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利用生物膜干涉技术研究膜蛋白-抑制剂结合：以TACAN突变体与GsMTx4为模型系统

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DOI：

10.3791/69348

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2026年5月8日

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1Department of Biochemistry and Pharmacology, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 2ARC Centre for Cryo-electron Microscopy of Membrane Proteins, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 3Melbourne Protein Characterization, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne

本文内容

摘要

本文提供了一种详细的实验方案，用于优化并开展生物膜干涉技术（BLI）实验，以研究去垢剂溶解的膜蛋白与其配体之间的相互作用。以TMEM120A M207A突变体与肽类抑制剂GsMTx4的相互作用为模型，该实验流程概述了蛋白制备、生物传感器加载以及动力学数据采集的全过程。

摘要

生物层干涉技术（BLI）是一种高效的生物物理技术，可实现对生物分子相互作用的实时、定量分析。尽管该技术常用于可溶性蛋白质，但由于膜蛋白具有疏水性且依赖去垢剂，将其应用于膜蛋白仍具挑战性。本研究提出了一种优化的BLI实验方案，用于表征去垢剂溶解的膜蛋白与肽类抑制剂之间的相互作用。

以门控调节肽Grammostola mechanotoxin 4（GsMTx4）作为模型系统，测试其对多功能膜蛋白突变体TMEM120A M207A的作用。将带有FLAG标签的TMEM120A变体固定在抗FLAG生物传感器上——该体系基于标签捕获，但无需荧光或酶标记——随后暴露于GsMTx4的系列稀释液中，以测定其结合与解离速率。

该方案结合了使用月桂基麦芽糖新戊二醇（Lauryl Maltose Neopentyl Glycol, LMNG）优化去垢剂的条件，并通过质量光度法和差示扫描荧光法（DSF）进行互补表征。此工作流程可实现可靠的动力学测量，并适用于中等通量筛选。该方法可能适用于其他能够维持去垢剂稳定性的膜蛋白-配体体系。总体而言，本研究强调了影响固定效率和分析物递送的关键参数，支持生物膜层干涉技术（BLI）在膜蛋白相互作用的抑制剂谱型分析和机制研究中的潜在应用价值。

引言

膜蛋白在多种重要的生理过程中发挥核心作用，包括信号转导、离子和代谢物的运输以及膜结构的组织。由于膜蛋白参与细胞间通讯和稳态维持，它们构成了临床药物研发中相当大比例的药物靶点。理解膜蛋白与配体之间的相互作用对于阐明其功能并指导治疗药物的设计至关重要。然而，这些蛋白的两亲性及其对脂质环境的依赖性，给其纯化、稳定以及生物物理表征带来了重大挑战。

表面等离子体共振（SPR）和等温滴定 calorimetry（ITC）是研究膜蛋白-配体相互作用动力学和热力学的常用技术1,2。在适当优化的条件下，这两种方法均可提供详细的定量信息，即使对于去垢剂溶解或重建的膜蛋白也是如此。微尺度热泳（MST）也已成功用于在接近天然条件下评估结合亲和力，尤其适用于膜蛋白³。然而，这些方法可能受到样品消耗量大、维持膜蛋白稳定性困难，或与某些去垢剂体系兼容性有限的限制。

生物层干涉技术（BLI）是一种实时光学技术，可实现对生物分子相互作用的定量检测，包括去垢剂或两性聚合物溶解的膜蛋白参与的相互作用。与前述其他生物物理技术一样，BLI 提供了一个高效平台，能够直接测定结合动力学参数，包括结合速率（kon）、解离速率（koff）和平衡解离常数（KD），且所需样品浓度较低，易于适用于去垢剂或纳米盘（Nanodisc）溶解的膜蛋白。值得注意的是，与其他所有生物物理技术一样，BLI 也存在其自身的局限性，将在讨论部分予以说明。

BLI通过检测从生物传感器尖端反射的白光干涉图样的变化，来反映生物分子结合事件引起的光学厚度改变。这些变化（Δλ，单位为nm）以传感图形式记录，其信号变化与传感器表面结合的分子质量成正比。BLI已广泛应用于蛋白质-蛋白质及蛋白质-配体相互作用研究（包括多肽和小分子），适用于纳摩尔至微摩尔亲和力范围4。由于其灵活性高、样品消耗量低且实验装置相对简单，BLI在研究去垢剂溶解的膜蛋白方面具有潜在优势5,6,7。

本研究提出了一种生物发光成像（BLI）方案，用于表征膜蛋白TMEM120A M207A与肽类抑制剂Grammostola mechanotoxin 4（GsMTx4）之间的相互作用。TMEM120A被认为是一种参与机械性疼痛感知的机械敏感性离子通道8；然而，其离子通道活性仍存在争议。多项研究报道，在HEK293或CHO细胞等异源表达系统中表达TMEM120A时，未检测到机械敏感性电流1,9,10,11。迄今为止，已有四项以上的冷冻电镜（cryo-EM）研究解析了TMEM120A在关闭状态下的结构，但尚未观察到其开放构象1,9,10,11。

分子动力学模拟和电生理学分析表明，野生型人源TMEM120A中的甲硫氨酸207（M207）可能在离子传导通路中起到门控屏障的作用11。将该位点突变为丙氨酸（M207A）已被证明可增加离子通透性，可能是通过改变螺旋堆积并移动苯丙氨酸223等疏水侧链所致。因此，选择M207A突变体用于与GsMTx4的结合研究。

GsMTx4 是一种源自蜘蛛毒液的门控调节肽，可抑制机械敏感性阳离子通道。该肽由32个氨基酸组成，分子量为4至5 kDa，主要通过与脂质双分子层相互作用而非直接阻断孔道来抑制Piezo和TRP等通道12,13。先前的研究表明，GsMTx4可在人工双层膜系统中降低TMEM120A的活性8。在BLI实验中，将TMEM120A M207A突变体固定在抗FLAG生物传感器上，并暴露于浓度递增的GsMTx4中，从而可测定其结合（kon）和解离（koff）速率。

本研究提供了一种利用生物膜干涉技术（BLI）进行去垢剂优化和动力学分析的详细实验方案。尽管BLI存在一些局限性，例如传感器过载或质量传递效应可能导致假象，以及对快速结合速率（kon）相互作用的适用性较低，但它仍是一种在可控的去垢剂增溶条件下研究膜蛋白-配体相互作用的有效方法。该方案适用于中等到低亲和力结合体系（通常在纳摩尔至微摩尔范围内），在采用适当的对照和缓冲条件时，也可推广应用于其他疏水性靶标。

方案

1. 蛋白质纯化与样品优化

  1. 细胞培养与转染
    1. 在无血清培养基中培养 HEK293T/SF17 悬浮细胞，培养基中添加 20 mM L-谷氨酰胺，在摇床培养箱中设置转速为 120 RPM、温度 37 °C、湿度 80%、CO₂ 浓度 8% 的条件下培养。传代次数不超过五代，维持细胞密度至约 5 × 10⁶ 个细胞/mL。
    2. 使用商品化转染试剂，按照生产商说明书，将 TMEM120A M207A 质粒（N 端 FLAG-连接子-3C-连接子-TMEM120A M207A）转入细胞，该质粒构建于 pCDNA3.1 载体中（参见材料表）。
    3. 在 4 °C 条件下，以 5,000 × g 离心 15 分钟，收集转染后的细胞沉淀。将细胞沉淀储存于 -80 °C，待后续纯化使用。
  2. 细胞裂解与溶解（图 1）
    1. 将 30 mL 细胞沉淀重悬于溶解缓冲液中，缓冲液组成为：100 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH 7.8；300 mM NaCl；0.5%（w/v）或 4.98 mM 新戊二醇月桂基麦芽糖苷（LMNG）；1× 蛋白酶抑制剂混合物；50 µg DNase I；10%（v/v）甘油。
    2. 在冰上进行超声破碎，设置振幅为 25%，采用 20 秒开启、20 秒关闭的脉冲模式，持续 15 分钟，以防止样品过热。
    3. 在 4 °C 条件下，以 25,800 × g 离心 45 分钟，澄清裂解液。
  3. 使用抗 FLAG 树脂进行亲和纯化
    1. 使用平衡缓冲液对抗 FLAG M2 树脂进行平衡，缓冲液组成为：25 mM HEPES，pH 7.8；200 mM NaCl；0.05%（w/v）或 0.4975 mM LMNG；10%（v/v）甘油。
    2. 将澄清后的上清液与已平衡的树脂在 4 °C 条件下于摇床上孵育 2 小时。
    3. 使用洗涤缓冲液（含 25 mM HEPES，pH 7.8；150 mM NaCl；0.05%（w/v）或 0.4975 mM LMNG；10%（v/v）甘油）洗涤树脂两次。
    4. 使用洗脱缓冲液（含 25 mM HEPES，pH 7.8；400 mM NaCl；0.001%（w/v）或 0.00995 mM LMNG；10%（v/v）甘油；200 µg/mL FLAG 肽段）洗脱结合的蛋白。
  4. 浓缩与尺寸排阻色谱（SEC）
    1. 使用截留分子量为 30 kDa 的离心过滤装置，将洗脱蛋白浓缩至约 500 µL。
    2. 使用已用 25 mM HEPES（pH 7.8）、200 mM NaCl、0.00015%（w/v）或 0.00149 mM LMNG 平衡的尺寸排阻色谱柱进行 SEC 分离。
    3. 收集并合并对应于目标蛋白的峰组分。
    4. 将合并的组分浓缩至终浓度约 3 mg/mL。亲和纯化后，通过 SDS-PAGE 确认 TMEM120A M207A 蛋白单体在电泳图谱中迁移至约 43 kDa 处（图 2A）。进行 SEC 时，确认在 LMNG 条件下纯化的蛋白呈现单一、均一的洗脱峰，对应分子量约 150 kDa，代表 TMEM120A M207A 二聚体与 LMNG 去垢剂胶束的复合物（图 2B）。
      注意：有时单体蛋白条带可能出现在约 50 kDa 处，这在去垢剂溶解的膜蛋白中较为常见，因为膜蛋白样品通常不进行煮沸处理。

2. 采用纳米差示扫描荧光法（NanoDSF）进行热稳定性分析

  1. 将纯化的 TMEM120A M207A 蛋白用 SEC 缓冲液（25 mM HEPES，pH 7.8，200 mM NaCl，0.00015% LMNG）稀释至 0.15 mg/mL。
  2. 将每个样品的 10 µL 加入高灵敏度毛细管中。
  3. 在 NanoDSF 仪器上运行热位移实验，温度梯度设置为从 25 °C 升至 90 °C。
  4. 使用配套软件设置实验并进行自动化分析。
  5. 确认出现单一的热转变（Tm）曲线，表明发生协同性解折叠事件（图 3）。

3. 用于确定寡聚状态的质量光度法

  1. 将样品用SEC缓冲液（25 mM HEPES，pH 7.8，200 mM NaCl，0.00015% LMNG）稀释至80 nM。
  2. 将样品置于预先清洁的适用于质量光度测定的载玻片上。
  3. 使用标准设置采集数据，并利用蛋白质标准品进行校准。
  4. 使用分析软件处理数据，生成质量分布直方图（图4A-C）。

4. 生物层干涉测量法（BLI）实验方案

注意：本实验方案描述了一种BLI动力学检测方法，旨在研究FLAG标签的TMEM120A M207A与配体（如GsMTx4）之间的相互作用，采用384孔微孔板格式进行。尽管该方法是为TMEM120A设计的，但其操作流程可适用于其他膜蛋白。所有实验均使用基于光学干涉技术的检测平台，并采用FLAG生物传感器探针固定带有FLAG标签的TMEM120A M207A蛋白。实验使用黑色384孔微孔板，缓冲液为优化后的尺寸排阻色谱（SEC）缓冲液，包含25 mM HEPES、200 mM NaCl、0.00015%（w/v）LMNG和0.0005% Tween-20，pH值为7.8。添加Tween-20以尽量减少非特异性结合。蛋白浓度保持在250 nM，所有检测均设置重复孔以确保结果可重复性。

  1. 实验方案设计的注意事项
    1. 温度平衡
      1. 在开始BLI实验之前，将所有实验组分（包括缓冲液、样品和生物传感器探针）平衡至室温（约20–25 °C）。在数据采集过程中，将实验温度维持在30 °C，该温度推荐用于动力学分析，以优化蛋白质稳定性、配体结合能力及实验重复性。
        注意：此平衡步骤可确保动力学曲线的一致性，并最大限度减少实验过程中因温度波动引起的假象。在开始检测前，应留出足够时间（至少10–15分钟），使所有试剂和生物传感器达到热平衡。
    2. 传感器的水合与再生
      1. 在使用前，将新的 FLAG 生物传感器置于 Max 板中，用 250 µL 与 BLI 兼容的缓冲液（含 25 mM HEPES、200 mM NaCl、0.00015% w/v LMNG 和 0.0005% Tween-20，pH 7.8 的 SEC 缓冲液）水合，时间不少于 10 分钟。
        注意：使用洁净无尘的镊子小心操作生物传感器，避免污染，以免干扰信号采集并导致结果不一致。如需重复使用传感器，可使用Q缓冲液（0.3 M甘氨酸，pH 3.8）进行再生。适当的水合与再生对维持传感器性能和可重复性至关重要，尤其是在处理去垢剂溶解的膜蛋白时，此类蛋白对环境条件较为敏感。
    3. 缓冲液操作
      1. 加样时避免产生气泡，因为气泡可能干扰光学信号的采集。
    4. 缓冲液组成与一致性
      1. 使用可最大限度减少非特异性相互作用同时保持蛋白质功能的缓冲液。对于TMEM120A M207A，配制含有25 mM HEPES、200 mM NaCl、0.00015% (w/v) LMNG、0.0005% (w/v) Tween 20、pH 7.8的缓冲液。
    5. 蛋白质固定化
      1. 优化配体加载以达到50-80%的传感器饱和度。使用250 nM的固定蛋白浓度，典型的加载时间约为120 s。将250 nM的FLAG标签TMEM120A M207A蛋白加载至生物传感器上120 s，以实现50-80%的饱和度。
      2. 确认生物传感器信号达到 50 - 80% 最大结合容量在上样阶段。
        注意：信号 低于50% 可能表明蛋白质固定不足，而信号 高于80% 可能引入传质限制或空间位阻，从而影响动力学测量的准确性。
      3. 为评估潜在的质量传递效应，需进行对照实验：在保持分析物浓度恒定（如 100 nM GsMTx4）的同时，改变 FLAG 生物传感器上 TMEM120A-M207A 的负载水平（补充图 S1).
        注意：后续动力学测量——包括结合、解离、全局结合拟合以及k值的测定在 和 k关闭与主实验中获得的结果无显著差异。该结果表明，TMEM120A 在 50-80% 范围内的加样量对结果无显著影响。 不 引入显著的质量传递伪影，证实生物传感器的负载水平适用于可靠的动力学分析。
    6. KD 估计
      1. 测定结合亲和力（KD通过检测0 µM、5 µM、10 µM、20 µM、30 µM、50 µM和100 µM的分析物（GsMTx4）浓度。
    7. 背景信号对照
      1. 设置适当的对照，以准确扣除背景信号并确保动力学测量的可靠性。
      2. 使用参考FLAG探针以校正检测过程中可能出现的非特异性结合或信号漂移。
        注意：该参比探针不应固定目标蛋白，用于提供基线以校正含样品探针所获得的信号。
      3. 从样品信号中减去参考信号，以仅分析带 FLAG 标签的 TMEM120A M207A 与分析物之间的特异性相互作用。
        注意：验证参考 FLAG 探针在整个检测过程中信号是否最低。稳定且低的基线表明非特异性结合可忽略不计。如果参考信号出现波动或升高，应在进行动力学分析之前重新评估缓冲液组成、探针操作或样品制备，以减少非特异性相互作用。
  2. 动力学分析中基本检测参数的设置
    1. 设置 数据采集频率 至5 Hz，以每秒采集5个数据点（推荐用于所有动力学检测）。
    2. 选择 384孔板 作为板式格式。
    3. 设置 摇床转速 到 1,000 转/分钟 以及 温度 在室温与 30 °C 之间（30 °C 用于本实验以获得最佳动力学结果）。
  3. 配置平板设置。
    1. 导航至 培养板设置 为384孔板和Max板设置并定义清晰的孔位分配。
    2. 在384孔板上指定孔的功能。
      注意：384孔板和Max板所使用的符号和注释总结如下 补充表 S1.
      1. 根据功能标记各孔：缓冲液、蛋白质（上样）、配体（样品）。
      2. 用浓度标注蛋白质加样孔（例如，250 nM），用于动力学测定。
        ​注意：准确标记对于计算 k 至关重要开启 和 KD （参见 补充图 S2A).
    3. 配置 Max 检测板板图（探针板）。
      1. 将生物传感器探针分配至相应的孔中。
      2. 如果计划进行探针再生，请为再生缓冲液和中和缓冲液分配相应的孔位。在软件中明确标记这些孔，以确保再生过程中自动化操作的准确性（参见 补充表 S2).
        注意：检测缓冲液包含25 mM HEPES（pH 7.8）、200 mM NaCl、0.00015%（w/v）LMNG和0.0005%（v/v）Tween-20。抗FLAG生物传感器探针的再生步骤使用含0.3%甘氨酸（pH 3.8）的Q缓冲液进行，随后用检测缓冲液（25 mM HEPES、200 mM NaCl、0.00015% LMNG和0.0005% Tween-20，pH 7.8）进行中和步骤。
  4. 选择 检测步骤 表格
    1. 导航至 检测步骤 切换至配置动力学检测工作流程。指定每个检测阶段的孔位，包括基线期、蛋白加载期、结合期和解离期（参见 补充图 S3).
    2. 选择合适的 步骤类型 从下拉菜单中选择。确保正确标注结合与解离步骤，以进行准确的动力学分析。
    3. 输入每一步的持续时间（单位：秒）以定义 曝光时间 在所有相互作用阶段。
      1. 设置基线步长时间，以便在上样蛋白前使传感器达到平衡状态（60 s).
      2. 设定蛋白上样步骤的时间，以实现所需的配体固定化水平（60 秒) (图5).
      3. 设置结合步骤的持续时间，以确保分析物充分结合（300 s) (图5).
      4. 将解离步骤的持续时间设置为足以充分捕捉分析物解离动力学的时长（600 s) (图5).
    4. 为每一步骤设置摇床转速（RPM），以保持一致的混合效果并获得最佳数据质量（1,000 转/分钟).
  5. 对齐与过滤步骤（参见 补充图 S4 和 补充图 S5)
    1. 根据需要调整数据范围，对原始数据进行校正，以去除动力学步骤中的伪影。
    2. 为对齐Y轴，选择在结合步骤开始时对数据进行对齐 关联 在……下方 对齐步进类型 并激活 开始 选项
    3. 启用 步间校正 在标准动力学检测中保持各步骤间连续性的选项。
    4. 过滤：应用数据平滑以降低信号噪声，同时不扭曲趋势。选择 已处理 将平滑处理后的数据与原始信号进行比较。
  6. 设置参考步骤（参见 补充图 S6).
    1. 通过选择参考探针并点击来指定参考探针 参考探针 按钮。
    2. 通过单击样本探针对应的列编号来选择样本探针。
    3. 要定义减法函数，请打开 公式编辑器，点击 编辑公式，并定义 减法 用于去除背景的功能。
    4. 综述 表格视图 以确认参考信号扣除已正确应用。
  7. 结合拟合步骤
    1. 导航至 拟合 标签并定义分析参数（补充图 S7).
    2. 数据选择：局部动力学拟合时需包含结合相和解离相。若数据曲线拟合效果差或信号波动异常，应手动剔除异常值。
    3. 结合模型选择：除非观察到复杂行为，否则选择1:1结合模型拟合数据。通过审查曲线叠加图和残差图来验证模型的适用性。
    4. 拟合策略：根据数据质量和实验目标，从以下拟合策略中选择一种：
      1. 局部拟合：对每种分析物浓度分别进行拟合，可独立评估结合与解离动力学。
      2. 全局拟合：使用同一组动力学参数同时拟合所有分析物浓度，为数据集提供整体模型。
      3. 完整：在所有浓度下对结合相和解离相进行全局拟合。
      4. 部分拟合：仅拟合结合相，忽略解离相。
        注意：BLI 数据采用局部全拟合的 1:1 Langmuir 结合模型进行分析。局部拟合确保每个分析物浓度被独立处理，从而准确反映结合动力学，同时减少解离阶段因异质性引起的假象。该方法可避免在信号多变或不稳定区域出现过拟合，从而更可靠地估算动力学参数（k在 和 k关闭) (表1 和 表2).
  8. 动力学分析
    1. 拟合曲线与残差的评估：检查拟合曲线及其对应的残差，以评估模型的质量与有效性。确认残差在零附近随机分布，无系统性偏差（参见 图4E 用于代表性的残差。
    2. 排除拟合不佳的数据：去除表现出平坦、嘈杂或其它不可靠信号的分析物浓度，以提高整体模型的准确性。
      注意：例如，由于10 µM浓度的数据与5 µM数据集重叠，可能影响动力学参数估计的准确性，因此在拟合过程中被排除（参见 图6A，B).

结果

使用编码N端FLAG标签的pCDNA3.1载体在HEK293SF-17悬浮细胞中表达TMEM120 M207A突变体图1。通过瞬时转染实现重组蛋白的表达。细胞收获后，膜蛋白在0.5%新戊二醇月桂基麦芽糖苷（LMNG）中溶解，该非离子型去污剂适用于维持膜蛋白的可溶性。

将可溶性组分通过抗FLAG M2树脂进行亲和纯化。用含有0.01% LMNG的缓冲液洗涤树脂，以去除非特异性结合的蛋白质，随后在含有0.001% LMNG的缓冲液中洗脱TMEM120 M207A蛋白。使用截留分子量为30 kDa或100 kDa的离心过滤器（根据样品得率选择）对洗脱液进行浓缩。进一步采用尺寸排阻色谱法（SEC）进行纯化。最终的SEC步骤在含有0.00015% LMNG的缓冲液中进行，获得单一分散的洗脱峰，表明蛋白样品均一且稳定，适用于后续的结构与功能分析（图2B）。

FLAG标签TMEM120 M207A的优化表达与生物物理表征总结见图2。通过SDS-PAGE验证了蛋白的表达与纯化，结果显示在约50 kDa处出现单一蛋白条带。该条带的迁移位置略高于单体形式的预期分子量（图2A），可能是由于电泳前样品未煮沸所致。SEC色谱图显示一个单一且对称的洗脱峰，其洗脱体积对应于在0.00015% (w/v) LMNG条件下表观分子质量约为150 kDa（图2B），与TMEM120A M207A在LMNG去垢剂胶束中形成二聚体的结果一致。该洗脱行为表明蛋白样品均一且单分散，适用于后续的生物物理表征。

在实验缓冲条件下，使用质量光度法分析了LMNG的去垢剂胶束特性。在不含蛋白质的情况下，于不同浓度LMNG的SEC缓冲液中进行测量，以评估去垢剂胶束对表观分子质量的贡献。在0.001% (w/v) LMNG（高于临界胶束浓度，CMC）条件下，主要峰出现在约69 kDa，对应于仅含LMNG胶束而无任何结合蛋白的组分(图4A)。当LMNG浓度降低至0.0001% (w/v)（低于CMC）时，主要物种迁移至约48 kDa，表明存在较小的残余LMNG聚集体或无蛋白的亚胶束结构（图4B）。进一步地（图4C），将TMEM120A M207A稀释至含不同浓度LMNG的SEC缓冲液中，通过质量光度法评估其寡聚状态。在0.00001% LMNG（约低于CMC的20倍，品红色）条件下，观察到主要峰位于约42 kDa，对应于TMEM120A M207A的单体形式。在0.00015% LMNG（约低于CMC的10倍，蓝色）条件下，主群体位于约86 kDa，表明存在二聚体。当LMNG浓度增加至0.001%（约高于CMC的2倍，橙色）时，主要物种约为150 kDa，与蛋白-去垢剂复合物一致。在0.002% LMNG（约高于CMC的4倍，绿色）条件下，检测到一个中心位于约180 kDa的宽分布，代表更大的胶束相关组装体或高阶寡聚物。这些结果表明，SEC缓冲液中的LMNG浓度显著影响TMEM120A M207A的表观寡聚状态：在CMC以下观察到单体-二聚体平衡，而在CMC以上则以去垢剂-蛋白复合物形成为主。

通过热变性分析评估了从主SEC峰收集并保存在SEC缓冲液（25 mM HEPES、200 mM NaCl、0.00015% (w/v) LMNG，pH 7.8）中的TMEM120A M207A的热力学稳定性。该蛋白在约46 °C时出现拐点，对应其在此去垢剂溶解条件下的熔解温度（Tm）。该Tm值表明其具有中等的热稳定性，提示TMEM120A M207A在LMNG胶束中保持了正确折叠的构象，但在较高温度下可能开始发生去折叠或聚集。

生物层干涉技术（BLI）显示TMEM120A M207A与GsMTx4T的结合亲和力为微摩尔（µM）级别。图5中的曲线展示了五个实验步骤：（1）基线期，（2）TMEM120A M207A样品负载，（3）基线期以去除非特异性结合及过量的TMEM120A M207A，（4）结合期，以及（5）解离期。随着GsMTx4浓度（0、5、10、20、30、50和100 µM）递增，检测与固定化的TMEM120A M207A相互作用时波长偏移（nm）随时间的变化情况。

在初始基线阶段（步骤1），信号保持稳定，证实传感器在缓冲液中已达到平衡状态。TMEM120A M207A的加载（步骤2）导致信号出现特征性上升，对应于各个传感器上约50-80%的探针饱和度。加载阶段的响应曲线呈轻微弯曲而非急剧达到平台期，可能反映了部分质量传递受限，即TMEM120A M207A向传感器表面的扩散速度慢于其结合速率——这种效应在膜蛋白或去垢剂溶解的蛋白质中较为常见，可能影响表观表面覆盖率。

随后的基线步骤（步骤3）有效去除了未结合或松散附着的TMEM120A M207A。在结合阶段（步骤4），随着GsMTx4浓度的增加，波长偏移呈现出明显且浓度依赖性的上升。在解离阶段（步骤5），将生物传感器置于含有LMNG的SEC缓冲液中，其浓度约为临界胶束浓度（CMC）的1/10。解离最初5-10秒内信号迅速下降，可能代表GsMTx4从易于接近的位点快速释放；随后为较缓慢的信号衰减，可能反映了更为稳定的TMEM120A M207A-GsMTx4复合物，其具有较慢的解离动力学。参照探针信号在整个实验过程中保持平稳，表明非特异性结合极小。总体而言，这些数据证明了TMEM120A M207A与GsMTx4之间存在特异性相互作用；然而，由于去垢剂环境及潜在的质量传递效应，所观察到的动力学参数应谨慎解读。

参考探针扣除后处理数据的结合与解离传感图（图6A）显示，GsMTx4在5–100 µM浓度范围内呈现浓度依赖性响应。随着配体浓度增加，波长偏移逐渐增大，随后在200秒的解离阶段中缓慢逐步降低。由于10 µM数据点与5 µM曲线存在重叠，因此在拟合中被排除，这提高了整体模型的质量。

采用1:1 Langmuir结合-解离模型并结合局部全拟合策略进行动力学分析，其中各个分析物浓度在共享的动力学框架内独立拟合（图6B）。拟合曲线（红色）与实验轨迹吻合良好，得到的解离常数（KD）处于低微摩尔浓度范围。残差分析（图6C）未发现显著的系统性偏差，表明所采用的模型适用于该数据集。在结合初期观察到的微小差异可能反映了质量传递的限制或去垢剂胶束环境的影响。多个检测重复实验和探针位置的拟合结合与解离曲线、残差图以及拟合统计结果的其他示例见补充图S8。

在原始数据中（图5），解离的最初5-10秒内信号迅速下降，可能代表GsMTx4从易于接近的位点快速解离；随后的缓慢衰减可能反映了更稳定的TMEM120A M207A-GsMTx4复合物，其具有较慢的解离动力学。因此，在表2中，拟合时去除了解离过程的前100秒数据。无系统性偏差表明，在所有测试浓度下，局部全局拟合的Langmuir 1:1模型对TMEM120A M207A的拟合效果良好（图7）。

对GsMTx4与TMEM120A M207A结合的动力学分析显示，在5–100 µM配体浓度范围内，其结合与解离行为呈浓度依赖性（表1）。观察到的结合速率常数（kon）随GsMTx4浓度升高而略有增加，范围约为1.0 × 10⁻⁶ 至 3.2 × 10-6 1/M·s；而估算的解离速率常数（koff）在实验误差范围内接近于零，表明在测试条件下解离过程缓慢或可忽略。计算得到的平衡解离常数（Kd）处于低至中等微摩尔范围（~0.8–3.3 µM），符合中等亲和力的相互作用特征。采用Langmuir 1:1结合模型进行局部全域拟合，在所有GsMTx4浓度下均获得高质量拟合结果，结合相与解离相的相关系数均超过0.99，且相对χ2值较低（表1）。计算所得的平衡解离常数在不同浓度及重复实验间具有一致性，KD值位于低微摩尔范围（~1–2 µM），表明TMEM120A M207A与GsMTx4之间存在中等但特异性的结合。

每个浓度下的重复数据集均显示出良好的可重复性，这体现在结合与解离拟合的高相关系数（R² > 0.99）上。完整χ²值和相对χ²值在各重复之间均较低且相近，进一步支持了分析中所采用的1:1 Langmuir结合模型的稳健性。在较高配体浓度（≥50 µM）下，观察到kon和KD值略有升高，这可能反映了轻微的质量传递效应或局部表面异质性，而非真实的亲和力变化。多个重复实验及探针位置之间的动力学一致性在补充图S9中进一步展示。

动力学谱型表明，GsMTx4 能特异性且稳定地与 TMEM120A M207A 相互作用，形成解离缓慢、具有微摩尔级结合亲和力的相对稳定复合物。

HEK293SF17细胞的基因表达示意图，包含凝胶过滤和纯化过程分析。
图1：在HEK293SF-17悬浮细胞中表达的TMEM120A M207A突变体的纯化流程。 蛋白质纯化过程的示意图。TMEM120A M207A由pCDNA3.1质粒在HEK293SF-17细胞中表达。细胞用含0.5% LMNG的缓冲液溶解，随后使用抗FLAG M2树脂进行亲和层析纯化。用含0.01% LMNG的缓冲液洗涤树脂，以去除非特异性结合的蛋白质。TMEM120A M207A用含0.001% LMNG的缓冲液洗脱。洗脱液使用100 kDa或30 kDa截留分子量滤膜进行浓缩，并在含0.00015% LMNG的缓冲液中通过尺寸排阻色谱进一步纯化。请点击此处查看该图的放大版本。

SDS-PAGE 凝胶和尺寸排阻色谱图；蛋白质分析、分子量、洗脱谱图。
图 2：在 LMNG 去垢剂中纯化的 TMEM120A M207A 的尺寸排阻色谱和 SDS-PAGE（A）通过尺寸排阻色谱纯化的带 FLAG 标签的 TMEM120A M207A 的 SDS-PAGE。第 1 泳道中蛋白质条带出现在约 50 kDa 处，对应预期的单体。（B）纯化的 TMEM120A M207A 在 SEC 缓冲液（25 mM HEPES、200 mM NaCl、0.00015% LMNG，pH 7.8）中使用 SEC 柱进行的 SEC 洗脱谱图。蛋白质的洗脱表明存在主要的单分散组分，适用于后续生物物理检测。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质变性分析、荧光比值、温度梯度图、光谱结果。
图 3：在 LMNG 中纯化的 TMEM120A M207A 的差示扫描荧光分析。 DSF 显示在 46 °C 时出现热力学拐点，表明该蛋白质在测试缓冲条件下的热稳定性。请点击此处查看该图的放大版本。

LMNG 质量分布分析图；蛋白质聚集研究，数据比较，质谱分析。
图 4：使用质量光度法对在 LMNG 去垢剂中纯化的 TMEM120A M207A 进行表征。（A,B）不同 LMNG 浓度的 SEC 缓冲液的质量光度分析。在 0.001% LMNG（高于临界胶束浓度，CMC）时，表观分子量约为 69 kDa，主要对应于 LMNG 胶束。在 0.0001% LMNG（低于 CMC 十倍）时，主峰出现在约 48 kDa。（C）LMNG 浓度依赖性对 TMEM120A 寡聚化影响的质量光度分析。在 0.00001% LMNG（约低于 CMC 20 倍，品红色）中，TMEM120A 主要表现为约 42 kDa 的群体（单体）。在 0.00015% LMNG（约低于 CMC 10 倍，蓝色）中，观察到约 86 kDa 的群体，与二聚体一致。在 0.001% LMNG（约高于 CMC 2 倍，橙色）中，主要物种约为 150 kDa，对应于蛋白-去垢剂复合物。在 0.002% LMNG（约高于 CMC 4 倍，绿色）中，以约 180 kDa 为中心的宽分布表明存在更大的胶束相关组装体或高阶寡聚体。这些结果表明，LMNG 浓度显著影响 TMEM120A 的表观寡聚状态：在 CMC 以下观察到单体-二聚体平衡，而在 CMC 以上则以蛋白-去垢剂复合物形成为主。请点击此处查看该图的放大版本。

M207A与GsMTx4浓度的结合动力学图；时间与位移关系，实验结果。
图5：软件显示的TMEM120A M207A与GsMTx4相互作用的原始数据。 生物层干涉技术表明，TMEM120A（M207A）以微摩尔亲和力结合机械敏感通道抑制剂GsMTx4。该图展示了来自Gator Prime软件的原始BLI响应数据，描绘了五个关键检测阶段：（1）初始基线期，信号保持稳定；（2）蛋白固定（加载），导致波长偏移约增加1.5 nm；（3）第二次基线期，用于去除未结合或松散结合的蛋白；（4）结合期（配体结合），随着GsMTx4浓度升高，在300秒内响应上升至约5.5 nm；（5）解离期（配体释放），在600秒内显示信号逐渐衰减。请点击此处查看该图的放大版本。

SPR 传感器图；不同 GsMTx4 浓度下的蛋白质-配体结合分析。
图 6：TMEM120A M207A 与 GsMTx4 肽的结合动力学。（A）TMEM120A M207A 与 GsMTx4 在五个浓度（5 µM、20 µM、30 µM、50 µM 和 100 µM）下的结合与解离传感器图。由于 10 µM 数据集与 5 µM 曲线重叠，因此未纳入拟合分析，排除后整体模型拟合效果更佳。垂直的红色虚线表示解离阶段的起始和终止时间点。（B）传感器图数据采用局部全拟合的 Langmuir 1:1 结合-解离模型进行拟合。红色曲线代表拟合模型，实验迹线对应于每个 GsMTx4 浓度下测得的结合与解离数据（每种条件两个重复）。（C）残差图显示了实验数据与拟合模型在结合和解离阶段的偏差，验证了模型拟合的优良性。请点击此处查看该图的高清版本。

蛋白质相互作用动力学图；不同浓度GsMTx4与M207A的SPR传感图。
图7：对应于拟合结合曲线的残差图。 每个图显示了单个GsMTx4浓度（5 µM、20 µM、30 µM、50 µM和100 µM）下实验数据与拟合模型之间的残差（即差异）。残差以偏移偏差（nm）对时间（s）作图，在结合和解离阶段均围绕零值随机分布。无系统性偏差表明，局部全拟合Langmuir 1:1模型在所有测试浓度下均能良好拟合TMEM120A M207A的结合数据。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：TMEM120A M207A与GsMTx4结合的动力学参数汇总。 动力学参数通过局部全拟合（Local Full fitting）并采用Langmuir 1:1结合模型获得。针对每个GsMTx4浓度及重复实验，报告了其结合速率常数（kon）、解离速率常数（koff）、观测速率常数（kobs）和平衡解离常数（KD）。通过全相、结合相和解离相的R²和χ²值评估拟合质量。在所有浓度下，拟合结果均显示出高相关系数（R² > 0.99）和低相对χ²值，表明模型性能可靠。注释：M Conc. 表示GsMTx4的浓度（µM）。kobs表示反映结合与解离过程综合效应的观测速率常数。kobs、kon和koff的误差反映了拟合的不确定性。R²值表示全相、结合相和解离相的拟合优度。相对χ²值代表归一化的拟合优度指标，而绝对χ²值表示观测数据与拟合数据之间的残差偏离程度。缩写：kon = 结合速率常数（1/M·s）；koff = 解离速率常数（1/s）；kobs = 观测速率常数（1/s）；KD = 平衡解离常数；Rmax = 最大响应值；Req = 平衡响应值。请点击此处下载该表格。

表2：动力学拟合的处理参数及残差。处理参数：结合起始时间，0 s；结合结束时间，300 s；解离起始时间，100 s；解离结束时间，300 s。最小R²值，0.9；最大χ²值，8。校准步骤：单步结束（索引 = 1，平均值 = 0）。在结合阶段应用了步间校正。结合平均值，50；解离平均值，0。未启用Savitzky-Golay平滑处理。请点击此处下载该表格。

补充图 S1：在固定浓度（100 nM）GsMTx4 肽存在下，将不同浓度的 TMEM120A M207A 蛋白加载至抗 FLAG 探针的优化实验。（A）原始 BLI 传感图，显示动力学测量的五个步骤：（1）在 SEC 缓冲液或检测缓冲液（25 mM HEPES，pH 7.8；200 mM NaCl；0.00015% (w/v) LMNG；0.0005% (v/v) Tween-20）中的基线；（2）将四种不同浓度的 TMEM120A M207A 加载至 FLAG 探针，参考探针（橙色）作为阴性对照，以确认无非特异性结合；（3）第二次基线步骤；（4）结合相；（5）解离相。（B）四种 TMEM120A M207A 浓度与 100 nM GsMTx4 肽相互作用的全局 1:1 结合模型拟合结果。（C）结合相和解离相的残差图，显示与拟合模型的偏差极小（<0.05 nm）。请点击此处下载该文件。

补充图 S2：酶标板设置与检测配置。（A）384 孔板的板设计，可分配不同参数。样品对应不同浓度的配体（GsMTx4）。橙色孔表示含 TMEM120 M207A 蛋白（250 nM）的孔。各孔为 250 nM 蛋白的重复孔，基线、结合及解离步骤均使用相同的缓冲液。（B）Max Plate 视图，显示四个抗 FLAG 生物传感器探针：一个参考探针和三个蛋白重复探针。所有探针均在检测缓冲液中预先润湿，于 Q 缓冲液中再生，并在检测缓冲液中中和。基线、结合和解离步骤全程使用相同的缓冲液。请点击此处下载该文件。

补充图 S3：实验设置循环，包括基线、蛋白加载、第二次基线、结合和解离阶段。 缩写：B = 缓冲液；L = 加载；0、5、10、20、30、50 和 100 = GsMTx4 的浓度（单位为 µM）。请点击此处下载该文件。

补充图 S4：新的动力学（K）分析工作流程。 选择 实验 图标，可查看单次实验中所有检测的概览。请点击此处下载该文件。

补充图 S5：新的动力学（K）分析工作流程。对齐与过滤图标，可在此处查看和分析结合相与解离相的原始数据。请点击此处下载该文件。

补充图 S6：新的动力学（K）分析工作流程。设置参考 图标，用于选择适当的参考传感器，以进行背景扣除和准确的数据解读。请点击此处下载该文件。

补充图 S7：动力学分析工作流程中的结合拟合步骤。 用于分析结合相互作用数据的动力学拟合参数设置。该模型假设为 1:1 相互作用，即单个配体结合位点。拟合类型设置为 局部（Local），即对每条浓度曲线进行独立拟合，而非全局拟合。启用 完整（Full） 拟合选项并开启 完整拼接（Full Stitch） 后，将包含完整的连续结合与解离曲线。结合相和解离相的时间窗口分别设置为 0 至 300 秒和 0 至 200 秒。背景中的结合拟合图、残差图以及各次实验曲线展示了拟合质量与实验变异性。请点击此处下载该文件。

补充图 S8：动力学分析流程中的结合拟合步骤。结合拟合曲线图显示了多个实验重复以及探针位置（C1 和 D1）上的结合与解离相。下方的残差图用于评估拟合质量，残差表示实验数据与拟合模型之间的差异；接近零的数值表明拟合良好。附带的表格总结了各重复样本的拟合统计参数，包括总 R²、结合相 R²、解离相 R² 以及卡方（X²）值。请点击此处下载该文件。

补充图 S9：动力学分析流程中的结合拟合步骤。来自多个重复实验和探针位置（C1 和 D1）的结合相互作用动力学分析。传感器响应值（nm）随时间（s）的变化显示了缔合和解离阶段，每条曲线根据实验和探针位置以不同颜色编码。垂直的红色虚线标记了缔合（0–300 s）与解离阶段之间的转换点。下方表格列出了基于 1:1 结合模型拟合得到的动力学参数，包括分析物浓度（M Conc.）、缔合速率常数（kon）、解离速率常数（koff）、误差以及平衡解离常数（KD）。一致的拟合质量表明动力学测量具有良好的稳健性。请点击此处下载该文件。

补充表 S1：显示在 384 孔板和 Max 板中所用符号的表格。 请点击此处下载该文件。

补充表 S2：使用固定的 kon 和 koff 值，测定四种浓度的 TMEM120A M207A 与 100 nM GsMTx4 肽段在 FLAG 生物传感器上的相互作用所获得的动力学参数。 请点击此处下载该文件。

讨论

由于需要精细的蛋白质纯化、严格优化去垢剂浓度以及精确的实验设计，膜蛋白相互作用的表征仍然具有挑战性。本研究展示了TMEM120A M207A的详细实验流程，利用GsMTx4结合生物膜干涉技术（BLI）进行蛋白质纯化及动力学分析。

关键步骤与优化：
其中一个重要的关键步骤是去垢剂浓度，该因素被确定为影响蛋白质稳定性的主要决定因素。纯化过程包括：使用含有0.5% LMNG的缓冲液溶解细胞，随后依次用0.005% LMNG进行洗涤、用0.001% LMNG进行洗脱，最后在含有0.00015% LMNG的缓冲液中进行凝胶过滤层析（SEC）。该基于LMNG的去垢剂策略利用了其较低的临界胶束浓度（CMC）和缓慢的解离速率，从而在纯化过程中显著提高了蛋白质在胶束中的稳定性。SEC所用缓冲液中的去垢剂浓度为LMNG的CMC（0.001%）的十分之一，有效降低了其对后续生物物理检测的干扰。通过质谱分析和热稳定性分析，确认了蛋白质的均一性以及无聚集状态。图2、图3和 图4展示了在低于CMC的去垢剂浓度下，蛋白质纯化与稳定化的成功优化结果。

生物传感器上的蛋白质固定经过严格控制，以达到50-80%的探针饱和度。50-80%的负载水平可能会引入一定程度的质量传递限制；然而，选择此范围是为了在BLI系统中提供足够的信号强度，其中探针在检测过程中在不同孔之间移动。达到这一配体固定水平有助于保持一致的信号质量，尽管此类负载水平既有优势也存在潜在局限性。在BLI实验中，设置参考探针至关重要。

一项额外的对照实验检测了四种不同浓度的固定化TMEM120A蛋白与单一肽浓度（100 nM）的结合情况。这些数据现已包含在修订后的稿件中（补充图S1）。增加固定化蛋白的量可产生更高的负载信号，但在所有情况下，信号偏移均低于基线1 nm（补充图S1A）。我们采用全局1:1结合模型拟合了缔合与解离曲线，并提供了残差图，显示拟合数据与实验数据之间的差异较小且无显著性。

在主要的动力学测定实验（5–100 µM 分析物）中，拟合得到的速率常数显示出预期的浓度依赖性趋势。koff 值范围为约 1.48 × 10⁻⁴ 至 1.43 × 10⁻³ s⁻¹，而 kon 值范围为 1.12 × 10² 至 1.26 × 10¹ M⁻¹s⁻¹。在整个浓度系列中观察到的这种渐进变化，符合正常的分析物依赖性结合与解离行为。

在对照实验中，于单一分析物浓度（100 nM）下测试了不同的探针负载水平，四种曲线均得到非常相似的动力学常数。koff 值在所有负载水平下均一致为 1.42 × 10⁻¹ s⁻¹，kon 值则一致为 2.76 × 10³ M⁻¹s⁻¹。这种无显著变化的结果表明，结合相和解离相均未受到探针密度、传质限制或分析物再结合的影响。

预计在对照实验中，100 nM 条件下的解离过程会更快。100 nM 的分析物浓度大约比 KD 低一个数量级，在远低于 KD 的浓度下，复合物的稳定性较差，有效占据率较低。在此类条件下，由于在低分析物浓度下结合亲和力较弱，且解离阶段中的再结合极少，因此解离进行得更为迅速。这种行为与分析物浓度显著低于 KD 时通常观察到的现象一致。

综上所述，不同探针载量下动力学参数的一致性以及在低分析物浓度下的预期行为表明，所观察到的速率常数反映的是真实的结合特性，而非由表面载量或传质效应引起的人为假象。

结合动力学与解释：
采用1:1 Langmuir结合-解离模型并结合局部全拟合策略进行动力学分析，其中各个分析物浓度在共享的动力学框架内独立拟合（图6B）。相较于传统的全局拟合方法，选择该方法的原因在于某些数据集（特别是在较低配体浓度下）表现出轻微的重叠或早期相位偏差，这可能是由于质量传递限制以及去垢剂胶束对蛋白质扩散的影响所致。全局拟合假设所有传感图严格遵循相同动力学行为，但当不同浓度之间的表面可及性或局部微环境存在轻微差异时，这一假设可能被破坏。局部全拟合允许对每个分析物浓度独立建模，同时仍保持一致的动力学框架，从而确保所获得的参数能够准确反映各浓度下的结合行为。拟合曲线（红色）与实验数据高度吻合，得到的解离常数（KD）估计值处于低微摩尔浓度范围。残差分析（图6C）未发现显著的系统性偏差，表明该模型适用于此类去垢剂溶解的膜蛋白相互作用研究。

TMEM120A M207A 和 GsMTx4 显示出 KD 低微摩尔浓度范围内的值（∼0.8–3.3 µM）。结合速率（k开启）随着配体浓度的增加而略有上升，而解离速率（k关闭）仍然非常缓慢，表明形成了稳定的复合物。解离最初5-10秒内信号的快速下降可能反映了易于接近的结合位点，而较慢的相则代表了更稳定的相互作用。图6A）。这些观察结果强调了在分析去垢剂溶解的膜蛋白时，仔细选择解离时间窗口并考虑质量传递限制的重要性（表2).

局限性与故障排除：
对于像 TMEM120A M207A 这类经去垢剂溶解的膜蛋白，应考虑若干局限性。在结合初期可能会出现质量传递效应，因为蛋白向生物传感器表面扩散较慢，可能轻微影响动力学测量结果。若探针饱和度超过推荐的 50–80% 范围，可能导致传感器过载，从而限制全局动力学分析的准确性，并影响结合速率（kon）和解离速率（koff）的测定。去垢剂相关效应可能会影响蛋白稳定性、寡聚状态或表面可及性，尤其是在浓度等于或高于临界胶束浓度（CMC）时。其他因素还包括轻微的基线漂移、非特异性结合，以及难以捕捉极缓慢解离过程的动力学特征。

通过一些简单的调整可以缓解上述诸多问题：减少蛋白上样量以避免信号过饱和，优化缓冲液组成，并引入参考探针以校正基线漂移或非特异性信号。在本研究中，含有0.00015% LMNG及低浓度Tween-20的SEC缓冲液有效降低了非特异性结合，同时维持了蛋白的稳定性。谨慎选择用于动力学拟合的解离窗口，结合重复测量和残差分析，对于确认动力学参数的可靠性也至关重要。这些策略通常可提高实验的可重复性，有助于获得更稳健且易于解释的数据。为考虑不同配体浓度下曲线之间的微小差异，本研究采用局部全拟合（local full fitting）替代全局拟合（global fitting），以确保动力学参数能够准确反映每组数据的实际行为。

BLI 与其他生物物理技术：
与表面等离子共振（SPR）和等温滴定 calorimetry（ITC）相比，生物膜干涉技术（BLI）在分析膜蛋白-配体相互作用方面具有多项实际优势。与 SPR 和 ITC 一样，BLI 可提供关于结合相互作用的详细信息，包括结合速率（kon）、解离速率（koff）和平衡解离常数（KD），且无需复杂的微流控系统或高浓度蛋白样品14。其开放式微孔板“浸入-读取”模式支持快速缓冲液更换和多个样品的并行处理，从而提高实验通量。与需要大量高纯度蛋白并提供热力学数据的 ITC 不同，BLI 可在纳摩尔浓度的极少量样品条件下测定复合物形成和解离的动力学速率。BLI 还兼容含去垢剂或脂质的缓冲液，因此适用于其他生物物理方法难以研究的低产量或不稳定的膜蛋白。尽管具有这些优势，SPR 或 ITC 等互补技术仍可用于在无去垢剂和含去垢剂条件下验证热力学一致性及交叉验证结合参数，但这些方法需要较高浓度的蛋白3。

未来研究方向：
该工作流程可拓展用于研究其他膜蛋白、蛋白质-脂质相互作用，或筛选小分子调节剂。将生物膜层干涉技术（BLI）与正交方法相结合，例如质量光度法、结构表征或冷冻电镜（cryo-EM），可更深入地揭示寡聚化状态、化学计量比及结合机制。进一步优化该方法还可能实现对高亲和力配体、多价相互作用，或在更接近天然状态的脂质环境中形成的复合物的分析。

综上所述，通过严格控制蛋白质固定化、去垢剂浓度和缓冲液条件，BLI 可为 TMEM120A M207A 及类似难溶膜蛋白提供可靠且可重复的动力学数据。尽管存在固有的局限性，该方法仍为在明确定义的实验条件下研究特异性的中等亲和力蛋白质-配体相互作用提供了稳健的平台。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们衷心感谢墨尔本大学研究平台——墨尔本蛋白质表征（MPC）中心在蛋白质纯化与表征方面提供的支持。本研究得到了澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC） Ideas 基金（2020/GNT2000934，授予 I.R.）以及澳大利亚研究理事会（工业转型培训中心，IC200100052，授予 I.R. 和 M.M.）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
384孔黑色微孔板Greiner Bio-One781906BLI
Amicon Ultra 离心滤膜，30 kDa 分子量截留值Sigma-AldrichUFC903008纯化
Anti-FLAG 探针Gator Bio160036BLI
ANTI-FLAG M2 亲和凝胶Sigma-AldrichA2220-10ML纯化
BioRenderBioRenderhttps://biorender.com图1绘制 
牛血清白蛋白Sigma-Aldrich9048-46-8质谱光度法
CD 293 培养基（1倍浓度）Thermofisher11913019细胞培养
Centrifuge 5920 R：大容量高性能离心机EppendorfNA纯化
cOmplete Mini 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物Merck11836170001纯化
牛胰脱氧核糖核酸酶ISigma-Aldrich9003-98-9纯化
ExpiFectamine 293 转染试剂盒ThermofisherA14524转染
Gator Bio 软件Gator BioNABLI
Gator PlusGator BioNABLI
GlutaMAX 添加剂Thermofisher35050061细胞培养
GsMTx4 三氟乙酸盐Sigma-AldrichSML3140-1MGBLI
适应悬浮生长的HEK293T/SF17细胞ATCCATCC CRL11268细胞培养
LMNG（月桂基麦芽糖新戊二醇）ThermofisherA50940纯化
Max PlateGator Bio130062BLI
苯甲基磺酰氟（PMSF）Sigma-Aldrich11359061001纯化
Prometheus 高灵敏度毛细管Nano TemperPR-C006热力学稳定性
Prometheus PantaNano TemperNA热力学稳定性
Q缓冲液（0.3% 甘氨酸，pH 3.8）Gator Bio120010BLI
Qsonica Q500 超声波细胞破碎仪QsonicaNA纯化
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytivaGE28-9909-44纯化
合成的TMEM120A（M207A）基因，克隆至含FLAG-3C-连接子的pCDNA 3.1质粒GenScript BiotechNA质粒
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379-25MLBLI
Two MPRefeynNA质谱光度法

参考文献

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