本研究采用动物和细胞模型，探究NRF2抑制剂ML385是否通过ROS/NRF2-自噬轴通路减弱二氧化硅诱导的肺腺癌恶性进展。
本研究采用动物和细胞模型，探究NRF2抑制剂ML385是否通过ROS/NRF2-自噬轴通路减弱二氧化硅诱导的肺腺癌恶性进展。
二氧化硅暴露与肺腺癌风险增加相关，但其分子机制尚不明确。本研究旨在建立一种可重复的实验方案，以探究核因子红系2相关因子2（NRF2抑制剂ML385通过调控ROS/NRF2-自噬轴通路抑制二氧化硅诱导的肺腺癌恶性进展。首先，通过向C57BL/6小鼠鼻内灌注二氧化硅悬浮液建立矽肺模型。采用Masson染色评估肺纤维化程度，免疫荧光分析免疫细胞浸润情况，并检测相关分子表达水平 NRF2，细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1，以及电压依赖性阴离子通道1（VDAC1) 在肺组织中的表达通过免疫组织化学法进行检测。随后，在 体外 实验中，用二氧化硅处理RAW264.7巨噬细胞系。通过LC3-溶酶体共定位和ROS探针评估自噬流和氧化应激水平，并使用以下方法进行干预： NRF2 抑制剂ML385。最后，通过划痕实验、特定大小孔径穿膜实验和流式细胞术分析ML385对肺腺癌细胞迁移、侵袭和凋亡的影响。结果表明，二氧化硅可诱导肺纤维化、免疫细胞浸润以及上调 NRF2, CDK1, 和 VDAC1 在小鼠中（p < 0.001），并抑制巨噬细胞的自噬流，降低活性氧水平。ML385可逆转这些效应（p < 0.05）。本方案提供了一个从 体内 模型构建至 体外 机制研究，为探索硅相关肺腺癌的分子机制及靶向治疗策略提供了可操作的技术路径 NRF2.
肺腺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，每年约有200万例新发病例和176万例死亡病例1。近年来，从未吸烟人群中肺腺癌的发病率呈上升趋势，这可能与空气污染等环境因素有关2。二氧化硅是一种常见的环境污染物，已被确认为人类肺腺癌的潜在致病因素3。二氧化硅可引起持续性慢性炎症，导致巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞浸润，并促进活性氧和炎症因子的释放4。这种长期存在的炎症微环境促进了肺腺癌的发生5,6。尽管二氧化硅暴露与肺腺癌之间的关联已得到证实，但其具体的分子机制尚未完全阐明。
转录因子NRF2由NFE2L2基因编码，在应对氧化应激时作为关键调控因子，在维持细胞氧化还原稳态中发挥重要作用7,8。在正常情况下，NRF2被KEAP1-CUL3泛素连接酶复合物标记并降解。在氧化应激或亲电物质刺激下，KEAP1的活性受到抑制，使NRF2得以稳定积累并进入细胞核，从而发挥其....
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所有供体组织块均来自南京医科大学附属淮安市第一人民医院于2016年至2018年间收集的病理存档标本。样本在使用前均已去标识化，并按照批准的方案进行处理。本研究经南京医科大学附属淮安市第一人民医院伦理委员会批准（批准号：KY-2024-250-01）。实验小鼠的繁育、处置和使用严格遵循《实验动物管理条例》及国际实验动物使用指南。
构建二氧化硅诱导的小鼠模型
小鼠及二氧化硅悬浮液的制备：将6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠饲养于动物房中，室温保持在20-25 °C，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。制备硅尘悬浮液时，精确称取300 mg硅尘粉末，悬浮于10 mL无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。随后剧烈涡旋振荡5分钟，再于水浴超声仪中进行超声处理30分钟，以确保颗粒均匀分散并防止聚集。该储备悬浮液的最终浓度为30 mg/mL。在121 °C条件下高压灭菌30分钟以实现灭菌。每次使用前需再次涡旋并震荡2-3分钟，以重新悬浮可能沉降的颗粒。
小鼠通过鼻腔吸入二氧化硅悬液。使用微量移液器将溶液缓慢地逐滴注入小鼠鼻腔。将小鼠分为6组，每组20只。各组吸入体积分别为10 µL、30 µL、50 µL、70 µL、90 µL和200 µL，浓度为30 mg/mL，每天一次，连续40天。灌注时，用左手拇指和食指捏住小鼠耳后皮肤，其余手指固定小鼠身体和尾巴。确保小鼠呈仰卧位，头部稍向后仰，使....
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二氧化硅小鼠模型
在 图1 中，小鼠通过鼻内给予二氧化硅，剂量为 30 mg/mL，每次 70 µL，连续给药 40 天，确保小鼠无死亡事件发生，且成功建立二氧化硅小鼠模型。同时，以经口灌胃 PBS 的小鼠作为阴性对照。目的是消除操作过程及溶剂本身对实验结果的影响，确保表型由二氧化硅特异性诱导。该二氧化硅诱导肺损伤模型的成功复制，为后续研究恶性进展机制及药物干预提供了必要的 体内 研究基础。
二氧化硅诱导小鼠结节中免疫细胞浸润的分析
在 图2 中，通过检测二氧化硅小鼠结节中的免疫细胞浸润情况，发现结节内存在大量免疫细胞浸润（CD3e+、CD8a+、CD86+、F4/80+ 和 Nk1.1+ 细胞），这些细胞参与了矽肺疾病的形成与发展。这表明二氧化硅可诱导产生持续性炎症的肿瘤微环境，该微环境是肿瘤发生与发展的关键促进因素，也是 ROS/NRF2 通路参与的病理生理基.......
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肺腺癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其发病率和死亡率逐年上升17。国际癌症研究机构将二氧化硅归类为1类人类致癌物，肺腺癌的风险随职业性累积暴露而增加18,19,20,21。既往研究表明，二氧化硅可能通过引发氧化应激和慢性炎症激活肺纤维化，而NRF2信号通路在氧化损伤中发挥关键作用12,22,23。然而，NRF2在二氧化硅诱导的发病机制中的作用及机制仍尚未完全阐明。
本研究通过构建矽肺小鼠模型并结合体外细胞实验，探讨了二氧化硅暴露通过NRF2/自噬通路促进肺纤.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
感谢团队成员对本研究的支持与贡献。本研究得到安徽省高校工业粉尘深度减排与职业健康安全重点实验室（编号：AYZJSGXLK202202006）和上海市浦东新区人民医院人才引进启动基金（编号：PRYYH202501）的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BeyoGold Transwell | Beyotime Biotechnology | FTW067-48lns | Transwell |
| CD3e | BD Bioscience | 561827 | 异硫氰酸荧光素仓鼠抗小鼠 CD3e(145-2C11) |
| CD86 | BD Bioscience | 105013 | CD86 |
| CD8a | BD Bioscience | 100713 | CD8a |
| CDK1 | Abcam | ab133327 | 抗-CDK1 |
| 细胞凋亡检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C1062L | 凋亡检测 |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131-25ml | DAPI |
| 包埋机 | P.S.J MEDICAL | BM450A | 包埋机 |
| F4/80 | BD Bioscience | 123109 | F4/80 |
| 全自动组织脱水机 | Leica Biosystems | ASP3005 | 全自动组织脱水机 |
| 玻璃载玻片 | Citotest | 250124A1 | 玻璃显微镜载玻片 |
| 苏木精 & 伊红染液 | Beyotime Biotechnology | C0105M | 苏木精 & 伊红染液 |
| 免疫组化试剂盒 | Absin Biotechnology | abs996-5ml | 免疫组化试剂盒 |
| LC3 探针 | Beyotime Biotechnology | C3018M | LC3 探针 |
| 低剖面切片刀 | Thermo Fisher | 3052835 | 低剖面切片刀 |
| 溶酶体探针 | Beyotime Biotechnology | C1046 | 溶酶体探针 |
| 记号笔 | Deli | SK109 | 记号笔 |
| 马松染液 | Beyotime Biotechnology | C0189M | 马松染液 |
| 基质胶 | Beyotime Biotechnology | C0371-5ml | 基质黏合剂 |
| 切片机 | Leica Biosystems | HistoCore BIOCUT | 切片机 |
| ML385 | Abcam | ab287109 | NRF2 抑制剂 |
| NK1.1 | BD Bioscience | 561117 | NK1.1 |
| NRF2 | Abcam | ab1809Y | 抗-NRF2 |
| p62 | Abcam | ab20735 | 抗-p62 |
| 石蜡 | Solarbio | YA0012 | 石蜡 |
| 活性氧检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | S0033M | ROS 探针 |
| 二氧化硅 | Sigma Aldrich | S5631 | 结晶型二氧化硅 |
| VDAC1 | Abcam | ab34726 | 抗-VDAC1 |
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