取方法，进一步提升了荧光仪器本身就很高的灵敏度。它还通过减少或消除矩阵效应，提升线性范围和选择性^30,31。

本研究提出了一种新的分析方法，用于监测和定量2,4-D，并应用于阿根廷中部和北部的蜂蜜及其他蜜蜂样本。样本中含有未知量的2,4-D。已知的是超添加能级的浓度，即样品提供的浓度加上我们添加的2,4-D浓度。后者是已知的，使我们能够计算回收率。该新方法基于利用固相荧光直接测定分析物，展现出多重优势，包括节省仪器、降低运营成本和提升环境保护。

Protocol

本手稿中没有任何作者对人类参与者或动物进行的研究。

所用设备
光谱荧光测量使用配备150瓦氙灯的PC型光谱荧光仪完成。样品架用于固体表面荧光（SSF）测量。用于2,4维定量的参数如下：λ_em= 580 nm，使用 λ_ext=555 nm（狭缝 3-3），使用固体样品架。

采样与样品处理
这项关于2025年蜂蜜样品生产的研究在阿根廷中北部的圣路易斯、圣胡安、胡胡伊和萨尔塔省进行。分析的样本包括：四种多花蜜、两种蜂胶蜂蜜、纯蜂蜜糖果，以及由蜂蜜、古柯和蜂胶混合物制成的糖果，这些糖果从当地养蜂人处购买。研究的蜂蜜为新鲜蜂蜜，生产后不到一周内从蜂箱中提取，以避免因不同机制导致2,4-D的降解。所有样本均被采集到新的无菌容器中，并立即运送到实验室。它们会在4-8°C的黑暗环境下保存，直到分析。固体焦糖用研钵和杵均质化;其内容物被稀释在5毫升超纯水中，从该溶液中提取了0.5微升。

方法论
加入0.5微升或1微升2,4-D（1.23 ng/L和3.49 ng/L）、100微升样品、250微升SDS（1 x ^10-4 mol/L）和100微升磷酸缓冲液（1 x ^10-4 mol/L，pH=7），混合液体积通过加双蒸馏水达到3 mL。混合物通过固体支撑体（纸质过滤器;详见 材料表 ）过滤。固体支撑体在室温下干燥，然后在λ_em= 580 nm处测量固体表面荧光（SSF），使用λ_ext=555 nm（狭缝3-3）并使用固体样品架。

以上描述了该方法论的一般流程，每个参数都被研究和优化，如结果部分所示。

pH和缓冲剂的影响
pH优化通过使用盐酸或氢氧化钠调整系统至所需pH值（测试范围pH 5-7）实现。随后，一旦获得最合适的pH范围以获得合适的分析信号，便选择了所使用的缓冲液。

测试的缓冲液包括磷酸盐、三氯和硼砂，这些缓冲液的制备浓度为1 x ^10-4 mol/L。为了获得最佳的荧光强度信号，它们的体积进行了变化。展示了唯一提升荧光强度的缓冲磷酸盐的结果及其最佳浓度。这里选定的缓冲液是磷酸盐，pH值=7。

界面活性剂浓度
分子荧光中使用不同的界面活性剂具有提升分析物测定能力的优势。使用聚层培养基以最小化分析物与样品基质组分之间的分子间相互作用。此外，荧光溶质的光物理性质可以在胶束培养基中被改变，从而提升荧光灵敏性。研究了不同表面活性剂（SDS和HTAB）对利用固体表面荧光（SSF）定量2,4-D的影响。研究发现，阴离子表面活性剂SDS在8.3 x 10^⁻6 mol/L浓度下，提高了所研究除草剂的荧光强度。

坚实的支撑
鉴于平面构型在激发荧光态下能量上更受青睐，研究了除草剂在固体支撑体上的保留性。这些系统通过多种膜过滤，包括尼龙、醋酸纤维素、混合酯和蓝丝带滤纸。过滤后的溶液被收集到单独的干净容器中，膜在室温下干燥。随后，将膜放入固体样品架中，并记录了固相荧光（SSF）。滤纸上的保留性良好且选择性强，因此选择这种支撑进行固相荧光测定。过滤后的溶液还通过分子荧光分析。2,4-D复合物的缺失明显，显示除草剂在滤纸上被保留。

康复研究
在每个样品的适当体积中加入2,4-D（蜂蜜样品使用0.5微升，其他样品使用1微升），逐渐增加浓度至1.23 ng/L和3.49 ng/L。分析物浓度通过该方法确定，平均为六次复制（n = 6）。

精准研究
通过反复测试含1.23 ng/L和3.49 ng/L的2,4-D样本（n=6），并利用该方法确定分析成分，研究方法重复性和日内精度。此外，对同一系统进行了7天内日间精度的可重复性评估。

干扰研究
在测试溶液中加入了含有3.49 ng/L的2,4-D的常见离子，并应用了该方法。测试了以下潜在干扰物：

Na⁺、K⁺、Cl^-、Fe³⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Sb³⁺、Mn²⁺、As³⁺、CO₃^2-、SO₄^2-、Ca²⁺、Mg²⁺、NO^3-、Ni²⁺、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、2,4,5-T、硫甲基、草甘膦和阿特拉津的干扰物/2,4-D摩尔比 = 1000：1：00。

Zn²⁺、Co²⁺、Al³⁺、氯硫、苯磺呋喃甲基和三硫呋酮的干扰物/2,4-D摩尔比 = 500：1：00。

分析质量参数的计算
分析质量参数包括检测极限（LOD）和定量极限（LOQ）。这些计算是通过应用以下步骤实现的。背景噪声通过测量15个空白样本（不含分析物的样本）的响应来获得背景噪声数据集。计算了噪声的标准差。这被接受为LOD值。检测限基于空白盒标准差的3.3倍（N=15）。量化限制基于空白的10倍标准差（N=15）。

Results

以下结果表明了对影响一般程序、优化及其最佳工作条件的各项变量的研究，是如何逐步进行的。

2,4维频谱表征
2,4维特征分析通过紫外可见光谱和分子荧光进行，观察到λ_em=580 nm时荧光强度的最大值，使用λ_ext=555 nm（狭缝3-3; 图1）。通过提高荧光信号浓度，实现了直接定量（见图2），显示出对荧光信号的提升效应。强调直接分析物定量的细节非常重要，因为它具有多重优势，即：作和计算简便、分析可靠性和鲁棒性，相较于间接方法，后者通过评估分析物如何改变另一种荧光物质的荧光信号来评估分析物。在这种情况下，荧光信号与2,4-D的浓度直接相关，便于作计算并简化作任务。

Discussion

由于满足不断增长的人口需求，阿根廷及世界其他地区除草剂的密集使用呈指数级增长。如果对此类产品的使用进行适当、理性且定期的监控，就不会损害预期的益处，也不会对整体环境产生负面影响。2,4-D在全球范围内被广泛使用，许多研究表明该除草剂能诱导非靶向生物体发生改变。因此，持续评估除草剂对不同生态系统和生物（如蜜蜂）可能构成的风险至关重要，35,36,37,38,39,40。

Almer-Jones于1964年进行^{的研究显示，} 在空中施用2,4-D防治豚草后，该地区数百个蜂箱发生了成蜂...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-D	Sigma-Aldrich，美国圣路易斯	49083
醋酸/醋酸酯	马林克罗特化学厂及nbsp;
蓝丝带滤纸及nbsp;	Sigma-Aldrich，美国圣路易斯	WHA1001929	2-5 和 mu;孔径12.5厘米，nbsp;
醋酸纤维素膜	Sigma-Aldrich，美国圣路易斯		0.45 & mu;孔径为m，孔径为47毫米
六二环三甲基溴化物（HTAB）	Sigma-Aldrich，美国圣路易斯	H5882
盐酸	Sigma-Aldrich，美国圣路易斯	1.09063
Immobilon（+）膜	巴西圣保罗米利波尔	HATF04700	0.45 & mu;孔径为m，孔径为47毫米
混合酯膜	Sigma-Aldrich，美国圣路易斯		0.45 & mu;孔径为m，孔径为47毫米
尼龙膜及nbsp;	巴西圣保罗米利波尔	Z290793	0.45 & mu;孔径为m，直径47毫米
pH计（猎户座膨胀离子分析仪）及nbsp;	猎户座研究，美国马萨诸塞州剑桥	EA 94型号。
二氢磷酸钾	阿根廷布宜诺斯艾利斯的Biopack;	2000168900
邻苯二甲酸钾	默克公司
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich，美国圣路易斯	11667289001
氢氧化钠	Sigma-Aldrich，美国圣路易斯	S2770
四硼酸钠	Sigma-Aldrich，美国圣路易斯	221732
光谱荧光法	岛津	RF-5301及nbsp;	配备150瓦氙气灯和1.00厘米石英电池
三基（羟甲基）-氨基甲烷	Sigma-Aldrich，美国圣路易斯	77-86-1