利用在背缝核（DR）中过表达人源突变型A53T α-突触核蛋白（h-α-Syn）的帕金森病（PD）样小鼠模型，我们建立了一种电生理记录方法，用于研究腹内侧前额叶皮层（vmPFC）-DR环路在帕金森病相关抑郁/焦虑障碍中的作用。
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利用在背缝核（DR）中过表达人源突变型A53T α-突触核蛋白（h-α-Syn）的帕金森病（PD）样小鼠模型，我们建立了一种电生理记录方法，用于研究腹内侧前额叶皮层（vmPFC）-DR环路在帕金森病相关抑郁/焦虑障碍中的作用。
尽管帕金森病（PD）主要被视为一种运动障碍疾病，但非运动症状常在运动功能缺损出现之前就已发生，并在疾病发展的各个阶段显著影响病程进展，具有重要作用。在这些非运动症状中，抑郁和焦虑最为常见，且女性患者因此承受的症状负担高于男性。5-羟色胺（5-HT）系统的改变常与情绪障碍相关，而在帕金森病合并抑郁患者的5-HT中缝核（RN）中已观察到α-突触核蛋白（α-Syn）的聚集。因此，理解这些非运动症状背后的神经环路机制至关重要。
本文介绍了一种改进的实验方案，利用在背缝际核（DR）中过表达人源突变型A53T α-突触核蛋白（h-α-Syn）的雌性小鼠模型，研究腹内侧前额叶皮层（vmPFC）与背缝际核（DR）环路在帕金森病相关情绪障碍中的作用。本方法可在基础状态以及厌恶性条件反射和消退过程中，对下边缘皮层（IL）和前边缘皮层（PL）的神经元活动进行高分辨率评估。我们采用声音-光感条件反射范式，在清醒、头部固定的动物中使用多通道电生理探针记录神经元反应。实验在虚拟现实走廊中进行，结合圆柱形跑步机与双屏视觉显示系统，在确保感觉刺激精确控制和记录稳定性的同时维持动物的行为参与度。
本方案基于内侧前额叶下边缘皮层（IL）和前边缘皮层（PL）在恐惧条件化及消退中的已知作用，提供了一个可靠的研究框架，用于检测与帕金森病（PD）中抑郁样和焦虑样行为相关神经环路的动态神经活动。通过在受控条件下实现行为学与电生理学测量的同步进行，该方法为阐明帕金森病非运动症状的神经生物学机制以及评估潜在干预手段提供了有力工具。
帕金森病（PD）是一种运动障碍性疾病，但非运动症状已知会早于运动症状出现，并且贯穿疾病的所有阶段1,2,3,4。在这些非运动症状中，抑郁和焦虑是最常见的神经精神症状，严重影响帕金森病患者的生活质量，且女性的症状负担高于男性5。尽管如此，这些症状常常被漏诊且治疗不足6。基于上述所有原因，深入了解帕金森病神经精神症状所涉及的神经生物学机制和神经环路，对于对患者进行分层并提供更加个性化的治疗至关重要。
尽管帕金森病（PD）的病因尚未完全明确，但已发现若干关键的神经病理学特征。该疾病以黑质纹状体系统中多巴胺能（DA）神经元及其纤维进行性变性和丧失为特征，导致帕金森病典型的运动功能障碍7,8。帕金森病的另一标志性特征是路易小体（LB）和路易神经突的存在——即主要由纤维状蛋白聚集物构成的细胞内包涵体，其主要成分为α-突触核蛋白（α-Syn）9,
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所有实验均使用年龄匹配的对照组进行，动物实验设计遵循“3R”原则，符合欧盟指令2010/63（2010年9月22日）、西班牙法律法规（RD 1201/2005、L.32/2007和L.6/2013）规定的伦理准则，并已获得巴伦西亚自治区政府（ES462500001003；编号2023-VSC-PA-0073）以及瓦伦西亚大学本地生物伦理委员会（编号A20230214153605）的批准。
注意：为确保安全并防止污染，在整个操作过程中，应穿戴个人防护装备，包括一次性手套和鞋套、实验服、口罩和发网。根据当地法规和适用的国家回收计划，使用兽药回收系统处理使用后产生的残留物。
1. 小鼠模型构建
注意：成年雌性 C57BL/6J 小鼠（9 周龄）饲养于环境受控条件下（22 ± 1 °C；12 小时光照/黑暗循环），可自由摄食和饮水。
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利用详细的实验方案对PL和IL皮层活动进行的最新记录揭示了重要发现：在背缝核（DR）中过表达h-α-Syn可诱导雌性小鼠出现类焦虑表型，同时也会改变腹内侧vmPFC的活动。通过基于Python的分析，我们证明DR核中5-HT神经元的α-Syn过表达改变了vmPFC-DR环路的放电动态和功能组织，降低了不同神经元亚型之间的电生理差异。在对照组动物中，神经元亚型可根据电生理特性清晰区分，从而能够准确分类SST+、锥体细胞以及PV+神经元。相比之下，A53T α-Syn过表达导致亚型可分性显著丧失，不同神经元群体的特征空间出现重叠，并发生广泛的错误分类（图5）。这种破坏表现为放电率分布的崩溃，表明α-Syn病理损害了在正常条件下维持环路层级组织所依赖的特异性电生理身份。
图6展示了使用我们自主开发的Python程序（https://github.com/NeuronalCircuitsLab-UV/Papers-Projects/tree/main/ParkinsonM.......
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本方案介绍了一种可靠的实验方法 体内 在清醒、头部固定的转基因小鼠中，利用虚拟现实走廊系统对前边缘（PL）和下边缘（IL）皮层进行电生理学评估。该方法的重要意义在于能够在帕金森病（PD）模型中，直接于清醒且具有行为反应的小鼠体内研究腹内侧前额叶皮层-背缝核（vmPFC-DR）神经环路。尽管头部固定会限制动物的运动并可能引发应激反应，但它提供了精确的刺激控制和稳定的记录条件，适用于感知与认知过程的研究，尽管其结果可能无法完全反映自然状态下的行为表现。24,25该方法相较于离体或麻醉状态下的制备具有显著优势，能够在一个更接近生理状态的条件下研究神经活动，特别是在厌恶条件反射过程中，可模拟与应激相关的情境。32,33事实上，在全身麻醉期间，行为状态和全脑活动（尤其是皮层反应）会发生显著改变。34,
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作者声明无竞争利益。
本工作得到了2023年BBRF青年研究员资助项目31547（MSA）、MCIU/AEI/FEDER欧盟资助项目PID2022-141700OB-I00、MCIN/AEI/10.13039/501100011033（AB）、加泰罗尼亚政府AGAUR 2021-SGR-01358（AB）以及PID2022-141733NB-I00（VT）的资助。我们还要感谢西班牙应激研究网络、MCIN/AEI/10.13039/501100011033以及CB/07/09/0034心理健康生物医学研究中心网络（CIBERSAM）。MSA获得了瓦伦西亚大学玛格丽塔·萨拉斯奖学金（MS21-132）（西班牙政府大学部西班牙大学系统重组项目，由欧盟“下一代欧盟”计划资助）。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AAV1/2-CMV/CBA-人 A53T aSyn-WPRE-BGH-polyA | 查尔斯河实验室 | GD1001-RV | 人 A53T α-突触核蛋白 |
| AAV1/2-CMV/CBA-Null/Empty-WPRE-BGH-polyA | 查尔斯河实验室 | GD1004-RV | 空载体对照 |
| ADPT A64-Om32x2 | 剑桥神经科技 | Omnetics 2228 | 衔接器 |
| 双组分外科硅胶 | 世界精密仪器公司 | KWIK-SIL | |
| 布托啡诺 | 托曲布西 Vet / 西米特 Qí云母 | 67753-31-5 | |
| DuraLay | Reliance Dental Manufacturing / Kalma | 43640 | 牙科水泥 |
| H9 多通道探针 | 剑桥神经科技 | ASSY-77 H9 | |
| EMLA 乳膏（利多卡因 / 丙胺卡因） | Lirios Vañó Sempere 药房 | 679290 | |
| 显微注射仪 | 世界精密仪器公司 | KDS-310-PLUS | |
| MSS 异氟烷蒸发器 | 英国医疗用品与服务 | MSSVAP02 | |
| Open Ephys 采集板 | Open Ephys | OEPS-9029 | 采集板；Open Ephys 采集板可通过 USB 将最多 512 通道的神经数据流传输至计算机 |
| C&B MetaBond | Parkell | S380-RD | 快速粘合水泥 |
| 戊巴比妥 | Dolethal Vetoquinol /Merck Life Science, S.L.U. | P-010-1ML | 巴比妥类药物 |
| RHD 32通道 前置放大器 | Intan Technologies | #C3314 | 头级适配器 |
| Siccafluid | Thea S.A. Laboratories / Lirios Vañó 森佩尔药店 | 6515167 | 眼科凝胶 |
| 立体定位仪 | 斯托尔廷 | 51730U | |
| 立体定位仪 | Narishige | SR-6N/SM-15R | |
| Terg-a-zyme | Sigma Aldrich | Z273287 | 探针清洗液 |
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