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ML385通过ROS/NRF2-自噬轴通路抑制二氧化硅诱导的肺腺癌细胞恶性进展

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DOI：

10.3791/69382

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2025年10月31日

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1School of Medicine, Anhui University of Science and Technology, 2Department of Medical Laboratory, Huaian Hospital of Huaian City, 3Department of Pathology, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Medical Laboratory, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Pediatrics, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 6Department of Anesthesiology, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 7Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes, 8Department of Blood Transfusion, Shanghai Pudong New Area People's Hospital

本文内容

摘要

本研究采用动物和细胞模型，探究NRF2抑制剂ML385是否通过ROS/NRF2-自噬轴通路减弱二氧化硅诱导的肺腺癌恶性进展。

摘要

二氧化硅暴露与肺腺癌风险增加相关，但其分子机制尚不明确。本研究旨在建立一种可重复的实验方案，以探究核因子红系2相关因子2（NRF2抑制剂ML385通过调控ROS/NRF2-自噬轴通路抑制二氧化硅诱导的肺腺癌恶性进展。首先，通过向C57BL/6小鼠鼻内灌注二氧化硅悬浮液建立矽肺模型。采用Masson染色评估肺纤维化程度，免疫荧光分析免疫细胞浸润情况，并检测相关分子表达水平 NRF2，细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1，以及电压依赖性阴离子通道1（VDAC1) 在肺组织中的表达通过免疫组织化学法进行检测。随后，在 体外 实验中，用二氧化硅处理RAW264.7巨噬细胞系。通过LC3-溶酶体共定位和ROS探针评估自噬流和氧化应激水平，并使用以下方法进行干预： NRF2 抑制剂ML385。最后，通过划痕实验、特定大小孔径穿膜实验和流式细胞术分析ML385对肺腺癌细胞迁移、侵袭和凋亡的影响。结果表明，二氧化硅可诱导肺纤维化、免疫细胞浸润以及上调 NRF2, CDK1, 和 VDAC1 在小鼠中（p < 0.001），并抑制巨噬细胞的自噬流，降低活性氧水平。ML385可逆转这些效应（p < 0.05）。本方案提供了一个从 体内 模型构建至 体外 机制研究，为探索硅相关肺腺癌的分子机制及靶向治疗策略提供了可操作的技术路径 NRF2.

引言

肺腺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，每年约有200万例新发病例和176万例死亡病例1。近年来，从未吸烟人群中肺腺癌的发病率呈上升趋势，这可能与空气污染等环境因素有关2。二氧化硅是一种常见的环境污染物，已被确认为人类肺腺癌的潜在致病因素3。二氧化硅可引起持续性慢性炎症，导致巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞浸润，并促进活性氧和炎症因子的释放4。这种长期存在的炎症微环境促进了肺腺癌的发生5,6。尽管二氧化硅暴露与肺腺癌之间的关联已得到证实，但其具体的分子机制尚未完全阐明。

转录因子NRF2由NFE2L2基因编码，在应对氧化应激时作为关键调控因子，在维持细胞氧化还原稳态中发挥重要作用7,8。在正常情况下，NRF2被KEAP1-CUL3泛素连接酶复合物标记并降解。在氧化应激或亲电物质刺激下，KEAP1的活性受到抑制，使NRF2得以稳定积累并进入细胞核，从而发挥其核心的防御与调控作用9。然而，在肿瘤微环境中NRF2的过度激活可能通过抑制活性氧（ROS）的积累并增强抗凋亡能力，促进糖酵解和肿瘤细胞的存活10,11。研究已证实，二氧化硅暴露可导致NRF2信号通路的异常激活12,13。因此，靶向NRF2可能是干预二氧化硅诱导的肺腺癌恶性进展的有效策略14。

本研究旨在阐明NRF2抑制剂ML385是否通过调控ROS/NRF2-自噬轴通路抑制二氧化硅诱导的肺腺癌恶性进展。我们建立了二氧化硅诱导的小鼠模型，以重现该疾病的关键特征，并采用体外实验方法研究巨噬细胞与肿瘤细胞之间的相互作用。研究发现，二氧化硅可诱导炎症和免疫分子的表达，并进一步通过ROS/NRF2-自噬轴通路促进肿瘤形成。当使用NRF2抑制剂（ML385）时，二氧化硅对肿瘤形成的促进作用减缓，提示NRF2抑制剂可能在二氧化硅诱导的肺部肿瘤治疗中发挥一定作用。

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方案

所有供体组织块均来自南京医科大学附属淮安市第一人民医院于2016年至2018年间收集的病理存档标本。样本在使用前均已去标识化，并按照批准的方案进行处理。本研究经南京医科大学附属淮安市第一人民医院伦理委员会批准（批准号：KY-2024-250-01）。实验小鼠的繁育、处置和使用严格遵循《实验动物管理条例》及国际实验动物使用指南。

构建二氧化硅诱导的小鼠模型
小鼠及二氧化硅悬浮液的制备：将6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠饲养于动物房中，室温保持在20-25 °C，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。制备硅尘悬浮液时，精确称取300 mg硅尘粉末，悬浮于10 mL无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。随后剧烈涡旋振荡5分钟，再于水浴超声仪中进行超声处理30分钟，以确保颗粒均匀分散并防止聚集。该储备悬浮液的最终浓度为30 mg/mL。在121 °C条件下高压灭菌30分钟以实现灭菌。每次使用前需再次涡旋并震荡2-3分钟，以重新悬浮可能沉降的颗粒。

小鼠通过鼻腔吸入二氧化硅悬液。使用微量移液器将溶液缓慢地逐滴注入小鼠鼻腔。将小鼠分为6组，每组20只。各组吸入体积分别为10 µL、30 µL、50 µL、70 µL、90 µL和200 µL，浓度为30 mg/mL，每天一次，连续40天。灌注时，用左手拇指和食指捏住小鼠耳后皮肤，其余手指固定小鼠身体和尾巴。确保小鼠呈仰卧位，头部稍向后仰，使悬液可自然吸入呼吸道。我们发现，小鼠吸入10 µL、30 µL、50 µL和70 µL二氧化硅悬液后，第二天起未发生死亡事件；而吸入90 µL和200 µL二氧化硅悬液的小鼠在第二天后出现死亡事件。因此，小鼠每日二氧化硅吸入的最大耐受体积为70 µL。

处理结晶型二氧化硅时，必须在生物安全柜或通风橱中进行，并全程佩戴N95口罩、防尘护目镜、丁腈手套和防护服。配制悬液时动作应轻柔，使用称量室以避免产生气溶胶。所有接触过二氧化硅的废弃物应收集于具有防刺穿性能的密闭容器中，并按照危险化学废弃物的规定进行处置，严禁与普通垃圾混合或倒入下水道。生物废弃物（如细胞培养基）应收集于含有消毒剂的专用垃圾桶中，并经高压灭菌处理。动物尸体和组织应置于生物废弃物袋中，经高压灭菌后进行无害化处理。

评估二氧化硅诱导的小鼠模型构建的成功性。在二氧化硅吸入后的不同时间点（即第3天、第14天和第40天）对动物进行评估。将小鼠置于专业的动物安乐死装置中，以每分钟30%-50%体积的充气速率通入二氧化碳，持续暴露直至呼吸停止。确认死亡后，进行后续操作。取出肺组织，将其在室温下用4%多聚甲醛溶液固定48小时。固定后，组织经梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理，随后进行石蜡包埋。使用石蜡切片机连续切片，厚度为4-5 µm，用于后续的组织学染色和免疫组化分析。肺组织无需脱钙处理。通过肺组织病理学检查评估模型构建是否成功。矽肺模型构建的成功标准如下：明显的肺部炎症、纤维化以及矽结节的形成。

二氧化硅诱导小鼠模型中免疫细胞浸润的分析
在小鼠吸入二氧化硅后第14天，采集肺组织，使用含CD3e（1:200稀释比例）、CD8a（1:200稀释比例）、CD86（1:200稀释比例）、F4/80（1:200稀释比例）和Nk1.1（1:200稀释比例）的荧光标记物进行染色，以可视化免疫细胞。固定细胞或组织切片后，用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时，以减少非特异性结合。使用与二抗同源物种的正常血清，按1:10比例用PBS稀释，向样本中加入100 µL稀释后的血清。然后在室温下封闭30分钟，使血清封闭内源性抗体。封闭后，用PBS轻轻漂洗2次。加入含CD3e（1:200稀释比例）、CD8a（1:200稀释比例）、CD86（1:200稀释比例）、F4/80（1:200稀释比例）和Nk1.1（1:200稀释比例）的一抗，在4 °C过夜或室温孵育1–2小时。用PBS洗涤后，加入荧光标记的二抗，避光孵育1小时。

Masson染色与免疫组织化学分析
石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后，在pH 6.0的柠檬酸钠缓冲液中通过高压热修复进行抗原修复。高压热修复操作：将浸泡在修复液中的组织切片置于微波炉中，中火加热8–12分钟。使用3%过氧化氢溶液在室温下孵育20分钟以阻断内源性过氧化物酶活性，随后用5% BSA在室温下封闭非特异性结合位点30分钟。加入一抗 NRF2（1:200）、CDK1（1:400）和 VDAC1（1:500），4 °C孵育过夜。用PBS洗涤3次后，加入HRP标记的羊抗兔二抗（1:500），室温孵育1小时。石蜡切片经DAB显色、苏木精复染、脱水透明处理，中性树胶封片，获得相应的分子免疫组织化学结果。使用DAB显色时，适度的显色应为黄褐色至棕褐色，背景清晰。显色过深（深棕色）或过浅（浅黄色）均需优化显色时间。

采用Ashcroft评分法对肺纤维化的程度进行半定量分析15：在100倍显微镜下观察Masson染色切片，将肺组织随机分为8个区域。根据每个区域纤维化程度进行评分（0–8分），最终得分为所有区域的平均值：0分为正常肺组织，1–2分为轻度纤维化，3–4分为中度纤维化，5–8分为重度纤维化。

使用Image软件对免疫组织化学结果进行定量分析。随机选取五个高倍视野，测定每个视野的平均光密度值（MOD），作为蛋白表达水平的指标。

研究二氧化硅和ML385对RAW264.7细胞自噬和活性氧的影响
RAW264.7细胞和A549细胞（由安徽科技大学提供）均使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素双抗溶液的DMEM高糖培养基进行培养。将1 × 107个细胞置于37 °C、5% CO2的恒温培养箱中均匀培养。向每毫升含1 × 105个RAW264.7细胞的培养液中加入5 µL浓度为30 mg/mL的二氧化硅悬浮液。孵育24小时后，用PBS洗涤细胞3次，并利用ROS、LC3和溶酶体探针检测自噬和氧化应激水平。同时，使用NRF2抑制剂ML38516抑制NRF2的表达（ML385终浓度为5 mM/L），并按照上述实验步骤检测自噬和氧化应激水平。对两组的氧化应激和自噬流数据进行统计分析。

肺腺癌组织中VDAC1、CDK1、p62和NRF2表达的免疫组化分析
在30例患者中检测了VDAC1、CDK1、p62和NRF2的表达 。肺腺癌组织及相邻正常肺组织来自南京医科大学附属淮安市第一人民医院，采用免疫组化（IHC）方法进行分析。对IHC结果与肺纤维化情况进行统计学分析。根据医院系统中的患者信息收集临床资料。具体实验步骤如下：石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后，在pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中通过高压热修复进行抗原修复。使用3%过氧化氢溶液室温孵育20分钟以阻断内源性过氧化物酶活性，随后用5% BSA在室温下封闭非特异性结合位点30分钟。加入一抗NRF2（1:200）、CDK1（1:400）、p62（1:500）和VDAC1（1:500），4 °C孵育过夜。PBS洗涤3次后，加入HRP标记的羊抗兔二抗（1:500），室温孵育1小时。DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。使用DAB显色时，适度的显色结果应为浅黄褐色至棕褐色，背景清晰。显色过深（深棕色）或过浅（淡黄色）均需优化显色时间。

细胞迁移与侵袭分析
研究了 ML385 以及二氧化硅与 RAW264.7 细胞共孵育后的上清液对肺腺癌细胞系 A549 细胞迁移和侵袭能力的影响。将二氧化硅与 RAW264.7 细胞共培养 24 小时后的上清液加入 A549 细胞中。实验分为二氧化硅组、二氧化硅+ML385 组和 PBS 组。二氧化硅组：向 1 × 105 个细胞/mL 的 RAW264.7 细胞中加入 5 µL 浓度为 30 mg/mL 的二氧化硅悬液，37℃孵育 24 小时后，收集细胞上清液备用。二氧化硅+ML385 组：向 1 × 105 个细胞/mL 的 RAW264.7 细胞中加入 5 µL 浓度为 30 mg/mL 的二氧化硅悬液及终浓度为 5 mM/L 的 ML385，37℃孵育 24 小时后，收集细胞上清液备用。PBS 组：向 1 × 105 个细胞/mL 的 RAW264.7 细胞中加入 5 µL PBS，37℃孵育 24 小时后，收集细胞上清液备用。在划痕实验中，首先将 A549 细胞以每孔 5 × 105 的密度接种于 12 孔板中。待细胞生长至融合度达 95%–100% 时，使用 200 µL 无菌移液枪头在单层细胞表面制造划痕，随后用 PBS 轻柔洗涤去除脱落的细胞。接着更换为含 1% FBS 的基础培养基，并加入各处理组的上清液，以维持细胞在为期 7 天的实验期间的活性。分别在划痕后 0 小时（第 0 天）和第 7 天（第 7 天）使用倒置显微镜采集相同位置的图像。最后，使用 ImageJ 软件对划痕区域进行定量分析，计算划痕闭合率，以评估不同处理组上清液对 A549 细胞迁移能力的影响。

在细胞通过特定尺寸孔径的侵袭实验中，使用了带有8 µm聚碳酸酯膜的Transwell小室，上室膜预先涂覆按1:8比例稀释的凝胶以模拟细胞外环境，构建基底膜屏障。将A549细胞重悬于由无血清培养基与各处理组上清液按1:1比例混合制成的悬浮液中，接种至上室（每室2 × 104个细胞）。下室中加入含20%胎牛血清（FBS）的培养基与相应处理组（Silica+ML385组、Silica组和PBS组）上清液按相同比例混合的溶液作为化学趋化因子。相应处理组的上清液通过移液枪在RAW264.7细胞吞噬二氧化硅后吸出收集。细胞在37 °C、5% CO2条件下连续培养7天后，用棉签擦去上室中未侵袭的细胞，对穿过膜并到达下室的细胞用4%多聚甲醛固定，并用0.1%结晶紫染色。最后，在光学显微镜下随机选取5个视野统计侵袭细胞数量。

利用流式细胞术分析二氧化硅和ML385对A549细胞凋亡的影响
细胞准备与分组：收集经各处理组（PBS组、二氧化硅组、二氧化硅+ML385组）上清液处理的A549细胞。用预冷的PBS轻柔洗涤细胞2次，随后重悬于1×结合缓冲液中，并将细胞密度调整为每管100 µL含1 × 106 个细胞。然后向细胞悬液中加入5 µL Annexin V-FITC和5 µL PI染色液，轻轻涡旋混匀，室温避光孵育15分钟。孵育结束后，每管加入400 µL 1×结合缓冲液，立即上机检测。使用流式细胞仪进行检测，以488 nm激光激发，通过FITC通道收集Annexin V-FITC的荧光信号，通过PE通道收集PI的荧光信号。实验前使用单染样本进行荧光补偿调节，以消除光谱重叠。数据分析时，首先在FSC-A/SSC-A散点图中圈定目标细胞群并排除碎片；随后利用FSC-H/FSC-A散点图排除细胞黏连；最后设门区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡/坏死细胞以及机械损伤细胞。数据采用FlowJo V10软件获取并分析。

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结果

二氧化硅小鼠模型
在 图1 中，小鼠通过鼻内给予二氧化硅，剂量为 30 mg/mL，每次 70 µL，连续给药 40 天，确保小鼠无死亡事件发生，且成功建立二氧化硅小鼠模型。同时，以经口灌胃 PBS 的小鼠作为阴性对照。目的是消除操作过程及溶剂本身对实验结果的影响，确保表型由二氧化硅特异性诱导。该二氧化硅诱导肺损伤模型的成功复制，为后续研究恶性进展机制及药物干预提供了必要的 体内 研究基础。

二氧化硅诱导小鼠结节中免疫细胞浸润的分析
在 图2 中，通过检测二氧化硅小鼠结节中的免疫细胞浸润情况，发现结节内存在大量免疫细胞浸润（CD3e+、CD8a+、CD86+、F4/80+ 和 Nk1.1+ 细胞），这些细胞参与了矽肺疾病的形成与发展。这表明二氧化硅可诱导产生持续性炎症的肿瘤微环境，该微环境是肿瘤发生与发展的关键促进因素，也是 ROS/NRF2 通路参与的病理生理基...

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讨论

肺腺癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其发病率和死亡率逐年上升17。国际癌症研究机构将二氧化硅归类为1类人类致癌物，肺腺癌的风险随职业性累积暴露而增加18,19,20,21。既往研究表明，二氧化硅可能通过引发氧化应激和慢性炎症激活肺纤维化，而NRF2信号通路在氧化损伤中发挥关键作用12,22,23。然而，NRF2在二氧化硅诱导的发病机制中的作用及机制仍尚未完全阐明。

本研究通过构建矽肺小鼠模型并结合体外细胞实验，探讨了二氧化硅暴露通过NRF2/自噬通路促进肺纤...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢团队成员对本研究的支持与贡献。本研究得到安徽省高校工业粉尘深度减排与职业健康安全重点实验室（编号：AYZJSGXLK202202006）和上海市浦东新区人民医院人才引进启动基金（编号：PRYYH202501）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BeyoGold TranswellBeyotime Biotechnology FTW067-48lnsTranswell
CD3eBD Bioscience561827异硫氰酸荧光素仓鼠抗小鼠 CD3e(145-2C11)
CD86BD Bioscience105013CD86
CD8aBD Bioscience100713CD8a
CDK1Abcamab133327抗-CDK1
细胞凋亡检测试剂盒Beyotime Biotechnology C1062L凋亡检测
DAPIBeyotime Biotechnology P0131-25mlDAPI
包埋机P.S.J MEDICALBM450A包埋机
F4/80BD Bioscience123109F4/80
全自动组织脱水机Leica BiosystemsASP3005全自动组织脱水机
玻璃载玻片Citotest250124A1玻璃显微镜载玻片
苏木精 & 伊红染液Beyotime Biotechnology C0105M苏木精 & 伊红染液
免疫组化试剂盒Absin Biotechnologyabs996-5ml免疫组化试剂盒
LC3 探针Beyotime Biotechnology C3018MLC3 探针
低剖面切片刀Thermo Fisher3052835低剖面切片刀
溶酶体探针Beyotime Biotechnology C1046溶酶体探针
记号笔DeliSK109记号笔
马松染液Beyotime Biotechnology C0189M马松染液
基质胶Beyotime Biotechnology C0371-5ml基质黏合剂
切片机Leica BiosystemsHistoCore BIOCUT切片机
ML385Abcamab287109NRF2 抑制剂
NK1.1BD Bioscience561117NK1.1
NRF2Abcamab1809Y抗-NRF2
p62Abcamab20735抗-p62
石蜡SolarbioYA0012石蜡
活性氧检测试剂盒Beyotime Biotechnology S0033MROS 探针
二氧化硅Sigma AldrichS5631结晶型二氧化硅
VDAC1Abcamab34726抗-VDAC1

参考文献

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