利用体内双光子成像可视化电针治疗中体感皮层神经元的时空动态

Summary

该方案整合了Thy1-GCaMP6f转基因小鼠的颅窗、标准化电针灸和双光子成像，以可视化刺激期间毫秒级皮层簇动态，揭示层级特异性可塑性。

Abstract

该方案建立了一个全面的实验框架，用于研究电针（EA）刺激期间皮层回路动态。该方法整合了三个关键组成部分：Thy1-GCaMP6f转基因小鼠的慢性颅窗植入、使用2/100 Hz双相脉冲在ST36穴位进行标准化EA刺激，以及高分辨率双光子钙成像。这种集成方法能够以毫秒级的时间精度实时可视化初级体感皮层（S1）神经群综活动，捕捉此前无法访问的网络级神经调控响应细节。该技术成功揭示了不同层特异性的激活模式和纵向可塑性变化，为EA效应背后的皮层机制提供了关键见解。通过克服传统fMRI和电生理技术固有的时空局限，这一高分辨率平台为动态神经回路的映射提供了前所未有的分析能力。该方案的稳健设计和可重复的效果使其在优化靶向神经调控疗法和推进我们对周围刺激反应回路层面可塑性的理解方面尤为重要。

Introduction

电针是传统针灸的现代改良，通过针头在特定穴位施加控制电流，因其调节参与疼痛处理、运动控制和自主神经功能的神经回路而闻名。其效应被认为涉及由周围感觉神经激活（主要是Aδ纤维和C纤维）激活的复杂信号级联反应，导致神经递质释放（如阿片类药物、血清素、GABA），并随后在脊髓、脑干和皮层进行^调节。涉及的关键结构包括体感皮层。在处理触觉和伤害感受信息的S1皮层中，EA可能影响局部抑制-兴奋平衡和远程连接性^3,4。然而，^{由于上述方法}学限制，不同神经元群体（如锥体神经元、中间神经元）及S1内部层的激活/抑制精确时间序列仍未被充分绘制，原因在于前述方法学限制^5,6。理解这些实时动态对于优化EA参数和预测治疗效果至关重要。

传统的方法如行为研究和尸检分析，用于研究EA（电针）对皮层回路的神经调节效应，提供了宝贵见解，但无法以高时^{空分辨率捕捉}实时神经活动^7,8。为克服这些限制，体内双光子钙成像成为一种强大的替代方案，使得刺激^8,9期间神经集合动态的直接可视化成为可能。该技术为慢性纵向研究提供了无与伦比的优势，使研究人员能够以细胞分辨率观察清醒、行为正常动物皮层层间快速且分布的活动。与急性电生理学提供高时间分辨率但空间覆盖有限不同，双光子成像能够在定义^的视场内同时大规模监测数百到数千个神经^元。此外，与功能性磁共振成像（fMRI）相比，fMRI在全脑覆盖方面表现优异，但工作时间较慢且缺乏细胞特异性，双光子钙成像能在与突触和回路层面过程相关的时间尺度内，细粒度地检测特定神经元群体的活动 ^11,12.因此，双光子成像在我们理解外围EA刺激如何转化为时空精确皮层激活模式方面，尤其是在初级体感皮层（S1）等区域，具有独特优势。作为体感处理（包括穴位信号）的主要枢纽，且EA能强力调节其活性，S1是研究电针引发皮层回路动力学的战略门户。

双光子激光扫描显微镜（2PLSM）结合基因编码钙指示剂（GECIs），如GCaMP6，代表了神经科学领域的革命性工具。它能够实现体内 神经活动的 慢性高分辨率成像，具有细胞和亚细胞特异性¹³。GECIs的荧光与细胞内钙瞬变成正比，是神经元放电的可靠代理指标¹⁴。关键是，2PLSM采用近红外激发光，相比传统显微镜，具有更优越的深度穿透力（数百微米），使得能够可视化表层甚至更深层皮层（如L2/3、L4、L5）的活动。其固有的光学剖面功能最大限度地减少了失焦荧光和光损伤，非常适合在^15、16、17周或数月内进行纵向研究。该技术代表了EA研究的革命性进展，有潜力从根本上改变我们对其的理解，能够在刺激期间同时追踪数百到数千个神经元在定义皮层体积内毫秒尺度的动态。

Protocol

所有实验均使用8至12周龄的转基因Thy1-GCaMP6f小鼠¹⁸。所有实验程序和动物护理方案均依据美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》进行，并获得华中科技大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准;方案批准号：3603）。尽一切努力减少动物数量及其痛苦。实验装置示意图见 图1。

1. 慢性颅窗植入

1. 麻醉诱导与立体定向稳定
   1. 通过将8-12周大的Thy1-GCaMP6f小鼠放入一个引入4-5%异氟醚（体积/体积）的诱导舱，100%医用级氧气，流量为1升/分钟，开始麻醉。
   2. 当恢复反射丧失（通常在2-3分钟内），将动物转移到集成在数字立体框架中的恒温加热垫（保持37°C）上。
   3. 使用鼻锥固定小鼠，施送1.5-2.0%异氟醚进行手术维护。在双眼涂抹眼药膏（如Puralube兽医软膏）以防止角膜干燥。
   4. 小心地将非创伤性耳杆插入外耳道，确保对称位置，避免过度压力导致组织损伤或鼓膜^破裂。
   5. 用鼻夹固定上颌腭，避免气道阻塞。
   6. 通过无脚踏撤退反射确认深部麻醉，且呼吸频率稳定且缓慢（80-120次呼吸/分钟）。通过直肠探头持续监测核心体温，并相应调整加热垫。
   7. 先施以皮下止痛（如卡洛芬，5 mg/kg）和液体支持（无菌生理盐水，0.5-1 mL s.c.）。在整个设置过程中，确保生理参数稳定（SpO₂>95%，呼吸规律）。
2. 颅骨手术暴露
   1. 用电动剪仔细剃净背部头皮，然后涂抹化学脱毛膏，彻底脱毛。用无菌生理盐水彻底冲洗。
   2. 进行顺序消毒：对暴露皮肤刷洗三次，交替使用聚维酮碘（10%）和70%异丙醇棉签，最后用氯己定葡萄糖酸盐溶液（2%）完成。
   3. 使用无菌微解剖剪刀和细镊子（Dumont #5），在皮肤及下方结缔组织中线矢状切口（约15-20毫米），从眼睛后方~2毫米处开始，延伸至顶枕间交界处。
   4. 使用微型止血产钳或双极电灼（低档）控制切口边缘的毛细血管出血。使用弯曲微型牵开器或固定在周围布帘上的5-0丝线，轻柔地侧向拉开皮肤瓣。
   5. 露出整个背侧颅骨，包括额骨、顶骨和顶骨之间骨。使用微型吸牙器（#00），在高倍率（外科显微镜）下仔细刮除骨膜——一种附着于骨表面的纤维血管膜。
   6. 轻柔且切线的划线，避免划伤头骨或损伤缝线（bregma缝线、λ缝线、矢状缝线、冠线缝合线）。实现光滑无骨的骨面，这对于精准开颅术和后续粘接至关重要。
   7. 经常用无菌、温热（37°C）0.9%生理盐水冲洗田地，以去除骨尘并保持组织水分。
3. S1后肢区域的立体定位
   1. 使用高精度立体定位机械臂，将细小外科笔或微钻头的尖端直接放置在解剖参考点bregma（冠状缝与矢状缝的交汇处）上。在显微镜下确认坐标（10倍）。
   2. 调整作器，使标记相对于中线（矢状缝）精确地向前后移动（AP）-1.5毫米（后方）和中外侧（ML）+2.0毫米（右半球）。
      注意：该位置对应于初级体感皮层（S1）后肢表征区（S1HL）。
   3. 在此坐标处轻轻刻一个小十字准星（<0.5毫米）在暴露的顶骨表面，确保可见性且不穿透骨头。
   4. 确认标记部位是否存在主要表面血管;如果存在较多血管，应最小调整ML坐标（±0.1-0.2毫米）以避免出现，因为硬膜血管破裂时可能大量出血，影响光学清晰度。
   5. 记录最终调整后的坐标。
4. 精确开颅手术
   1. 将无菌一次性3毫米直径活检冲头精确对准标记的S1HL坐标。在轻柔旋转拳头的同时，施加坚定、稳定的向下压力，使外皮层骨层完全沿着周边划出痕迹。把冲孔器拿掉。
   2. 使用高速显外科钻头（例如0.5-0.8毫米碳化物磨盘）连接到立体定位臂，持续0.9%盐水冲洗（冷却并清除杂物），仔细细化划痕圈内的骨骼。
   3. 用轻柔、切向的铣削动作，从边缘向中心有条不紊地进行短时间的扫射。在放大镜下密切监测骨骼半透明度。
   4. 一旦观察到下方硬膜出现细微的“发红”现象，即骨厚最小（<50微米），立即停止钻孔。改用细微镊子（Dumont #5/45）和微剪刀，从中心放射状向外细致地提起并剥离剩余的薄骨碎片。
   5. 保持硬膜完整——确保它看起来半透明且有光泽，没有撕裂或大量出血。立即通过用浸泡0.9%盐水或凝血酶的无菌压缩泡沫软膏轻微施压控制轻微硬膜出血。
   6. 大量用温热无菌的人工脑脊液（aCSF）或0.9%生理盐水冲洗暴露的硬膜，以清除所有骨质。避免干旱^17,20。
5. 慢性颅窗植入与头部固定
   1. 准备一个直径3毫米、厚度#1（约150微米）的无菌圆形玻璃封套。可选地在内表面涂覆一层薄硅橡胶，以提高光学清晰度和减少粘附力。
   2. 用细小的镊子精确地将盖膜覆盖在开颅部位。按照制造商说明准备一种快速固化、光固化的牙科胶水（例如Metabond或Charisma）。
   3. 快速工作（<90秒工作时间），在盖片周边直接涂抹一颗薄水泥珠，直接涂抹在干燥干净的头骨表面上。确保水泥能完全密封盖滑边缘，但不会渗到硬膜下方。
   4. 立即用牙科固化灯（蓝光，450纳米）固化水泥，每个象限20-30秒。用多层较慢固化的5毫升自固化丙烯酸牙科胶（如Jet Repair丙烯酸或Paladur）加固密封，形成坚固、低矮（<2毫米高）的水泥盖，延伸数毫米超出开颅边缘，覆盖周围颅骨。
   5. 在水泥盖初期固化阶段，将轻量化、定制的不锈钢或钛合金头杆（例如，长15-20毫米，中央开口）嵌入其中。
   6. 确保头杆与矢状缝平行，并置于窗户正中，提供刚性且平衡的固定点，方便未来在显微镜下进行头枕固定，同时不妨碍光学接触。
   7. 让水泥完全固化（≥15分钟）。确认完全止血和窗户清晰度²¹。
6. 术后恢复与监测
   1. 水泥固化后，小心地将老鼠从耳杆和鼻夹中松开。停止使用异氟醚，并给予100%氧气，直到完全恢复自发呼吸。
   2. 术后立即给予盐酸丁丙诺啡（0.05-0.1 mg/kg）以缓解疼痛。将动物转移到预热（30-32°C）、补充氧气、铺有干净纸质垫料的回收舱。
   3. 持续监测，直到恢复胸骨卧姿和完全行走能力（通常30-60分钟）。术后24小时再给卡洛芬（5 mg/kg）第二剂。如有需要，提供温热乳酸林格氏液（1毫升）以补充水分。
   4. 将老鼠单独关在标准笼子中，笼内填充巢材，以防止同笼同伴损坏头部植入物。保持环境条件（22-24°C，湿度40-60%，光暗交替12：12），并可自由获取食物和水凝胶。
   5. 术后7天内，每天至少监测两次小鼠的疼痛/困扰迹象（如驼背姿势、竖立、活动减少、体重减轻>15%）、感染（脓性分泌物、肿胀、发红）、神经功能缺失或头部肌肉松动。
   6. 在开始任何实验性作（影像学或EA）前，应预留至少≥7天的恢复期，以确保急性手术炎症的缓解、恢复正常行为和淋巴清除，以及稳定基线皮层活动。每天称重以追踪恢复^{情况 22}。

2. 电针刺激

1. ST36穴位的精确解剖定位
   1. 根据小鼠后肢已知的解剖标志，针对ST36（“祖三里”）穴位进行定位。插入针头前，触摸胫骨近端前端，以识别胫骨结节——位于膝关节远端、髌韧带插入处的显著骨突起。
   2. 使用细卡尺或无菌标记，测量胫骨结节中心侧侧2毫米（靠近腓骨）和2毫米后尾侧。该位置对应胫骨前肌腹，位于深腓骨神经分支的浅层，靠近胫动脉分叉处。
   3. 如有必要，通过透光确认该部位无主要表层血管。
      注意：准确性至关重要，因为轻微偏差（>0.5毫米）会显著改变S1中被刺激的神经结构及随后的皮层反应。地标识别应由受过培训的人员持续执行，以最大限度减少操作员间的差异^23,24。
      注意：确保针头稳定性的方法包括：（i） 针头插入和固定后，允许小鼠适应并减少初期挣扎。（ii）电针刺激器产生的振动频率（例如2赫兹）本质上幅度较低。此外，所用细针（如Φ0.16毫米）具有足够的刚性，能够有效抵抗这种最小的振动。（iii）在整个实验过程中，操作员持续监控针尖位置。如果观察到动物运动导致显著位移，试验数据将被排除。
2. 无菌针头插入技术
   1. 皮肤消毒后（交替使用70%乙醇和氯己定磨砂），将一根无菌一次性不锈钢针灸针（标称直径：0.18毫米，相当于36号针;长度：13毫米）垂直插入标记的ST36坐标处的皮肤。
   2. 针头通过皮肤、皮下组织，并以平滑的旋转动作，稳稳地进入下方胫前肌，以减少组织创伤。
      注意：目标插入深度距离皮肤表面3毫米。这种深度确保了II/III型肌肉传入肌（Aδ纤维）及潜在体细胞小直径纤维的最佳结合，同时避免接触到下方胫骨或深层神经血管束。
   3. 用小型无菌胶垫或定制夹紧针头中心，防止后续电刺激时移位或肢体轻微动作。
   4. 通过观察插入时局部肌肉轻微且短暂的肌束颤动，确认针头位置稳定——这是正确肌内位置的生理指标。
   5. 始终保持严格的无菌技术以防止感染，尤其是在慢性刺激模式下²³。
3. 电针刺激参数化与施法
   1. 将插入针头的绝缘手柄连接到可编程电针刺激器的阳极（+）输出通道（例如，HANS穴位神经刺激器，型号LH202）。
   2. 将参考阴极（-）电极，通常是涂有导电凝胶的小型不锈钢板或夹电极，放置在同侧后爪（例如脚跟附近的足底面）。
   3. 确保两站均保持安全接触和低阻抗（<5 kΩ）。将刺激器编程为发送双相方波脉冲（平衡的正负相），以最大限度减少电极极化和组织损伤。
   4. 将刺激模式设置为 密集-扩散模式：交替以2 Hz（低频）爆发3秒，随后以100 Hz（高频）爆发3秒。
      注意：这种组合频率模式（通常记为2/100 Hz）已被实证证明能比单一频率更有效地增强中枢神经系统内的内源性阿片类药物（如β内啡肽、脑内啡肽）和单胺类胺类药物（如血清素、去甲肾上腺素）的释放。
   5. 从0.1 mA开始，逐步调整 当前强度 ，直到观察到轻微、有节奏的爪子抽搐（手指或脚踝屈曲）——在轻微麻醉下成年小鼠通常达到1.0 mA左右。该抽搐阈值表明运动传出肌及相关大直径传入肌（Aβ纤维）的招募充足，确认生理激活且不引起痛苦或剧烈挣扎。在20分钟的刺激过程中保持这种校准强度，^25、26。
4. 关键的程序控制与生理监测
   1. 刺激伪影缓解
      1. 物理上将EA线缆与成像设备/主机分开。
      2. 实施强有力的接地：将刺激器的接地端子连接到专用的接地，并确保显微镜框架和动物加热垫共用一个接地点。
      3. 如果有，可以时序同步刺激脉冲与显微镜的消隐信号，或采用事后信号处理去除钙痕迹中的残留电伪影。
   2. 生理稳定性
      1. 在20分钟的EA训练中，持续监测核心体温（通过反馈控热垫维持在37.0±0.5°C）、呼吸频率（80-120次/分钟）和SpO₂（>95%）。
      2. 在联合成像/刺激期间，维持轻度异氟醚麻醉（1.0-1.5%）以保持活动不动。持续观察诱发的爪子抽搐;如果减弱或停止，检查针头接触和阻抗，并稍微调整强度（≤0.1毫安递增），以保持运动激活的稳定和温和。
      3. 如果出现不适迹象（如呼吸急促、剧烈挣扎），应立即停止刺激。
   3. 可重复性
      1. 所有动物和训练时，使用相同的针头类型、插入深度、刺激器模型和校准方法（爪子抽搐阈值）。记录每个受试者使用的最终刺激强度。
      2. 在终止麻醉或进行额外作前，至少给予5分钟的刺激后恢复时间^27,28。

3. EA期间的双光子成像

1. 动物准备、头部固定和生理维持
   1. 术后恢复期≥7天后，使用植入的头杆在定制设计的减震固定装置内，安装在电动XY台上的头部固定小鼠。
   2. 将动物舒适地放置在低摩擦、空气润滑的圆柱形跑步机上，允许后肢不受限制地活动。通过鼻锥给药，100%氧气中维持轻度外科麻醉，剂量为0.5-0.8%。这种降低的异氟醚水平最大限度地减少了神经活动的抑制，同时确保了足够的不动度以实现高分辨率成像。
   3. 持续监测并记录核心体温（通过反馈控热垫维持在37.0±0.2°C）、呼吸频率（100-140次呼吸/分钟）及周围氧饱和度（SpO₂>95%）。
   4. 在长时间成像过程中涂抹眼科凝胶以防止角膜干燥。确保S1HL颅窗同侧后肢在ST36处可及以便插入EA针。
   5. 在^{开始影像检查}前，头部固定后应预留15-20分钟进行生理稳定。
2. II/III层成像的光学目标与优化
   1. 精确确定获取高质量神经信号的焦平面。请遵循此验证程序。
      1. 将激光功率降至较低水平（通常为成像功率的10-20%，例如5-10毫瓦），以避免平面定位时不必要的光漂白和光损伤。
      2. 利用双光子显微镜的Z轴驱动，物镜以微米步长缓慢移动。从颅窗表面开始，深入脑组织。
      3. 在 实时预览 模式下，按照步骤3.2.1.4和3.2.1.5描述，使用这些视觉指示器识别焦平面。
      4. 对于神经元体质层的正确焦平面：确认图像显示清晰、明亮、点状结构（神经元体形体），呈圆形或椭圆形，背景对比度良好。确保细胞边界清晰，呈现明显的“盐胡椒”色。
      5. 对于焦平面错误：如果图像看起来模糊或均匀且没有明确的点状结构，则要意识到焦点位于无体形区域。如果可以看到大而深色、无结构的血管阴影，应将其识别为血管层。
   2. 验证合适的荧光基线
      1. 在施加任何实验刺激前，确认健康且稳定的荧光基线，以确保后续钙信号（ΔF/F）的有效解读。执行步骤 3.2.2.2-3.2.2.4。
      2. 将激光功率调整到正式成像水平（例如30-50毫瓦）。
      3. 在快速、低分辨率的预览模式下拍摄几秒钟的图像。
      4. 观察实时显示的平均荧光强度（或直接监测图像亮度）。在进行实验数据采集前，确认信号保持稳定且无快速光漂白迹象。
   3. 将成像视野置于颅内窗内。
      1. 在物镜与盖片之间涂抹超声波凝胶或蒸馏水进行浸没耦合。利用红外Dodt梯度对比或上射荧光照明，识别表面血管并调整视场（FOV），以避免大型表面血管（>20微米直径）。
      2. 切换到使用可调飞秒脉冲的Ti：Sapphire激光器进行 双光子激发 模式。将 激发波长 设为920 nm——这对于激发GCaMP6f（峰值~920 nm）最优，同时相比短波长最大限度地减少绿色自发荧光和光损伤。
      3. 逐渐增加激光功率（通常在样品处测量到20-50毫瓦），同时通过透明硬膜聚焦到皮层表面（皮层表面）。利用压电纳米聚焦装置调整物镜的Z位置，达到pial surface下200 ± 10微米深度，对应皮层II/III层。
      4. 通过特征性的神经元密度和形态来确认深度：密集的小型至中型锥体神经元体形体细胞（直径10-15微米），具有可见的顶端树突。
      5. 优化激光功率和光电倍增管（PMT）增益设置，以实现强基线GCaMP6f荧光（F0_），且无不饱和（像素强度~探测器最大值的50-70%），且背景最小^30,31。
         注：成像过程中，920纳米激发光的平均功率在物镜处精确保持在30-50毫瓦。该功率水平通过在接受相同手术程序的动物组织试点实验中得到验证，确保扫描时间长达25分钟的有效信号采集，同时最大限度地减少光损伤和荧光光漂白。
3. 高速钙成像采集协议
   1. 配置谐振扫描器以实现高速帧采集：
      帧大小：512 × 512 像素（典型视角：~450 × 450 微米，像素大小 ~0.88 微米）
      帧率：通过双向扫描实现7帧每秒（fps）（~14 kHz线率）。该速率充分采样GCaMP6f衰变动力学（τ~500毫秒），同时平衡信噪比（SNR）并最小化光漂白。
      像素停留时间：~0.8微秒（针对7 Hz的信噪比优化）。
   2. 使用采集软件（如ScanImage、Prairie View）启动连续延时采集。在EA刺激开始前记录5分钟基线时间，以建立刺激前的神经活动动态（F₀）。
   3. 在t=5分钟时，开始ST36的EA刺激，同时影像不间断。在整个20分钟的EA刺激期间持续获取数据。总扫描时长=25分钟（1500秒，~10,500帧）。
   4. 将数据保存为多TIFF栈或专有二进制格式，内嵌时间戳通过TTL输入通道与EA触发脉冲同步。
   5. 实时监测激光功率稳定性和聚焦漂移（<微米）;只有在出现显著漂移（例如>5微米）时才短暂停以重新聚焦，时间点为^32,33。
4. 严格的运动校正与空间定位
   1. 采集后，使用MATLAB中的NoRMCorre（非刚性运动校正）处理原始成像堆栈，以消除残留微小运动（如呼吸、脉冲）带来的空间伪影。
   2. 首先，将堆叠分割成重叠的空间块（例如，64个×64个像素，重叠度为50%）。对于每个补丁，通过平均基线期的高信噪比帧来计算参考模板。
   3. 利用基于傅里叶的交叉相关，计算相对于模板的每一帧的X-Y平移位移。通过亚像素插值应用这些位移。
   4. 接下来，处理非刚性变形：使用分段仿射变换（平移+剪切）来模拟局部变形。反复更新模板以提高注册准确性。关键参数：
      max_shift：20像素（平行限制）
      max_dev：3像素（最大非刚性偏差）
      bin_width：50帧（模板更新时的分帧）
   5. 通过检查帧间相关图（校正后应稳定在1.0左右）并生成平均图像投影差图（校正前后）来可视化校正效能。将运动修正堆栈保存到后续分析中。这一步对于准确分析钙瞬变（像素层次）至关重要，尤其是在EA引起的细微肢体运动中。

4. 时空动力学分析

该运动校正成像栈通过Python中的Suite2p流水线（v0.12.3）进行神经元自动分割和信号提取。关键处理阶段包括：

1. 空间足迹识别
   1. 应用受限非负矩阵分解（CNMF）将堆叠分解为空间分量。
   2. 使用基于相关性的方法初始化兴趣区域（ROI）：将空间交叉相关为0.7、局部信噪比>为4的像素合并为候选ROI，>为0.7。通过尺寸（8-15微米直径）和环状度（紧凑阈值>0.6）区分体细胞ROI与树突/轴突。
2. 神经电柱污染纠正
   1. 对于每个ROI，定义一个同心神经伞环（内半径：1.5×ROI半径，外半径：2.5×ROI半径）。
   2. 通过最小二乘回归计算神经皮尔系数（r_neuropil）：
      F_corrected（t） = F_raw（t） - 0.7 × F_neuropil（t）
      （系数已在Thy1-GCaMP6f小鼠中实证验证）。
3. 信号解卷积
   1. 利用 OASIS（l₁-正则化卷积）和 AR（2） 噪声模型推断尖峰活动，以估计从 ΔF/F 迹中出现的尖峰概率 S（t）：
      ΔF/F（t） = k ⋅ S（t） + b + ε
      其中“k”是钙瞬态核， ε 是高斯噪声。
4. 质量控制
   1. 排除具有 信噪比<3、 空间重叠>30%或 神经毛细胞相关系数>0.3的投资回报率。可视化验证通过Suite2p GUI³⁴进行。
      具体作和接口元素见 补充文件1。上述动态校正的TIFF文件直接输入Suite2p流水线。虽然 Suite2p 的集成环境包含自己的刚性运动校正，但由于更精确的非刚性修正已被应用，这一冗余的内部步骤被禁用。自动提取的神经元 ROI 可在 补充文件 2 中找到。

Results

S1皮层的结构特征描述及基线神经活动
我们首先建立了高精度的结构和功能基线，用于成像实验。组织形态分析显示，非覆盖型（图2A）和覆盖套装（图2B）颅窗准备之间存在可辨识的结构差异。虽然覆盖套片的应用引入了轻微的压缩伪影（箭头，见图2B），但它有效地保持了关注区域的整体结构完整性（ROI），这对稳定的慢性成像至关重要。随后通过皮层柱进行的两光子z-投射揭示了一个密集的高度分支顶端树突网络，从L2/3层向下延伸至L5层（虚线，见图2C-E）。高分辨率成像质量通过树突状棘的清晰可辨性进一步确认（图2C内嵌），为可靠的功能性钙成像奠定了基础。钙指示剂GCaMP6s（绿色）在超过...

Discussion

为弥补实时观察电针（EA）皮层效应的关键空白，我们提出了一套综合方案，结合了慢性颅窗植入以实现光学访问、标准化EA刺激以及针对初级体感皮层（S1）的纵向双光子钙成像。

该综合方案相较于传统方法在研究EA皮层效应方面具有多项明显优势。首先，它提供了前所未有的时空分辨率，在EA³⁶刺激期间，同时捕捉S1网络中数百个神经元的毫秒级神经活动动态。结合适当标记，这揭示了激活的精确时间序列、活动波的空间分布以及不同神经元亚型间的反应异质性。其次，慢性颅窗支持纵向成像，使研究人员能够追踪S1内皮层表征和回路动态如何随着反复的EA会话而演^变，可能揭示如累积镇痛或运动恢复等治疗效果的机制。第三，遗传编码钙指示剂（GECIs）和遗传靶向所提供的细胞特异性，使得研究不同神经元群体（如兴奋性锥体细胞与特定中间神经元亚型如PV+、SOM+或VIP+）如何被EA³⁸进行差异调控。最后，直接的光学访问实...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
卡普罗芬	MCE	无	5 mg/kg用于镇痛
数字立体定位帧	后驱	科普夫1900型
电针刺激器	HANS LH202（2/100 Hz双相脉冲）	无	HANS LH202（2/100 Hz双相脉冲）
异氟醚	后驱	R510-22-10	医用级，100%氧气载体
微钻系统	后驱		0.5毫米碳化物磨盘，盐水冷却
聚维酮碘	MCE	HY-B2234	10%溶液
扫描影像	扫描影像	https://scanimage.org/
无菌生理盐水	北云天	ST341-500毫升	0.9% NaCl
外科显微镜	蔡司	https://www.zeiss.com/meditec/en/products/surgical-microscopes.html	10-40 多次;放大倍率
Thy1-GCaMP6f转基因小鼠	赛根	5523978	8-12周大，男女
双光子显微镜	尼康 A1MP	尼康 A1MP	钛：蓝宝石激光器（920纳米激发）