本方案结合 Thy1-GCaMP6f 转基因小鼠的颅窗技术、标准化电针刺激和双光子成像，以在刺激期间可视化毫秒级皮层神经元群动态，揭示特定皮层层次的可塑性变化。
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本方案结合 Thy1-GCaMP6f 转基因小鼠的颅窗技术、标准化电针刺激和双光子成像，以在刺激期间可视化毫秒级皮层神经元群动态，揭示特定皮层层次的可塑性变化。
本方案建立了一个综合性的实验框架，用于研究电针（EA）刺激期间皮层环路的动力学特性。该方法整合了三个关键部分：在Thy1-GCaMP6f转基因小鼠中植入慢性颅窗、在ST36穴位使用2/100 Hz双相脉冲进行标准化电针刺激，以及高分辨率双光子钙成像。这一整合方法能够以毫秒级的时间精度实时可视化初级躯体感觉（S1）皮层中神经元群体的活动，捕捉以往难以观测到的神经网络水平对神经调节反应的细节。该技术成功揭示了具有皮层分层特异性的激活模式及纵向可塑性变化，为理解电针效应背后的皮层机制提供了关键见解。通过克服传统功能性磁共振成像（fMRI）和电生理技术固有的时空分辨率限制，这一高分辨率平台为动态神经环路的解析提供了前所未有的分析能力。本方案结构严谨、结果可重复，对于优化靶向神经调节治疗策略以及深入理解外周刺激引发的环路水平可塑性具有重要意义。
电针是传统针灸的一种现代改良形式，通过在特定穴位的针具上施加可控的电流，被公认为能够调节参与疼痛处理、运动控制和自主功能的神经回路。其作用机制被认为涉及由外周感觉神经（主要是Aδ和C纤维）激活所引发的复杂信号级联反应，导致神经递质（如阿片类物质、5-羟色胺、GABA）的释放，并继而在脊髓、脑干和皮层水平产生调节作用1,2。其中涉及的关键结构包括躯体感觉皮层。在负责处理触觉和伤害性信息的S1皮层中，电针可能影响局部的抑制-兴奋平衡以及长距离功能连接3,4。然而，由于前述方法学上的限制，电针刺激期间及刺激后即刻，S1皮层内不同神经元群体（如锥体神经元、中间神经元）及各皮层层次的激活/抑制精确时间序列仍基本未被阐明5,6。理解这些实时动态对于优化电针参数并预测治疗效果至关重要。
研究电针（EA）对皮层环路神经调节作用的传统方法，如行为学研究和死后分析，虽能提供有价值的见解，却无法以高时空分辨率捕捉实时神经活动7,8。为....
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所有实验均使用8-12周龄的转基因Thy1-GCaMP6f小鼠18。所有实验操作和动物护理程序均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》的规定，并经华中科技大学实验动物护理与使用委员会（IACUC；方案批准号：3603）批准。所有努力均致力于减少使用动物的数量及其所受的痛苦。图1展示了实验装置的示意图。
1. 慢性颅窗植入
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S1 皮层的结构表征及基础神经活动
我们首先为成像实验建立了高保真的结构与功能基线。组织形态学分析揭示了未使用盖玻片（图 2A）与使用盖玻片（图 2B）的颅窗制备之间存在可辨别的结构差异。尽管盖玻片的应用引入了轻微的压缩伪影（箭头，图 2B），但它有效维持了感兴趣区域（ROI）的整体结构完整性，这对于稳定的慢性成像至关重要。随后对皮层柱进行的双光子 z 轴投影显示，从第 2/3 层（L2/3）延伸至第 5 层（L5）存在密集的高度分支的顶树突网络（虚线，图 2C-E）。树突棘的清晰可分辨性（插图，图 2C）进一步证实了高分辨率成像质量，为可靠的钙功能成像奠定了基础。在超过 90% 的 S1 神经元中观察到钙指示剂 GCaMP6s（绿色.......
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为了弥合在实时观察电针（EA）皮层效应方面的关键空白，我们提出了一项综合性的整合方案，该方案结合了用于光学观测的慢性颅窗植入、标准化的电针刺激，以及针对初级躯体感觉（S1）皮层的纵向双光子钙成像技术。
该整合方案在研究电针（EA）皮层效应方面相较于传统方法具有多项显著优势。首先，该方案提供了前所未有的时空分辨率，能够在电针刺激期间，同时捕捉S1网络中数百个神经元毫秒级的神经活动动态36。结合适当的标记方法，可揭示激活的精确时间序列、活动波的空间传播范围，以及不同神经元亚型之间的反应异质性。其次，慢性颅窗技术实现了纵向成像，使研究人员能够追踪S1区皮层表征和环路动态在多次电针干预后的演变过程37，从而可能揭示累积性镇痛或运动功能恢复等治疗效应背后的机制。第三，借助基因编码的钙指示剂（GECIs）和基因靶向技术所实现的细胞特异性，可深入探究不同神经元群体（如兴奋性锥体细胞与特定中间神经元亚型，包括PV+、SOM+或VIP+神经元）在电针干预下的差异性调控机制
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作者无任何利益冲突需要披露。
本工作得到中国国家自然科学基金（编号：82405550）的资助。我们感谢张实验室成员提供的有益讨论。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 卡洛芬 | MCE | N/A | 5 mg/kg 用于镇痛 |
| 数字立体定位仪 | RWD | Kopf Model 1900 | |
| 电针刺激器 | HANS LH202 (2/100 Hz 双相脉冲) | N/A | HANS LH202 (2/100 Hz 双相脉冲) |
| 异氟烷 | RWD | R510-22-10 | 医用级，以100%氧气为载体 |
| 微型钻孔系统 | RWD | 0.5 mm 碳化钨钻头，生理盐水冷却 | |
| 聚维酮碘 | MCE | HY-B2234 | 10% 溶液 |
| ScanImage | ScanImage | https://scanimage.org/ | |
| 无菌生理盐水 | Beyuntian | ST341-500ml | 0.9% NaCl |
| 手术显微镜 | Zeiss | https://www.zeiss.com/meditec/en/products/surgical-microscopes.html | 10-40× 放大倍数 |
| Thy1-GCaMP6f 转基因小鼠 | Cygen | 5523978 | 8–12 周龄，雄性/雌性 |
| 双光子显微镜 | Nikon A1MP | Nikon A1MP | 钛宝石激光器（920 nm 激发） |
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