本方案描述了利用哺乳动物 Neuro-2a 细胞系表达并定量神经元型烟碱乙酰胆碱受体亚基的方法。通过 pH 敏感性荧光标签结合共聚焦显微镜，可精确评估受体在质膜上的定位情况，以及在 pH 中性细胞内区室中的表达情况，从而促进对 nAChR 转运过程及药物学调控机制的研究。
本文内容
摘要
摘要
定量分析表达在哺乳动物细胞质膜上的神经元烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）对于开发新型靶点选择性治疗药物以及研究调控受体转运的分子伴侣蛋白具有重要意义。本研究提供了一套可靠的方法，用于在哺乳动物 Neuro2a（N2a）细胞中表达同源和异源 nAChRs，并利用 pH 敏感性荧光标签定量分析其在细胞表面与细胞内定位的分布情况。pHuji 和超嗜光性 pHluorin（SEP）是 pH 敏感性荧光蛋白，可被设计用于标记重组蛋白，从而实现对 nAChR 亚基空间分布的可视化。这些荧光标签在中性 pH 条件下可发射荧光，但在酸性环境中荧光被淬灭。为追踪 α7、α4 和 β2 nAChR 亚基在细胞内与质膜上的相对定位，可将 pHuji 或 SEP 连接到各 DNA 构建体的 C 末端。为在 N2a 细胞中共同表达 α7-pHuji 与其分子伴侣 NACHO，或共表达（α4-SEP；β2-pHuji），采用基于脂质的 DNA 转染试剂。转染试剂与质粒 DNA 分别在低血清培养基中室温孵育，随后混合形成脂质-DNA 复合物，以促进质粒进入细胞。转染后，利用活细胞共聚焦显微镜在高 pH 与低 pH 条件下，或在存在亚型选择性荧光配体的情况下对细胞进行成像。通过在相应荧光通道中计算校正后的总细胞荧光强度，对图像进行分析，从而获得荧光标记 nAChR 亚基在质膜与细胞内区室之间分布的定量信息。活细胞共聚焦成像可实时追踪 nAChR 亚基的定位，以区分细胞内与细胞表面受体群体之间的差异。在 37 °C 条件下孵育 24 小时内，即可实现 α7-pHuji 或（α4-SEP；β2-pHuji）在质膜上的稳定表达。该方法可进一步拓展，用于引入其他分子伴侣、辅助亚基或荧光配体，以研究 nAChR 的转运机制、药理学调控以及与疾病相关的 nAChR 表达改变。
引言
神经元烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）是一类配体门控跨膜离子通道，表达于多种细胞类型的质膜上，包括神经元、胶质细胞和免疫细胞。这些受体由α（α2-α10）或β（β2-β4）亚基组成，可组装形成同源或异源亚型，其中α7和α4β2 nAChR是大脑中最丰富的亚型1,2。这些亚型的失调已与阿尔茨海默病、尼古丁使用障碍、睡眠相关性高运动性癫痫、帕金森病以及重度抑郁障碍等多种神经和精神疾病相关联3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。快速且可靠地表达和定量nAChRs的方法对于理解疾病机制以及开发靶点选择性治疗药物至关重要。然而，实现这些受体在质膜上的....
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方案
注意：以下步骤描述了已成功用于瞬时转染N2a细胞系中nAChR亚基的方法（图1）。通过活细胞共聚焦显微镜观察，可在24小时内实现稳定的质膜表达。
图1：本实验方案中各步骤的示意图。细胞在成像培养皿中培养至70%-80%融合度。随后用转染试剂与DNA复合物处理细胞。（上图）转染24小时后，可加入荧光标记的配体处理细胞，以标记细胞质膜上表达的亚基，并使用共聚焦显微镜进行成像。（下图）或者，对于转染24小时后已通过基因改造而带有pH敏感蛋白标签的nAChR亚基基因，可直接对活细胞进行共聚焦显微镜成像以获取细胞的总荧光信号。随后将pH 7.4的成像缓冲液更换为pH 5.5的淬灭缓冲液，使位于细胞质膜上的nAC....
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结果
完成上述转染步骤后，α7 nAChRs 与 NACHO 分子伴侣蛋白在 N2a 细胞中共同表达。在转染 DNA 24 小时后，对未转染和已转染的细胞均使用 αBTX-AF647 进行标记。由于 αBTX 不具有细胞膜通透性，所有检测到的荧光信号均来源于细胞质膜上的受体。如预期所示，在未转染的 N2a 细胞中，图 2A、A′ 显示了微弱的 αBTX-AF647 染色信号。N2a 细胞内源性表达少量 α7 nAChRs，这解释了该微弱标记现象。相比之下，成功转染的细胞表现出强烈的 αBTX-AF647 标记信号（图 2B、B′）。荧光信号呈现为离散的斑点，通常与细胞质膜上的表达相关29。已知 nAChRs 在与配体结合后可发生内吞，进入循环内体。因此，部分胞内标记可能代表最初位于质膜上、随后被内化的受体。根据步骤 4 中所述的 CTCF 方法进行定量分析，证实转染了 α7 nAChR DNA 的细胞其质膜表达.......
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讨论
本文所述在哺乳动物N2a细胞中表达和定量nAChR亚基的方法，解决了长期以来在药物发现、定位和运输研究中实现快速（约24小时）且高效（> 60%）的nAChR质膜表达的难题。该系列实验方案的一个关键优势在于其适用于同源五聚体（α7）和异源五聚体（α4β2）nAChR，并且很可能也适用于其他nAChR亚型，以及分子伴侣蛋白的共表达。通过利用pH敏感性标签（如SEP和pHuji），该方法能够在活细胞中区分并定量位于质膜和细胞内的nAChR群体。这种区分至关重要，因为不同nAChR亚型的运输依赖多种分子伴侣和辅助蛋白（包括14-3-3、NACHO、RIC-3和lynx-1蛋白）以及配体（如尼古丁）17,18,35,36,37,38,<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 James Janoso 在显微技术方面的专业支持，以及美国国立卫生研究院下属国家普通医学科学研究所（资助编号 P20GM130443）设立的代谢转化研究中心对阿拉斯加大学费尔班克斯分校显微成像核心设施的支持。LW 的工作部分得到了阿拉斯加州通过阿拉斯加大学提供的高等教育投资基金的资助。SMS 的工作得到了美国国立卫生研究院下属国家普通医学科学研究所通过机构发展奖（IDeA，资助编号 P20GM103395）的支持。本出版物所报道的研究工作得到了美国国立卫生研究院下属国家心理健康研究所（MMW，资助编号 R03MH135358）和国家普通医学科学研究所（MMW，资助编号 R16GM150455）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | 细胞解离试剂 |
| α-银环蛇毒素 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | B35450 | α-银环蛇毒素偶联物 |
| BSL-1级生物安全柜 | Nuaire | NU-425-400 | 无菌细胞培养工作区 |
| 氯化钙 | Aventor/VWR | BDH9224 | 缓冲液组分 |
| D-(+)-葡萄糖 | MilliPore Sigma | G8270 | 缓冲液组分 |
| 含L-谷氨酰胺的EMEM培养基 | ATCC | 30-2003 | 细胞培养基 |
| 无内毒素DNA | 使用Zymo试剂盒自行制备 | 不适用 | 用于细胞瞬时转染的nAChR DNA |
| 无内毒素微量离心管，0.5 mL | Aventor/VWR | 89000-010 | DNA与转染制备 |
| 无内毒素微量离心管，1.5 mL | Aventor/VWR | 20170-038 | DNA与转染制备 |
| 胎牛血清 | Aventor/VWR | 97068-085 | 血清添加剂 |
| Fluoview FV10i | Olympus | FV10i | 共聚焦显微镜 |
| MatTek玻璃底培养皿 | MatTek | P35GC-0-10-C | 成像用培养皿 |
| GraphPad Prism v. 10 | GraphPad Prism | https://www.graphpad.com/features | 数据分析软件 |
| HEPES | MilliPore Sigma | H3375 | 缓冲液组分 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | 转染试剂 |
| 六水合氯化镁 | Thermo scientific | 413410025 | 缓冲液组分 |
| MES水合物 | MilliPore Sigma | M5287 | 缓冲液组分 |
| mTagBFP2-pBAD | AddGene | 54572 | 用于细胞瞬时转染的对照DNA |
| Neuro 2a (N2a) 细胞 | 美国模式培养物集存库 | CCL-131 | 用于DNA转染和nAChR表达的细胞 |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 低血清培养基 |
| 青霉素/链霉素 | Aventor/VWR | K952-100mL | 抗生素 |
| 蠕动泵 | Gilson | MiniPuls3 | 成像过程中缓冲液更换 |
| 磷酸盐缓冲液 | Quality Biological | 119-069-131 | 生理盐水缓冲液 |
| Pipet Aid | Drummond | 140084 | 精确液体转移 |
| 移液吸头（无菌且无内毒素，1000 μL） | Rainin | 30389216 | 精确液体转移 |
| 移液吸头（无菌且无内毒素，20 μL） | Rainin | 30389229 | 精确液体转移 |
| 移液吸头（无菌且无内毒素，250 μL） | Rainin | 30389246 | 精确液体转移 |
| 移液器，P10 | Rainin | L-10XLS | 精确液体转移 |
| 移液器，P100 | Rainin | L-100XLS | 精确液体转移 |
| 移液器，P1000 | Rainin | L-1000XLS | 精确液体转移 |
| 氯化钾 | MilliPore Sigma | P3911 | 缓冲液组分 |
| 血清移液管（无菌且无内毒素，10 mL） | Aventor/VWR | 89130-898 | 精确液体转移 |
| 血清移液管（无菌且无内毒素，25 mL） | Aventor/VWR | 89130-900 | 精确液体转移 |
| 血清移液管（无菌且无内毒素，5 mL） | Aventor/VWR | 76201-710 | 精确液体转移 |
| 血清移液管（无菌且无内毒素，50 mL） | Aventor/VWR | 75816-088 | 精确液体转移 |
| 氯化钠 | Aventor/VWR | BDH9286 | 缓冲液组分 |
| 组织培养瓶 | Falcon | 353109 | 培养用器皿 |
| ZymoPure II 质粒大提试剂盒 | ZYMO RESEARCH | D4203-A + D4203-B | 无内毒素DNA的制备 |
| α4-SEP | ThermoFisher Scientific GeneArt 基因合成服务 | https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html | 定制基因合成服务 |
| α7-pHuji | Twist Bioscience | https://www.twistbioscience.com/ | 定制基因合成服务 |
| β2-pHuji | ThermoFisher Scientific GeneArt 基因合成服务 | https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html | 定制基因合成服务 |
参考文献
- Whiting, P. J., et al. Expression of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in brain and retina. Mol Brain Res. 10 (1), 61-70 (1991).
- Albuquerque, E. X., et al. Nicotinic Receptor Function in the Mammalian Central Nervous System. Ann Ne....
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