ML385 通过 ROS/NRF2 自噬轴通路减弱二氧化硅诱导的肺腺癌细胞的恶性进展

肺腺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，^{估计每年有}200万例新发病例和176万人死亡1。近年来，从不吸烟的人群肺腺癌发病率上升，可能与空气污染等环境因素^有关2。二氧化硅是一种常见的环境污染物，已被确定为人类肺腺癌的潜在致病因素³。二氧化硅可引起持续的慢性炎症，导致巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞浸润，并释放活性氧和炎症因子⁴。这种长期的炎症微环境促进了肺腺癌的发生 ^5,6。尽管二氧化硅暴露与肺腺癌之间的关联已得到证实，但其具体分子机制尚未完全阐明。

由NFE2L2基因编码的转录因子NRF2作为主调节因子在维持细胞氧化还原稳态以响应氧化应激方面起着至关重要的作用^7,8。正常情况下，NRF2被KEAP1-CUL3泛素连接酶复合物标记和降解。在氧化应激或亲电物质的刺激下，KEAP1的活性受到抑制，使NRF2稳定积累并进入细胞核，从而发挥核心⁹的防御和调控作用。然而，肿瘤微环境中过度激活NRF2可能会通过阻止ROS积累和增强凋亡抵抗性来增强糖酵解和肿瘤细胞的存活^10,11。研究证明，二氧化硅暴露会导致 NRF2 信号通路异常激活^12,13。因此，靶向NRF2可能是干预二氧化硅诱导的肺腺癌恶性进展的有效策略¹⁴。

本研究旨在阐明 NRF2 抑制剂ML385是否通过调节ROS/NRF2自噬轴通路来抑制二氧化硅诱导的肺腺癌恶性进展。我们建立了二氧化硅诱导的小鼠模型来再现该疾病的关键特征，并使用 体外 实验方法研究巨噬细胞与肿瘤细胞之间的相互作用。我们发现二氧化硅诱导炎症和免疫分子的表达，并通过ROS/NRF2-自噬轴途径进一步促进肿瘤形成。当使用NRF2抑制剂（ML385）时，二氧化硅对肿瘤形成的促进作用减慢，提示NRF2抑制剂可能在二氧化硅诱导的肺部肿瘤的治疗中发挥作用。

所有供体块均取自2016—2018年在南京医科大学附属淮安市第一人民医院采集的档案病理标本。样品在使用前被去识别化，并按照批准的方案进行处理。南京医科大学附属淮安市第一人民医院伦理委员会，KY-2024-250-01.实验小鼠的繁殖、处置和应用严格遵循《实验动物管理条例》和国际指南。

二氧化硅诱导小鼠模型的构建
小鼠和二氧化硅悬浮液的制备：将雄性C57BL / 6小鼠，6-8周龄，在室温20-25°C和12小时光照/12小时黑暗循环的动物室中饲养。为了制备硅粉悬浮液，精确称取 300 mg 硅粉并悬浮在 10 mL 无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水中。随后，将混合物剧烈涡旋振荡5 min，然后在水浴超声机中超声处理30 min，以确保颗粒均匀分散并防止聚集。该储备悬浮液的最终浓度为 30 mg/mL。通过在121°C下高压灭菌30分钟进行灭菌。每次使用前，需要涡旋并再次摇晃 2-3 分钟，以重悬任何沉淀的颗粒。

小鼠通过鼻子吸入二氧化硅悬浮液。使用微量移液器缓慢地将溶液滴滴引入小鼠的鼻腔。将小鼠分为6组，每组20只小鼠。每组吸入量为10 μL、30 μL、50 μL、70 μL、90 μL、200 μL，浓度为30 mg/mL，每天一次，连续40 d。灌注时，用左手的拇指和食指抓住老鼠耳后的皮肤，用其他手指固定小鼠的身体和尾巴。确保小鼠处于仰卧位，头部略微向后倾斜，以使悬浮液自然吸入呼吸道。我们发现，小鼠吸入10 μL、30 μL、50 μL和70 μL二氧化硅悬浮液第二天后没有死亡事件，而小鼠吸入90 μL和200 μL二氧化硅悬浮液第二天后出现死亡事件。因此，小鼠吸入二氧化硅的最大量为每天70μL。

处理结晶二氧化硅时，必须在生物安全柜或通风橱中进行，全程必须佩戴N95口罩、防尘护目镜、丁腈手套和防护服。制备悬浮液时，动作应轻柔，并应使用称重室以避免气溶胶的产生。所有与二氧化硅接触的废物应收集在具有抗穿刺性的密封容器中，并按照危险化学废物的规定进行处理。严禁与一般垃圾混合或倒入下水道。生物废物，如细胞培养基，应收集在装有消毒剂的专用垃圾桶中，并在高压下灭菌。动物尸体和组织应放入生物废物袋中，在高压下进行灭菌，以便进行无害化处理。

评估二氧化硅诱导的小鼠模型的成功。在吸入二氧化硅后的不同时间点评估动物，即第3天，第14天和第40天。将小鼠置于专业的动物安乐死装置中，以30%-50%体积/分钟的填充速率引入二氧化碳。他们不断暴露在外，直到停止呼吸。确认死亡后，进行了后续手术。切除肺组织。将肺组织在室温下固定在4%多聚甲醛溶液中48 h。固定后，用梯度醇将组织脱水，用二甲苯使其透明，然后包埋在石蜡中。使用厚度为4-5μm的石蜡切片机进行连续切片，用于随后的组织学染色和免疫组织化学分析。肺组织不需要脱钙治疗。对肺组织进行病理检查以评估模型生成的成功。矽肺模型构建的成功标准为：肺部炎症明显、纤维化、矽肺结节的发生。

二氧化硅诱导小鼠模型中免疫细胞浸润的分析
用含有CD3e（1：200稀释比）、CD8a（1：200稀释比）、CD86（1：200稀释比）、F4/80（1：200稀释比）和Nk1.1（1：200稀释比）的荧光标记物染色小鼠肺组织，以可视化免疫细胞。固定细胞或组织切片并用5%牛血清白蛋白（BSA）阻断1小时，以减少非特异性结合。使用与封闭抗体相同物种来源的正常血清，用PBS以1：10的比例稀释血清，并在样品中加入100μL稀释的血清。然后，在室温下封闭30分钟，让血清阻断内源性抗体。密封后，用PBS轻轻冲洗2次。将含有CD3e（1：200稀释比）、CD8a（1：200稀释比）、CD86（1：200稀释比）、F4/80（1：200稀释比）和Nk1.1（1：200稀释比）的一抗在4°C或室温下孵育1-2小时。用PBS洗涤后，加入荧光二抗并在黑暗中孵育1小时。

马森染色和免疫组织化学分析
石蜡切片用二甲苯脱蜡，用梯度醇水合，然后在pH 6.0的柠檬酸钠缓冲液中通过高压热修复进行抗原修复。对于高压热修复，将浸泡在修复缓冲液中的组织切片放入微波炉中火8-12分钟。用3%双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶活性20 min，然后在室温下用5% BSA阻断非特异性结合位点30 min。加入一抗 NRF2 （1：200）， CDK1 （1：400）和 VDAC1 （1：500），并在4°C下孵育过夜。 用PBS洗涤3次后，加入HRP标记的山羊抗兔二抗（1：500）并在室温下孵育1小时。对石蜡切片进行DAB染色、苏木精复染、脱水透明、中性凝胶封口等方法，得到相应的分子免疫组化结果。DAB显色时，显色适中，应为棕黄色至棕褐色，背景应清晰。显色过多（深棕色）和显色不足（浅黄色）都需要优化显色时间。

使用Ashcroft评分法半定量分析肺纤维化程度¹⁵：在100倍放大显微镜下观察马森染色切片，将肺组织随机分为8个区域。每个区域根据纤维化程度（0-8分）进行评分，最终得分为所有区域的平均值：0分（正常肺组织）、1-2分（轻度纤维化）、3-4分（中度纤维化）、5-8分（重度纤维化）。

使用图像软件对免疫组化结果进行定量分析。随机选取5个高倍视野，测量每个视野的平均光密度值（MOD）作为蛋白质表达水平的指标。

检查二氧化硅和 ML385 对 RAW264.7 细胞自噬和 ROS 的影响
RAW264.7和A549细胞（安徽理工大学提供）均采用补充10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素双特异性抗体溶液的DMEM高糖培养基培养。将 1 x 10⁷ 细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 的恒温培养箱中均匀培养。将 5 μL 30 mg/mL 二氧化硅悬浮液添加到 1 x 10⁵ 个细胞/mL 的 RAW264.7 细胞中。孵育24 h后，用PBS 3x冲洗细胞，用ROS、LC3和溶酶体探针检测自噬和氧化应激。同时，使用NRF2抑制剂ML385¹⁶抑制NRF2的表达（ML385终浓度：5 mM/L）。根据上述实验步骤检测自噬和氧化应激。统计分析两组患者的氧化应激和自噬流量。

肺腺癌组织中 VDAC1、CDK1、p62 、 NRF2 表达的免疫组化分析
检查30例患者的VDAC1、CDK1、p62和NRF2的表达。取自南京医科大学附属淮安市第一人民医院肺腺癌组织及邻近健康组织，采用免疫组化（IHC）分析。统计学分析IHC和肺纤维化的结果。根据医院系统中的患者信息收集患者数据。具体实验步骤如下：石蜡切片用二甲苯脱蜡，用梯度醇水合，然后在pH 6.0的柠檬酸钠缓冲液中通过高压热修复进行抗原修复。用3%双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶活性20 min，然后在室温下用5% BSA阻断非特异性结合位点30 min。加入一抗NRF2（1：200），CDK1（1：400），p62（1：500）和VDAC1（1：500），并在4°C下孵育过夜。 用PBS洗涤3次后，加入HRP标记的山羊抗兔二抗（1：500），室温孵育1小时。DAB显色，苏木精复染，脱水透明，中性牙龈密封。DAB显色时，显色适中，应为棕黄色至棕褐色，背景应清晰。显色过多（深棕色）和显色不足（浅黄色）都需要优化显色时间。

细胞迁移和侵袭分析
研究了二氧化硅与RAW264.7细胞共孵育的ML385和上清液与肺腺癌细胞系A549孵育后对细胞迁移和侵袭的影响。将与二氧化硅共培养24 h的RAW264.7细胞上清液加入A549细胞中。将细胞分为二氧化硅组、二氧化硅+ML385组和PBS组。二氧化硅组：将 5 μL 30 mg/mL 二氧化硅悬浮液添加到 1 x 10⁵ 个细胞/mL 的 RAW264.7 细胞中。孵育24小时后，取出细胞上清液备用。二氧化硅+ML385组：将5μL的30mg/mL二氧化硅悬浮液和终浓度的5mM/L ML385加入1 x 10⁵ 个细胞/mL的RAW264.7细胞中。孵育24小时后，取出细胞上清液备用。PBS组：将5μLPBS加入1 x 10⁵ 个细胞/mL的RAW264.7细胞中。孵育24小时后，取出细胞上清液备用。在划痕测定过程中，首先将 A549 细胞以每孔 5 x 10⁵ 的密度接种在 12 孔板中。在细胞生长到95%-100%融合后，使用200μL无菌移液器的尖端在单层细胞上划痕。用PBS轻轻洗掉脱落的细胞。随后，改变培养条件，包括1%FBS碱性培养基和各处理组的上清液，以维持7 d实验期间的细胞活力。分别在划痕后 0 h（第 0 天）和第 7 天（第 7 天）在倒置显微镜下收集相同位置的图像。最后，对划痕区域进行定量分析，并利用ImageJ软件计算划痕闭合率，评价不同处理组上清液对A549细胞迁移能力的影响。

在细胞通过特定大小的孔隙侵袭试验中，使用8μm聚碳酸酯膜室，上室膜预涂有模拟细胞外环境的凝胶，以1：8的比例稀释，以构建基底膜屏障。将A549细胞重悬于通过将无血清培养基与每个处理组的上清液以1：1的比例混合而成的悬浮液中，然后接种在上室（每个腔室2 x 10⁴ 个细胞）。在下室中，加入含有20%FBS的培养基与相应处理组（二氧化硅+ML385组、二氧化硅组和PBS组）的上清液按相同比例混合制成的溶液作为化学引诱剂。通过移液器枪抽吸收集相应处理组的上清液，在RAW264.7二氧化硅的细胞吞噬作用中。将细胞在37°C和5%CO₂ 下连续孵育7天后，用棉签去除上室的非侵入性细胞，用4%多聚甲醛固定并用0.1%结晶紫染色已穿膜到达下室的细胞。最后，通过光学显微镜从5个视场中随机选择侵袭细胞的数量。

流式细胞术分析二氧化硅和ML385对A549细胞细胞凋亡的影响
细胞制备和分组：收集各处理组（PBS组、二氧化硅组、二氧化硅+ML385组）上清液处理的A549细胞。用预冷的PBS轻轻洗涤细胞2次，然后重悬于1x结合缓冲液中，并将细胞密度调整为每管1 x 10⁶ 个细胞/100μL。然后，将5μL膜联蛋白V-FITC和5μLPI染色液加入细胞悬液中，轻轻涡旋混合，室温避光孵育15min。孵育后，将 400 μL 1x 结合缓冲液加入每个试管中，并立即在机器上进行测试。使用流式细胞仪进行检测。经488 nm激光激发，通过FITC通道采集膜联蛋白V-FITC的荧光信号，通过PE通道采集PI的荧光信号。实验前，采用单染色样品进行荧光补偿调整，以消除光谱重叠。在进行数据分析时，首先在FSC-A/SSC-A散点图中描绘出靶细胞群并消除片段。随后，使用FSC-H/FSC-A散点图排除细胞粘附;最后，设置一个门来区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡/坏死细胞和机械损伤细胞。使用FlowJo V10软件获取和分析数据。

硅胶鼠模型
在 图1中，小鼠以30mg/mL和70μL的剂量鼻内给予二氧化硅，连续40天，确保小鼠没有发生死亡事件，并成功建立二氧化硅小鼠模型。同时，PBS灌胃小鼠作为阴性对照。目的是消除作和溶剂本身的影响，并确保表型是由二氧化硅特异性诱导的。这种二氧化硅诱导的肺损伤模型的成功复制，为后续研究恶性进展机制和药物干预提供了必要的 体内 基础。

二氧化硅诱导小鼠结节免疫细胞浸润分析
在 图2中，通过检测二氧化硅小鼠结节中的免疫细胞浸润，发现结节中存在大量免疫细胞浸润（CD3e+、CD8a+、CD86+、F4/80+和Nk1.1+细胞），这些细胞参与了二氧化硅肺病的形成和发展。这表明二氧化硅诱导持续性炎症性肿瘤微环境，是肿瘤发生发展的关键促进因素，也是ROS/NRF2通路参与的病理生理基础。

二氧化硅诱导的小鼠肺纤维化与NRF2、CDK1和VDAC1的关系
通过检测结节中免疫分子的表达，发现 NRF2 （ML385抑制靶点）、 CDK1 （细胞周期相关）和 VDAC1 （参与线粒体氧化应激）在结节周围和结节内高表达，与肺纤维化有关（图3）。

二氧化硅和ML385对RAW264.7细胞自噬和ROS的影响
通过二氧化硅和RAW264.7细胞的共培养，发现二氧化硅可以诱导自噬体的产生。培养24 h后，自噬体和溶酶体的共定位减少，自噬流动受到抑制，ROS的产生也减少。当添加ML385（NRF2 抑制剂）时，自噬体和溶酶体的共定位增强，自噬流量也增强，ROS也相应增加（图4）。

IHC分析肺腺癌组织中VDAC1、CDK1、p62和NRF2的表达
如 图5所示， NRF2 （ML385的抑制靶点）、 CDK1 （与细胞周期相关）、 VDAC1 （参与线粒体氧化应激）和 p62 （参与自噬）在肺腺癌组织中高表达，与邻近组织相比表现出显着差异。

二氧化硅与RAW264.7细胞共孵育的ML385和上清液对A549细胞迁移和侵袭的影响
二氧化硅和RAW264.7细胞培养上清液可以促进A549细胞的迁移和增殖，而ML385可以显着抑制这些过程（如 图6所示）。这一结果表明，二氧化硅诱导的巨噬细胞微环境的肿瘤促进作用取决于 NRF2 通路。抑制 NRF2 可以有效阻断这种促瘤作用，从而减少肿瘤细胞的恶性进展。

二氧化硅和ML385对A549细胞细胞凋亡的影响
图7 显示，二氧化硅和RAW264.7细胞培养上清液对A549细胞凋亡有一定的抑制作用，ML385可以促进A549细胞凋亡。

这项研究揭示了使用 体内 和 体外 方法通过 ROS/NRF2/自噬轴促进肺腺癌恶性进展的机制途径。动物实验证实， NRF2 信号通路的关键分子在二氧化硅诱导的肺纤维化微环境中被显著激活。细胞实验表明，二氧化硅直接抑制巨噬细胞中的自噬通量并降低ROS水平，并且这种作用可以通过 NRF2 抑制剂ML385特异性逆转。机制研究表明，二氧化硅处理的巨噬细胞通过分泌因子促进肺腺癌细胞的迁移、侵袭和抑制细胞凋亡，而这种肿瘤促进作用完全依赖于NRF2通路的激活。

数据可用性：
支持本文结论的数据集包含在文章中。

图1：在小鼠中构建二氧化硅模型。 （A）用不同体积（10μL，30μL，50μL，70μL，90μL和200μL）的二氧化硅（30mg / mL）鼻吸入小鼠。每次吸入剂量20只小鼠。（B）小鼠存活曲线。最大吸入量为 70 μL/天。（C）二氧化硅组和PBS组小鼠第3天、第14天和第40天肺组织病理学HE染色的观察结果。（D）低倍率下观察到的小鼠肺结节数量的统计结果，t检验，***p <0.001，p= 0.004，t = 10.61（第14天），p = 0.0006，t = 10.02（第40天）。N =9。误差线显示标准误差。 请点击此处查看此图的大图。

图2：通过荧光染色观察小鼠结节组织中的免疫细胞浸润。 免疫细胞（CD3e+、CD8a+、CD86+、F4/80+和NK1.1+）在二氧化硅诱导的小鼠肺结节中高浸润。 请点击此处查看此图的大图。

图3：通过免疫组织化学（IHC）和马森染色分析 NRF2、CDK1、VDAC1 和二氧化硅诱导的纤维化的表达之间的关系。 （A） NRF2、CDK1和 VDAC1 的表达，以及马森染色的结果。（B） IHC 的结果。（C）对二氧化硅组和PBS组小鼠进行肺纤维化统计分析。t 检验，***p <0.001，p =0.0002，t =13.42 （NRF2），p=0.0008，t =9.247 （CDK1），p =0.0009，t =8.944 （VDAC1），p =0.0003，t =11.76（肺纤维化）。N =9。误差线显示标准误差。 请点击此处查看此图的大图。

图4：二氧化硅对RAW264.7细胞自噬的影响以及 NRF2 抑制剂ML385的自噬调节作用。 （A）将二氧化硅与RAW264.7细胞共孵育24小时后，自噬体（LC3）和溶酶体的共定位降低（绿色）。然而，在添加ML385后，自噬体和溶酶体的共定位增加（黄色）。（B）将二氧化硅与RAW264.7细胞共孵育24 h后，二氧化硅组产生的ROS减少，但添加ML385后增加。（C）两组ROS和自噬通量统计分析，t检验，***p <0.001，p =0.0005，t =10.59（ROS），p <0.0001，t =17.08（自噬溶酶体）。N =6。误差线显示标准误差。 请点击此处查看此图的大图。

图5：人肺腺癌组织中VDAC1，CDK1，p62和NRF2表达的免疫组织化学分析。（A）人肺腺癌组织与邻近非癌组织之间的差异表达（VDAC1，CDK1，p62和NRF2）。（B）南京医科大学附属淮安市第一人民医院30例癌与邻近非癌组织差异表达的统计学分析，t检验，***p <0.001，p <0.0001，t =8.322（CDK1），p <0.0001，t =16.4（NRF2），p <0.0001，t =15.47（p62），p <0.0001，t =17.75（VDAC1）。N =30。误差线显示标准误差。（C）肺腺癌组织及邻近非癌组织纤维化的统计分析，t检验，***p <0.001，p =0.0009，t =8.854（纤维化）。N =30。误差线显示标准误差。请点击此处查看此图的大图。

图6：二氧化硅与RAW264.7细胞共孵育的ML385和上清液与肺腺癌细胞系A549孵育后对细胞迁移和侵袭的影响。 （A）上清液和ML385与A549细胞共孵育后第0天和第7天的细胞划痕结果。（B）上清液和ML385与A549细胞共孵育后第7天的细胞侵袭结果。（C）对细胞划痕检测结果进行统计分析。*第 <0.05 页，**第 <0.01 页。t 检验，p =0.0020，t =22.43（二氧化硅+ML385 与二氧化硅），p =0.0135，t =8.510（二氧化硅+ML385 与 PBS），p =0.0143，t =8.281（二氧化硅与 PBS）。N =6。误差线显示标准误差。（D）对细胞侵袭检测结果进行统计分析。*p <0.05，**p <0.01，t 检验，p =0.0097，t =10.06（二氧化硅+ML385 与二氧化硅），p =0.0472，t =4.437（二氧化硅+ML385 与 PBS），p =0.0125，t =8.857（二氧化硅与 PBS）。N =6。误差线显示标准误差。 请点击此处查看此图的大图。

图7：通过流式细胞术分析二氧化硅和ML385对A549细胞细胞凋亡的影响。 （A）通过流式细胞术检测A549细胞的凋亡结果。（B） 对细胞亡细胞的百分比进行统计分析。*p <0.05，**p <0.01，t 检验，p =0.0013，t =27.29（二氧化硅+ML385 与二氧化硅），p =0.0022，t =6.973（二氧化硅+ML385 与 PBS），p =0.0048，t =5.649（二氧化硅与 PBS）。N =6。误差线显示标准误差。 请点击此处查看此图的大图。

作者没有什么可透露的。