本文介绍了一种用于持续观察甲病毒（alphavirus）感染的稳健且可调的实验方案。该方案基于荧光成像技术，可在细胞水平上研究甲病毒的复制过程，并评估抗病毒化合物的效力。
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摘要
摘要
荧光显微镜技术为在细胞水平上研究甲病毒（alphavirus）感染提供了一种高度敏感且用途广泛的方法。通过将荧光标记的病毒与定量图像分析相结合，该方法能够对感染动态进行详细的空间和时间表征，包括检测复制动力学和细胞间传播中的细微差异。本实验方案的核心目标之一是应用于抗病毒药物筛选实验。基于图像的荧光强度定量分析为评估抗病毒化合物的效力提供了可靠且可重复的手段，能够在感染细胞中早期、灵敏地检测到抑制效应。这有助于识别具有潜力的抗病毒候选分子，并支持剂量依赖性反应的评估。该方法同样适用于不同甲病毒株或突变体的比较研究，因为其在复制行为和扩散模式上的差异可被清晰观察到。该方法具有良好的灵活性，可兼容多种细胞系，并能简便地整合到自动化成像平台中，因而具备可扩展性，适用于高通量筛选项目。总体而言，本实验方案推动了抗病毒策略的发现与评估。鉴于多种甲病毒可引起严重的人类及动物疾病，目前尚无获批的抗病毒疗法，且随着新发疫情的出现，其地理分布持续扩大，因此发现新型抗病毒药物仍是一项紧迫的优先任务。因此，这一基于荧光的实验流程为现代甲病毒研究提供了重要且及时的技术支持。
引言
甲病毒是披膜病毒科（Togaviridae）的有包膜、正义单链核糖核酸（RNA）病毒1,2,3。它们主要通过蚊子传播，可导致人类和动物多种疾病。甲病毒属包括多种具有重要医学意义的病毒，例如基孔肯雅病毒（CHIKV）、辛德比斯病毒、东部马脑炎病毒和委内瑞拉马脑炎病毒4,5。这些病原体引起的症状从发热性疾病和皮疹到严重的神经系统并发症不等6。令人担忧的是，基孔肯雅病毒已重新成为重大的公共卫生问题。仅自2025年初以来，已有14个国家报告了超过22万例病例，导致至少80人死亡7。尽管其死亡率较低，但相当一部分感染者会发展为慢性关节疼痛，可能导致长期残疾和活动能力下降8。为了开发靶向抗病毒策略，必须更全面地了解甲病毒的复制机制以及病毒与宿主之间的相互作用。与此同时，某些甲病毒（如塞姆利基森林病毒，SFV）尽管在基因和结构上与其他高致病性甲病毒高度相似，但在人类中致病性较低。这使得SFV成为研究甲病毒的理想模型，且对人类健康风险较小9,10,11。
传统的检测方法，如噬斑检测、50%组织培养感染剂量（TCID50）检测和定量聚合酶链式反应（qPCR）分析，在定量病毒滴度和基因表达方面具有重要价值，但仅限于终点检测，且需要裂解或固定细胞。因此，这些方法无法直接在同一细胞群体中动态监测感染过程随时间的变化12,13。为克服这些局限性，实时荧光成像提供了一种强大且非破坏性的方法，可用于在多个时间点监测感染动力学。通过使用荧光标记的病毒（例如mCherry标记的SFV），可直接可视化并定量报告病毒信号及其在活细胞中的传播14,15。在本研究所描述的实验中，采用了虫媒病毒研究中常用的细胞系。U4.4细胞源自白纹伊蚊（Aedes albopictus）幼虫，是一种蚊源细胞，能够有效支持多种虫媒病毒的复制，有助于开展媒介-病毒相互作用的研究16,17。同时，BHK-21细胞是一种来源于幼仓鼠肾组织的成纤维细胞样哺乳动物细胞系，可作为易感的脊椎动物宿主系统，常用于病毒扩增和分子病毒学检测18。
本方案详细描述了病毒报告基因表达的监测以及抗病毒化合物的表征方法，并以弗林蛋白酶抑制剂为例进行说明。弗林蛋白酶是一种存在于多种真核生物中的前体蛋白转化酶，在生长因子、激素、基质金属蛋白酶、血浆蛋白和受体等前体分子的活化过程中发挥关键作用19,20。许多甲病毒利用弗林蛋白酶切割并激活其表面蛋白，这是成功复制的关键步骤20。弗林蛋白酶抑制剂是人工设计的化合物，可抑制弗林蛋白酶的活性，从而 抑制病毒复制21,22,23。鉴于目前尚缺乏标准化的自动化荧光显微镜分析甲病毒感染的实验流程，尤其是基于细胞成像多功能读板仪的分析方法，本文提供了一套在伊蚊细胞中对抗病毒化合物进行表征的详细操作流程。该方案涵盖了细胞培养、病毒制备、感染处理、抗病毒化合物（弗林蛋白酶抑制剂）处理、荧光成像及图像分析等步骤。然而，本方案所述方法可轻松适用于其他病毒以及不同的荧光标记体系。
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方案
1. 生物安全
注意：本方案中使用的重组mCherry标记的塞姆利基森林病毒（SFV-mCherry）属于基因改造病毒24,25,26。由于携带荧光报告基因，该病毒被归类为基因改造生物，因此需遵守额外的生物安全防护和监管要求。涉及其他甲病毒（尤其是如CHIKV等致病性更强的病毒）的研究工作，可能需要更高级别的生物安全防护措施和相关许可。
- 在进行病毒检测前后，使用适当的消毒剂清洁生物安全柜，并开启紫外线照射至少30分钟。
- 根据当地生物安全规定处理所有被污染的材料。将固体和液体废弃物分别收集于可高压灭菌的容器中，经高压灭菌后再行处置。
2. 抗病毒化合物的制备
注意：本研究中使用的弗林蛋白酶抑制剂 MI-113027 （trans-4-(aminomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide）、MI-113127 （trans-4-(guanidinomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide）和 MI-114822,23 （4-(guanidinomethyl) phenylacetyl-arginine-tert.-leucine-arginine-4-amidinobenzylamide）是所选用于测试的抗病毒化合物的示例。在细胞毒性实验中，弗林蛋白酶抑制剂 MI-1148 用作阴性对照；在抗病毒实验中则用作阳性对照。
- 将抗病毒化合物溶解于适当的溶剂中。尽量使用无菌水以避免细胞毒性。二甲基亚砜或甲醇的使用浓度最高不得超过2%（v/v）。建议使用浓度为10 mM的无菌水储备液。
- 储备液应根据化合物的稳定性和溶解度储存于-20 °C，除非生产商另有说明。
3. 细胞培养
- 在添加了10%胎牛血清（FBS）、1% MEM非必需氨基酸、1%胰蛋白胨磷酸盐肉汤、1%谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素（Pen/Strep）的Leibovitz L-15培养基中培养U4.4细胞（接种密度：约1 × 106 个细胞/T25培养瓶，培养体积：5 mL）。将细胞维持在28 °C条件下。每周以1:6的比例传代一次U4.4细胞，但可根据实验需求调整接种密度。
注意：其他细胞系（如C6/36细胞）也适用于本方案。可根据需要使用替代培养基和添加剂。抗生素的添加为可选步骤，可省略。 - 在添加了10% FBS、1%谷氨酰胺或
‑丙氨酰‑‑谷氨酰胺以及1% Pen/Strep的Dulbecco改良Eagle培养基中培养幼年仓鼠肾（BHK-21）细胞（接种密度：约1 × 106 个细胞/T75培养瓶，培养体积：10 mL）。将细胞置于含5% CO2的湿润化培养箱中，维持在37 °C。每4–5天以1:12的比例传代一次，可根据需要灵活调整接种密度。 - 确保细胞保持健康状态并处于活跃增殖阶段。
4. 病毒生产
- 在BHK-21细胞中制备SFV-mCherry（SFV6-2SG-mCherry）病毒储备液。
- 在透明细胞培养24孔板中，按照上述条件培养BHK-21细胞（接种密度：约1 × 105 个细胞/孔，培养体积：500 µL）。
- 当细胞融合度达到约90%时（目标细胞密度：约2 × 105 个细胞），使用转染试剂在感染培养基（含1%青霉素-链霉素和0.2%牛血清白蛋白的DMEM）中将SFV6-2SG-mCherry质粒转染至BHK-21细胞。具体操作：将1 µL转染试剂溶于25 µL低血清培养基中。
- 另取一管，将0.5 µg质粒DNA和1 µL专有添加剂溶于25 µL低血清培养基中。将稀释后的DNA溶液加入含稀释转染试剂的溶液中，室温孵育15分钟。随后，将50 µL形成的复合物加入细胞中。
注意：可使用其他转染试剂，前提是其与特定细胞系兼容，且操作步骤应根据所用试剂的说明进行相应调整。 - 转染后48小时，用移液器收集含病毒的上清液，按每管250 µL分装至无DNA/RNA酶的离心管中，并于-80 °C保存。
- 通过TCID50法进行病毒滴度测定。
- 在黑色成像级96孔板中，按照上述条件培养BHK-21细胞（接种密度：约2 × 104 个细胞/孔，培养体积：100 µL）。
- 解冻一份病毒储备液，用感染培养基对病毒样品进行10倍系列稀释（15 µL病毒样品 + 135 µL感染培养基），弃去旧培养基，每孔加入100 µL稀释液。
- 将细胞置于含5% CO₂的湿润培养箱中37 °C孵育1小时，之后弃去接种物，每孔更换为100 µL新鲜感染培养基。
- 感染后48小时（hpi），使用多功能成像微孔板读板仪（详见第7节）通过荧光检测评估病毒复制情况，并观察病毒感染引起的细胞病变效应。根据Reed-Muench方法28计算TCID50值，并利用基于泊松分布的标准近似公式（1 TCID50相当于0.7 PFU）换算为估计病毒滴度（PFU/mL）。
5. 细胞毒性测定
- 在透明细胞培养96孔板中，按照上述条件培养U4.4细胞（接种密度：约 3 × 104 个细胞/孔，培养体积：100 µL）。
注意：外周孔（A和H行；1和12列）也接种细胞，但不纳入实验分析，以避免边缘效应（包括蒸发增加）的影响。 - 当细胞融合度达到90%（目标融合度：约 6 × 104 个细胞）时，在总体积为100 µL的条件下，用100、50、25和12.5 µM的furin抑制剂MI-1130和MI-1131处理细胞。同时设置MI-1148（浓度与MI-1130和MI-1131相同）、未处理细胞以及用水处理的细胞作为阴性对照，并以ionomycin（检测中浓度为100 µM）作为细胞毒性阳性对照。
- 处理后48小时（hpt），采用基于ATP定量的发光法检测细胞活力。向每孔加入等体积的发光检测试剂（相对于培养基为1:1），振荡平板2分钟以确保细胞裂解，避光孵育10分钟后测定发光信号。
注意：也可使用基于其他检测原理的细胞活力检测方法。 - 使用多功能酶标仪在黑色或白色96孔板中记录发光值。
6. 病毒感染及抗病毒化合物处理
- 在黑色成像级96孔板中，以约 3 × 104 个细胞/孔的接种密度和100 µL培养体积，在上述条件下培养U4.4细胞。
注意：外周孔（A和H行；1和12列）虽接种细胞，但不纳入实验分析，以避免边缘效应（如蒸发增加）的影响。 - 用SFV-mCherry以0.01的感染复数（MOI）在100 µL未添加补充物的L-15培养基中感染细胞（目标融合度：约 6 × 104 个细胞），于28 °C孵育1小时。
注意：特别是当使用极低MOI和多日感染时，应仅使用低代次的报告病毒储备液。 - 在另一块96孔V型底板中，用添加补充物的L-15培养基将furin抑制剂MI-1130、MI-1131和MI-1148稀释至终浓度分别为100、50、25和12.5 µM。每孔准备110 µL以留出10%余量，然后将100 µL（终体积）转移至细胞中。对照组设置如下：使用抗病毒化合物溶剂处理的感染细胞作为溶剂对照，仅含病毒的感染细胞作为阴性对照。还需加入未感染且未处理的细胞以测定背景荧光。
- 1小时感染期结束后，移除接种液，并将V型底板中稀释好的furin抑制剂各100 µL转移至黑色成像级96孔板中的细胞上。
- 将细胞在28 °C下继续孵育。
7. 活细胞荧光成像、定量图像分析与数据展示
- 通过荧光显微镜测量病毒报告基因表达（程序设置详见补充图1、补充图2、补充图3、补充图4、补充图5、补充图6和补充图7）。
- 在感染后24小时和48小时，每孔加入8 µL细胞膜通透性核复染溶液对细胞核进行染色，在28 °C下孵育30分钟。
注：可在多个时间点监测感染情况。然而，感染后48小时的检测信号最强（见补充图8），且最能可靠地评估抗病毒效应。在24小时或中间时间点读取结果也是可行的，但超过48小时的孵育会增加细胞过度生长的风险。实验开始时应选择适当的细胞汇合度，以确保在选定的检测时间点细胞不会过度生长，从而避免影响准确的细胞计数。 - 孵育结束后（除透明盖板外），为安全起见，再在板的顶部覆盖一层透明可视封口膜。
注：使用成像设备时，必须选择正确的板类型。照明强度、积分时间和增益设置会因报告基因的不同而有所差异。强烈建议进行初步测量以确定最佳参数。在给定条件下建立本实验方案时所使用的初始照明、积分和增益设置详见补充图2，其中对程序设置进行了详细描述。 - 使用多功能酶标仪，通过图像拼接技术（每孔4个视野，4倍放大）获取整孔图像。
- 使用Texas Red滤光片组（激发波长：586/15 nm；发射波长：647/57 nm）测量红色荧光强度。
- 使用DAPI通道并按以下设置（激发波长：377/50 nm；发射波长：447/60 nm）确定总细胞数。
- 在感染后24小时和48小时，每孔加入8 µL细胞膜通透性核复染溶液对细胞核进行染色，在28 °C下孵育30分钟。
- 定量图像分析（原始数据见补充表1）。
注：荧光检测使用了微孔板成像读板仪。本实验所用详细参数详见补充图2。- 使用适当的图像分析软件处理图像。
- 在数据处理面板中，选择对DAPI和Texas Red通道进行图像拼接，以生成单个孔的完整图像。
- 添加图像统计功能，选择Texas Red拼接通道的总荧光强度。对DAPI拼接通道应用图像预处理，以去除背景噪声。
- 对预处理后的DAPI拼接通道运行细胞分析。
- 通过从各处理孔中减去未感染且未处理对照孔的平均荧光值，再将结果除以相应孔中的总细胞数，计算每个细胞的平均红色荧光强度。
- 故障排除
- 在测量过程中监测焦点稳定性，特别是在长时间成像或使用温度敏感型板时。
- 若观察到焦点漂移，启用自动对焦并提高对焦频率。若漂移持续存在，可降低采集速度，或在成像前让板充分平衡至仪器温度。
- 使用成像级微孔板，以确保采集过程中信号质量的一致性。避免过强照明和过长积分时间，以防串色和信号过曝。
- 降低激发强度、缩短积分时间或减少增益，直至避免信号饱和。确认各荧光染料通道之间分离良好，并根据需要调整滤光片设置。
注：DAPI与mCherry之间的串色通常较低，但取决于所使用的报告基因构建体（例如GFP）。 - 避免细胞过度汇合，以维持正常的感染动力学和检测灵敏度。若发生过度汇合，应缩短测量前的孵育时间。
- 监测染料对细胞活力和信号质量的影响，尤其是在高浓度条件下。若观察到染料相关毒性或背景过度饱和，应降低染料浓度或缩短孵育时间。
- 按照生产商推荐的方法配制和储存染料，以保持信号稳定性。
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结果
本研究提供了一种在多孔板体系中利用荧光显微镜监测甲病毒传播及评价抗病毒化合物（例如：弗林蛋白酶抑制剂）的详细实验方案。为展示病毒报告基因表达受抑制的效果，选取了三种先前合成的弗林蛋白酶抑制剂——MI-1148、MI-1130 和 MI-1131，在伊蚊细胞系 U4.4 中进行测试。实验流程概览见图1。
在评估抗病毒效果之前，必须先评估细胞毒性，以确保病毒复制的减少并非由化合物引起的细胞死亡所致。因此，在细胞融合度达到90%时，用100、50、25或12.5 µM浓度的抑制剂处理U4.4细胞。未处理的细胞和用水（溶剂对照）处理的细胞作为阴性对照，离子霉素则作为阳性对照。在处理后48小时，采用基于ATP定量的发光法检测细胞活力。对于所测试的弗林蛋白酶抑制剂，未观察到细胞活力出现显著下降（图2）。
由于这些化合物无细胞毒性，随后对其进行了抗病毒活性评估。为此，U4.4 细胞先用 SFV-mCherry 感染 1 小...
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讨论
实时观察甲病毒复制的能力为传统的终点检测提供了连续且累积的视角。这种多时间点活细胞成像方案是研究甲病毒的有效模型，因为它为观察病毒扩散提供了动态平台。
本实验方案的成功依赖于多个参数。首先，在进行抗病毒检测之前，必须评估化合物的细胞毒性，以排除因细胞死亡导致的假阳性结果。在完成细胞毒性评估后，方可进一步评价化合物的抗病毒活性。对于待测化合物，未观察到细胞毒性。MI-1130 和 MI-1131 对病毒报告基因表达无显著影响，而作为阳性对照的 MI-1148 则有效抑制了其表达。此外，感染时间与细胞接种时间的关系至关重要。细胞必须达到足够的汇合度，以确保感染可重复进行且不发生过度生长。同时，还需根据细胞系优化感染复数（MOI），以便观察到渐进性感染，同时不损害细胞活力。最后，图像采集频率必须谨慎确定，以实现对病毒报告基因表达渐进过程的可视化，避免出现大幅跳跃。对于大多数应用，例如每八小时采集一次图像，可在时间分辨率与样本完整性之间实现有效平衡。
本方案的主要优势在于其可适应性。在本实验中，我们使用SFV-mCherry病毒和U4...
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致谢
我们感谢爱沙尼亚塔尔图大学的Andres Merits教授和德国慕尼黑工业大学的Andreas Pichlmair教授提供质粒pCMV-SFV6-2SG-mCherry。感谢德国汉诺威兽医大学的Stefanie Becker教授提供C6/36细胞。感谢德国马尔堡大学的Torsten Steinmetzer教授提供弗林蛋白酶抑制剂。本研究由黑森州高等教育部、研究与艺术部资助的“科学经济卓越发展州级倡议计划”（LOEWE）通过“转化生物多样性基因组学LOEWE中心”（LOEWE-TBG）资助，资助编号：LOEWE/1/10/519/03/03.001(0014)/52，以及由BMFTR （项目ASCRIBE-资助号01KI2024）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白 V 组分，pH 7.0 | SERVA Electrophoresis | 11930.03 | |
| BenchStable DMEM | Thermo Fisher Scientific | A4192101 | |
| BHK-21 细胞 | CLS Cell Lines Service GmbH，德国埃佩尔海姆 | 603126 | |
| 细胞培养瓶，50 mL，25 cm2，聚苯乙烯，红色滤膜螺旋盖，透明，CELLSTAR，组织培养级，无菌 | Greiner Bio-One | 690175 | |
| 细胞培养微孔板，24 孔，聚苯乙烯，F 型底（烟囱孔），透明，CELLSTAR，组织培养级，带防凝盖，无菌 | Greiner Bio-One | 662160 | |
| 细胞培养微孔板，96 孔，聚苯乙烯，F 型底（烟囱孔），µCLEAR，黑色，CELLSTAR，组织培养级，带防凝盖，无菌 | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 细胞培养微孔板，96 孔，聚苯乙烯，F 型底（烟囱孔），透明，CELLSTAR，组织培养级，带防凝盖，无菌 | Greiner Bio-One | 655180 | |
| 细胞培养微孔板，96 孔，聚苯乙烯，V 型底，透明 | Greiner Bio-One | 651101 | |
| 细胞刮刀 | VWR | 734-2602 | |
| CellTiter-Glo 发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7573 | |
| Cytation 5 细胞成像多功能微孔板检测仪 | Biotek | ||
| DAPI 滤光片组 1225100 | Biotek | 激发：377/50 nm；发射：447/60 nm | |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM GlutaMAX） | Thermo Fisher Scientific | A4192102 | |
| 胎牛血清 | Fisher Scientific | 11550356 | |
| 弗林蛋白酶抑制剂 MI-1130 | 本研究 | ||
| 弗林蛋白酶抑制剂 MI-1131 | 本研究 | ||
| 弗林蛋白酶抑制剂 MI-1148 | Hardes 等，2015。 https://doi.org/10.1002/cmdc.201500103 | ||
| Gen5 Prime 软件 | Biotek | ||
| 离子霉素钙盐，99% | Thermo Fisher Scientific | J60628 | |
| Leibovitz's L-15 培养基，含 GlutaMAX 补充剂 | Thermo Fisher Scientific | 31415029 | |
| Lipofectamine 3000 转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| MEM 非必需氨基酸（100 倍） | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| 微孔板，聚苯乙烯，96 孔，F 型底（烟囱孔），黑色，Fluotrac，中等结合 | Greiner Bio-One | 655076 | |
| NucBlue Live ReadyProbes 试剂（Hoechst 33342） | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| SFV6–2SG-mCherry | Andres Merits 教授（爱沙尼亚塔尔图大学）和 Andreas Pichlmair 教授（德国慕尼黑工业大学） | ||
| Texas Red 滤光片组 1225102 | Biotek | 激发：586/15 nm；发射：647/57 nm | |
| 胰蛋白胨磷酸盐肉汤 | Thermo Fisher Scientific | 18050039 | |
| U4.4 细胞 | 德国联邦动物健康研究所（弗里德里希-勒夫勒研究所），德国格赖夫斯瓦尔德 | ||
| Viewseal 密封膜，透明 | Greiner Bio-One | 676070 |
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