生成基于小鼠前列腺类器官的模型以研究宿主-病原体相互作用

摘要

该协议描述了生成基于二维小鼠前列腺类器官模型的过程。包括类器官解离、细胞播种、分化、上皮完整性评估以及体 外 感染尿路病原 性大肠杆菌。该模型提供了顶端可及性，适合研究宿主-病原体相互作用，克服了传统三维类器官系统的局限。

摘要

年长男性更容易受到前列腺疾病的影响，如良性前列腺增生、前列腺炎和前列腺癌。这些疾病共同对全球健康负担产生重大影响，并且是男性疾病的主要原因之一。类器官模型通过允许在 体外复制上皮结构和功能的关键特征，彻底改变了疾病建模。然而，类器官闭合的腔状结构限制了对顶端表面的实验访问，阻碍了对宿主-病原体相互作用的研究。为克服这些挑战，我们构建了一个生理学相关的培养系统，将小鼠前列腺类器官衍生的细胞作为二维（2D）模型植入。这种方法既保持了本质的上皮特征，又能直接接触顶端表面。该逐步方案描述了成熟小鼠前列腺类器官的解离过程及最佳播种条件，以支持细胞附着、增殖和分化。免疫荧光显微镜确认了类器官模型中前列腺特异性标志物的表达，并准确反映了前列腺组织的细胞组织。TEER测量，加上F-肌动蛋白和紧密连接染色，进一步确认了细胞分化和屏障形成。对该模型进行尿路病原性大 肠杆 菌（UPEC）感染，展示了其在研究宿主-病原体相互作用方面的实用性。该模型为研究前列腺上皮生物学和疾病机制提供了宝贵平台，特别适合研究宿主-病原体相互作用和评估潜在治疗策略。

引言

前列腺是一个位于膀胱下方、包围尿道的小器官。它是男性生殖道的重要器官，主要功能是分泌前列腺液。这种液体占精浆的30%，对于精子在女性生殖道的过程中提供营养和保护^{至关重要。}前列腺疾病，如前列腺炎、良性前列腺增生和前列腺癌，普遍存在，对全球医疗构成重大负担。虽然良性前列腺增生和前列腺癌的研究被广泛研究，但前列腺炎，尤其是细菌性前列腺炎，仍然相对研究不足。前列腺炎影响全球多达16%的男性，其中细菌感染约占病例的10%。尽管细菌性前列腺炎普遍存在，但它仍然了解不足。大肠杆菌（E. coli）菌株，特别是泌尿病原性大肠杆菌（UPEC），是细菌性前列腺炎的主要^原因。

由于缺乏具有生理学意义的体外模型，对前列腺感染分子机制的研究仍然受限。大多数前列腺疾病研究传统上依赖细胞系或动物模型。特别是，癌变或转化细胞系如LNCaP或RWPE-1已被广泛用于模拟前列腺疾病及其治疗反应10,11,12,13。然而，这些模型缺乏细胞组成以及健康或癌性前列腺上皮的复杂性。此外，许多其他研究也利用动物模型（主要是小鼠模型）研究前列腺感染、免疫反应、前列腺肿瘤生长和转移的不同假设，^{14、15、16、17}。虽然这些模型迄今为止是最先进且信息量最丰富的，但通常会引发伦理问题，需要大量时间和资源，且价格昂贵。另外，体外组织植株和原级细胞培养也被用于短期研究组织对药物或癌症发展的反应 18,19,20。然而，这些模型寿命有限，且新鲜人体组织的获取往往有限。

从成人干细胞提取的三维类器官培养物已成为体外上皮组织建模的有前景替代方案。与传统细胞系不同，类器官保留了原始上皮的关键特征，如细胞异质性、组织特异性结构和功能特征 21,22,23。与原生细胞培养或体外植株不同，类器官培养可以长时间扩展和传递而不致衰老。这些特性使类器官系统特别适合在生理相关背景下研究疾病和宿主-病原体相互作用。前列腺类器官已从健康和癌变人体组织以及小鼠模型中获得，主要用于前列腺癌研究 24,25,26。然而，对于感染研究来说，类器官的三维结构面临重大挑战，主要原因是对腔内细胞表面的访问有限。传统上，完整的三维类器官通常通过微注射致病因子，或先将类器官解离为片段或单细胞再与病原体培养。在这里，尺寸和三维结构的变异会影响可重复性和通量。相反，顶端外出类器官提供了克服腔道无法到达限制的方法。在超低附着组织培养板或涂有非粘性界面活性剂表面的表面上，将类器官培养在悬浮状态下，可诱导类器官极性反转。因此，顶端朝外，便于直接进入病原体感染研究^27,28。然而，这些培养物无法长期维持，类器官大小和细胞数量的变异性使得感染多重性（MOI）的判定变得复杂。此外，极性逆转及其对类器官细胞影响的机制尚未完全明了。为了克服类器官作为体外感染模型的局限性，开发了基于类器官的顶端类器官模型，利用胃、肠道或肺等器官的类器官。此类系统保留了主要的上皮特征，便于作、成像以及对病原体和/或药物的控制暴露。然而，允许细胞分化的培养条件并不总是从类器官培养转化为二维培养模型^31,32。

本文介绍了一种利用小鼠前列腺类器官生成顶端可访问前列腺上皮模型的方案。该模型此前已在我们实验室开发并验证，我们证明其与原生前列腺组织极为相似，并对涉及UPEC³²的感染生物学研究具有相关性。该系统高度模拟前列腺上皮的细胞组成和极性，同时提升实验作的便利性。此外，我们展示了其在前列腺宿主-病原体相互作用研究中的适用性， 提供了比体内 模型更易作的替代方案，以及比传统细胞系或三维类器官模型更具生理相关性的系统。

方案

伦理声明：所有动物作均符合维尔茨堡大学的动物护理和使用指南，并根据相关机构和政府法规获得批准。本研究仅使用了本研究所其他研究团队为独立目的安乐死的白天移植小鼠。按照3R原则（替代、减量和精炼），没有专门为此工作牺牲动物。

注：本文所呈现的方案基于作者³²之前发表的一项研究。本文所述的所有步骤必须在无菌生物安全柜内进行，采用适用的无菌技术并配备适当的个人防护装备。如^前所述，从C57BL/6小鼠中生成小鼠前列腺类器官并在三维培养中保持。为了遵循3R原则，动物设施从未处理的至少6个月龄的天真白鼠中捐赠了小鼠前列腺，这些小鼠被用于其他原因被牺牲。简而言之，小鼠前列腺被用胶原酶和TrypLE表达酶分两步进行绞碎和消化。随后，细胞被植入细胞外基质（ECM）滴中，生成三维类器官。培养基被加入培养基，每3天补充一次。三维类器官培养物每周传代一次，从第三通道起用于二维播种。按照当前方案，使用一周大的老鼠前列腺类器官将类器官模型植入二维表面。本方案不要求在组织培养板上涂覆ECM蛋白。

1. 基于前列腺类器官模型的生成

1. 三维类器官分离
   1. 从24孔板中抽取所需数量的三维类器官槽中培养液。每孔用500微升的adDMEM/F12++替代（见 材料表）。
   2. 用P1000移液器机械地干扰ECM下落。将悬浮液收集在15毫升锥形管中。每管最多只能收集两口井。
   3. 补充adDMEM/F12++，最高可达10毫升。轻轻地将管子倒转3-4次以混合。在450 x g 离心机下，4°C离心5分钟。
2. 三维类器官破坏进入单细胞
   1. 抽吸上清液。将沉淀再悬浮于2毫升预热（37°C）的TrypLE表达酶中，并补充10 μM RHOKi。
   2. 在37°C的水浴中孵育15分钟。用P1000移液器每5分钟混合一次细胞悬浮液。
      注意：用倒置显微镜使用4倍物镜检查细胞悬浮液，以确认细胞大部分为单一。2-3个小团块是可以接受的。通常15分钟的潜伏时间足够，但如有需要可以延长。
   3. 补充10毫升adDMEM/F12+/+。轻轻地将管子倒转3-4次以混合。在450 x g 离心机下，4°C离心5分钟。
3. 单电池悬浮液的电镀
   1. 在不扰动沉淀的情况下抽取上清液。将细胞沉淀重新悬浮于添加10微米RHOKi（每孔300微升培养基，步骤1.1.1中使用的三维类器官）中。
      注：培养基由以下组成：Advance Dulbecco's Modified Eagle medium/F12,10 mmol L⁻¹ HEPES，1x GlutaMAX，1x B27,1 mM N-乙酰半胱氨酸，10% Noggin 调质培养基，10% R-sppondin 1 个调质培养基，50 ng·^mL-1 EGF，1 nM 5α-二氢睾酮（DHT），0.2 μM TGFβi 和 100 ng·^mL-1 Primocin（见 材料表）。用于感染实验时，使用不含Primocin的培养基。
   2. 使用诺伊鲍尔计数室计数悬浮液中的细胞数。
   3. 将细胞悬浮液稀释于培养基中，补充10 μM RHOKi，浓度为62,500 cells·^mL-1。每孔使用200微升细胞悬浮液在48孔板上播种（由制造商处理的组织培养，详见 材料表），或在腔室μ载玻片上每孔300微升（见 材料表）。将平板放入37°C、_CO2浓度5%的细胞培养箱中。
      注意：步骤1.1.1中使用的每个三维类器官井。通常产出约20万个细胞。
   4. 一天后，大部分单胞体已附着在二维表面上。每2-3天更换培养基。7天内达到汇合。
      注意：确保 RHOKi 仅在初始播种时添加，而非后续培养基更换时添加。
4. 区分类器官模型。
   注意：按照下一步步骤获得富含腔细胞的分化类器官模型。
   1. 向细胞悬浮液中加入10 nM DHT（步骤1.3.3）。后续培养基更换时使用加10 nM DHT的培养基（每2-3天）。
      注意：如果细胞悬浮液中未添加DHT（及后续培养基变化），类器官模型将被基底细胞富集。

2. 跨上皮电阻（TEER）测量

1. 在62,500细胞·^mL-1浓度下，使用300微升（步骤1.3.3获得）在8孔μ PET切片上播种类器官细胞悬浮液，每孔有40个电极（见 材料表）。向其中一个无细胞孔加入300微升培养基（见1.3.1描述）。
   注：无孔井用作测量的空白槽。
2. 将μ载玻片连接到基于阻抗的细胞分析系统（见 材料表），并将16孔站置于组织培养箱内。在400赫兹下测量TEER，持续7天。每2-3天更换培养基。

3. 免疫荧光染色

注意：在此方法中，确保细胞种子为腔室μ载玻片（见 材料表），该切片兼容高分辨率显微镜应用。

1. 在选定时间点，取出培养基，用1倍PBS清洗细胞3次。用4%对甲醛（PFA）在室温下固定细胞15分钟（避免光照照射）。
   注意：4%的对甲醛可能引起过敏性皮肤反应、严重的眼部损伤，并被怀疑致癌。始终使用适当的个人防护装备（PPE）。避免吸入灰尘、烟雾、气体、雾气、蒸汽或喷雾。请佩戴防护手套，确保受污染衣物留在实验室内，直到得到适当消毒。通过经批准的废弃物处理设施处理内容物和容器。
2. 固定后，用1次PBS清洗细胞3次（每次5分钟）。在室温下用0.5%的Triton X-100（见 材料表）渗透细胞15分钟。
   注意：Triton X-100会引起皮肤刺激和严重的眼睛损伤。它对水生生物极具毒性，影响持久，并可能干扰环境内分泌。搬运时请佩戴防护手套、眼睛和面部防护。通过经批准的废弃物处理设施处理内容物和容器。避免释放到环境中。
3. 用1次PBS清洗细胞（每次5分钟）。用阻断缓冲液（PBS中的1% BSA，见 材料表）在室温下封闭细胞30分钟。
4. 将原抗体稀释于阻断缓冲液中（1% BSA溶于1x PBS），并在摇摆平台上以4°C与细胞一同孵育一夜。第二天，在室温下孵育1小时。（抗体稀释见 材料表 ）
   注意：对于用Phalloidin染色F-肌动蛋白或用CellMask染色质膜（见 材料表），跳过步骤3.4。
5. 用1次PBS清洗细胞3次（每次5分钟）。将二级抗体、Phalloidin或CellMask（见 材料表）稀释于阻断缓冲液（1% BSA在1x PBS）中，并在室温下与细胞一起孵育1小时。
6. 用1次PBS清洗细胞3次（每次5分钟）。在室温下用稀释的1xPBS浸泡的Hoechst（见 材料表）孵育细胞15分钟，以染色细胞核。
7. 用1倍PBS清洗细胞3次（每次5分钟），然后留在1倍PBS中。保存温度为4°C。
8. 在激光扫描共焦显微镜或荧光显微镜中成像腔室μ片载玻片（见 材料表）。
   注意：概览图像可使用荧光显微镜上的20倍物镜拍摄，以评估整体感染效率和分布情况。使用配备40倍水浸物镜的共聚焦显微镜，获得了更高分辨率的图像，以观察附着或内部附着于上皮细胞内的单个细菌。荧光团通过激光线激发，波长为405、499、590和653纳米，具体取决于所用荧光团。发射窗口设置为Hoechst的415至516纳米，GFP或Alexa 488的509至573纳米，mcherry或Alexa 594的600至651纳米，Alexa 647的663至720纳米。Z堆栈的步长为0.5微米，覆盖上皮层的全部厚度。图像分辨率为1024×1024像素，扫描频率为400赫兹，帧均值设为4，提供良好的画质。激光功率和探测器增益在同一实验中保持恒定。所有成像参数，包括激光功率、探测器增益、扫描速度和平均值，应根据所用共聚焦显微镜的需要进行优化和调整。

4. 泌尿致病性 大肠杆菌 （UPEC）细菌感染

注意：确保使用基于类器官的模型，维持7天无Primocin（见 材料表）以完成以下步骤。

本研究采用了泌尿致病性大 肠杆菌 株UTI89，该菌株从pFPV-mCherry质粒中表达一种mCherry蛋白（具有氨苄青霉素耐药性）。

注意：处理传染性病原体（生物安全等级2）时，请佩戴手套并佩戴适当的眼睛和面部防护。一定要穿一件扣子扣好的实验服。所有程序均在认证的生物安全柜内进行。处理生物材料后，务必消毒工作表面并彻底洗手。收集BSL-2废物，存放在适合高压灭绝的指定生物危害容器中。在废弃物处理前，应通过高压灭菌或其他合适的去污方法进行除污。

1. 感染实验前三天，在补充相应抗生素（本方案中使用氨苄青霉素100 μg·^mL-1 ）的LB琼脂平板上划出UPEC菌株，并在37°C下潜伏16-24小时。
   注意：某些抗生素接触时可能引起过敏反应或刺激，若不当丢弃，可能导致抗菌素耐药性。始终在生物安全柜内准备并添加抗生素，同时佩戴适当的个人防护装备（手套和护目镜）。通过经批准的废物处置设施，将含抗生素的溶液作为化学废物处置。
2. 感染实验前两天，使用琼脂平板上的单个UPEC菌落，接种3毫升LB汤，辅以相应抗生素（氨苄青霉素100 μg·^mL-1）（步骤4.1）。静置于37°C下孵育12-16小时。
3. 感染实验前一天，从第4.2步对细菌培养进行涡旋，测量其OD₆₀₀。计算将3毫升LB肉汤（补充氨苄青霉素，100 μg·^mL-1）接种至起始OD₆₀₀ 0.05所需的培养体积，公式如下：体积（μL） = （0.05 * 3,000 μL） / 测得OD₆₀₀。将步骤4.2中计算出的培养体积相加。放入新鲜LB汤中，在37°C下静静孵育24小时。
   注意：4.2步隔夜培养的OD₆₀₀ 应在1.7到2.2之间。
4. 感染当天，从4.3步骤中滤取细菌培养液，测量其OD₆₀₀。从培养物中采集OD₆₀₀ 1，然后以12,000 x g 离心机在室温下离心2分钟。去除上清液。
5. 将无DHT的1毫升无Primocin类类器官培养基重新悬浮。稀释到100的MOI。
   注：在48孔板中，每个孔在第7天被认为约有150,000个细胞。这一估计是通过在感染前的多个实验中计数细胞数量得出的。为了准确调整MOI，建议在感染前多播种一口孔进行细胞计数。要确定所需的细菌悬浮液体积（步骤4.4），将每孔细胞数乘以MOI，得到每孔所需细菌总数，然后将该数除以细菌浓度（8 × 10⁵ 细菌/μL）得到体积（单位为μL）。
6. 用含细菌的培养基替换类器官模型的培养基。根据培养表面调整体积：48孔板每孔200微升，μ载玻片每孔300微升。在37°C、5%_CO2的细胞培养箱中培养1小时。
7. 孵育期结束后，从类器官模型中抽取含细菌培养基。用adDMEM/F12+/+清洗井口3次，以去除细胞外细菌。
8. 添加含有50 μg·^mL-1 庆大霉素的培养基以杀死细胞外细菌。孵育30分钟。
   注意：根据所用菌株，庆大霉素浓度可能需要调整。如果使用高于50 μg·^mL-1的浓度，建议检查细胞毒性。
9. 取出培养基，替换为补充10 μg·^mL-1 的甘大霉素的新鲜培养基，以维持剩余感染时间。
   在 第3节后处理感染细胞进行荧光染色，或在 第5节后通过流式细胞术进行定量。

5. 通过流式细胞术定量感染

1. 抽取培养基，并用1倍PBS清洗细胞3次。使用100微升TrypLE表达酶来分离细胞。培养5-10分钟，直到所有细胞都脱落。
   注意：每项条件，48孔板的井就足够了。
2. 收集电池悬浮液并将其转移到96孔板（锥形底部）的孔中。在顶部加入100微升流式细胞计缓冲液（1xPBS，10% FBS，5 mM EDTA）以使TrypLE表达酶失活。
3. 在450 x g 下离心96孔板，离心5分钟，温度为4°C。 去除上清液，将沉淀重新悬浮于150微升流式细胞计缓冲液中。
4. 使用流式细胞仪获取并定量感染细胞（见 材料表）。
   注意：流式细胞术使用488 nm激发激光和615/20 nm发射滤光片进行，以检测mCherry阳性细胞。数据采集时流量较高（66 μL·min⁻¹），每个样本至少收集10,000个事件，仅包括前向散射高度值大于80,000的事件。通过mCherry荧光与未感染（初生）对照组进行对比，在排除残骸和双重态后，识别出感染细胞。可包含活活标志物（如碘化丙蓣或其他活/死染色）以评估细胞存活能力。这在首次使用模型时尤其有用，以确保细胞解离不会对细胞产生不良影响。

结果

该方案描述了基于类器官的老鼠前列腺上皮模型的生成，该模型重现原生组织上皮区室的细胞类型和转录表达。该模型是利用从成年小鼠前列腺组织生成的三维成人干细胞类器官生成的。这些类器官培养物随后在培养中保存并每周传递。对于类器官模型，工作流程的第一步（见图1A）是使用7天前的三维类器官。这段时间对于它们达到适当大小和细胞密度，以便后续播种到二维表面是必要的。传代后，小片段类器官（见图1B，第0天）被植入ECM中并允许生长。随着时间推移，它们在第7天会成长为具有明确内腔的大型球形结构（见图1B）。将7天龄类器官解离为单细胞后，细胞被播种到经过组织培养的培养基上（见图1C，第0天），使用与3D类器官培养相同的培养基（1nM DHT），形成单分子层。到了第一天，粘连细胞开始增殖。接下来的几天里，单层扩展并在第3天和第5天之间汇合，这一点通过明场显微镜观察到（见图1C）。为了表征形态变化并监测类器官模型汇聚的时间，我们用CellMask染色质膜，并在多个时间点进行了荧光成像（见图1D）。

由于雄激素受体（AR）信号是前列腺细胞分化的关键调控因子，调节类器官培养基中睾酮（或DHT）浓度已被证明能引导干细胞向基底或腔内细胞分化³²，我们调整培养基中的DHT水平，以促进腔腔细胞（DHT 10 nM）或基底细胞（无DHT， 控制;方法1，图2A）。如图2（B-F）所示，细胞生长或汇聚度无显著差异。如预期，在对照条件下（无DHT类器官培养基），大多数细胞表达细胞角蛋白5（KRT5），这是前列腺基底干细胞的标志物（见图2B，E）。相比之下，只有少数细胞表达低水平的CD24a，这是分化管腔前列腺细胞的标志（见图2B，F）。

补充1 nM DHT（如前所述³²个）形成了包含基底和腔腔细胞的混合群体。然而，CD24a表达依然偏低，表明分化为腔腔细胞未完全分化（见图2C，F ³²）。将DHT增加至10 nM促进腔腔细胞的完全分化，同时在培养7天后仍保留部分基底细胞（见图2D-F）。基于类器官模型的差异化也可以通过明场显微镜进行评估。虽然在细胞稀疏时（第0-5天，图1C，补充图1A）条件下，两种条件的差异并不十分明显，但在第7天通过明场显微镜观察，三种培养条件下的细胞形态和表现会变得明显且明显（图1C，补充图1A，B）。在没有DHT的情况下，细胞看起来更扁平且形状更不规则，而在10 nM DHT中，细胞紧密排列，呈多边形排列，形态类似鹅卵石（补充图1B）。

值得注意的是，三维类器官培养物在不同DHT浓度下也发生了形态变化。具体而言，观察到类器官尺寸明显随剂量依赖性增加，最大类器官在10 nM DHT存在下形成（图1B， 补充图2A，B）。这些结果表明，AR通路不仅对细胞分化至关重要，还对调节小鼠前列腺类器官的生长动态至关重要。

为评估模型的上皮完整性和极化，我们在无或10 nM DHT培养的类器官模型中进行了经上皮电阻（TEER）测量。TEER值在两种条件下均随时间上升，但在10 nM DHT存在时显著升高（见图3A），表明上皮屏障功能增强。这些结果得到了肌动蛋白丝的phalloidin染色支持，肌动蛋白丝通常在腔腔前列腺上皮细胞的细胞-细胞连接处组织成顶端环。在10 nM DHT条件下，肌动蛋白环比对照组更为明显，这与细胞极性和上皮组织的增加相符（见图3B）。此外，对闭塞带1（ZO-1）的免疫染色显示10 nM DHT条件中紧密连接增加（见图3C），进一步支持强化的上皮屏障完整性和向腔体表型分化。正交投影显示，含有10 nM DHT培养的类器官表现出明确的上皮极性（补充图3A）。基底的KRT5⁺细胞位于底部，腔腔型CD24a⁺细胞分布于上皮层，染色强度更强，靠近顶端。这种结构与小鼠前列腺组织中观察到的结构相似（补充图3B）。值得注意的是，人类蛋白图谱的数据显示，这些标记在人类前列腺组织中定位相似，KRT5⁺基底细胞位于CD24a⁺腔腔层之下（补充图3C）³³。相比之下，在对照或1 nM DHT条件下培养的细胞，基底和腔标记之间没有明显的空间分离，细胞高度也远低于10 nM条件下（补充图3A）。这表明10 nM DHT补充在二维模型中促进上皮分化和极化，其作用类似于原生前列腺上皮。由于用10 nM DHT培养的类器官模型与原生小鼠前列腺上皮极为相似（图2D， 补充图3A，B），因此它成为研究宿主-病原体相互作用的重要平台。为证明模型的适用性，我们以UPEC感染为例，特别是UTI89株，这是泌尿生殖系统领域中最常用的UPEC株之一。如 图4A所示，细菌在LB汤中培养24小时（如方法4所述），并与细胞一起孵育1小时。随后用庆大霉素杀死细胞外细菌，以量化入侵和细胞内复制。在感染类器官模型后，UPEC大量附着于上皮细胞（0 hpi; 图4B，左侧面板; 图4C）。随后，在庆大霉素处理（1 hpi）后，由于细胞外细菌死亡，UPEC阳性细胞数量显著减少（见图4B，中图; 图4C）。在24马力时，感染细胞数量保持不变（见图4C），但共聚焦显微镜成像显示细胞内细菌继续复制，形成类似膀胱上皮的群落状结构（图4B，右侧面板）。通过mCherry荧光法鉴定感染细胞，使用未感染（初真）对照组，排除残渣和双重态（补充图4）。

图1：前列腺类器官及基于类器官模型的工作流程及形态演变概述。 （A）实验工作流程的示意图（方法1）。（B）明场图像，显示前列腺类器官的形态发育，补充1 nM DHT，拍摄于第0、1、3、5和7天（从左到右）。比例尺：200微米（n = 3）。（C）基于类器官模型的明场图像，补充1 nM DHT，拍摄于第0、1、3、5和7天（从左到右）。比例尺：200微米（n = 3）。（D）基于类器官模型的代表性免疫荧光显微镜图像，补充1 nM DHT并用CellMask染色（红色），时间为第1、3、5和7天（从左到右）。核点则使用Hoechst 33342（蓝色）进行对比染色。比例尺：50微米（n = 3） 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：DHT调节类器官模型中的谱系分化。 （A） 用于微分的不同条件的示意表示。（B-D）代表性免疫荧光显微镜图像，基于类器官模型在（B）缺失（Ctrl）或（C）1 nM 或（D）10 nM DHT存在的情况下，培养7天。图像拍摄时间为第1、3、5和7天（从左到右）。基于类器官的模型对CD24a（腔内细胞标记，绿色）和KRT5（基底细胞标记，品红色）进行了染色。核点则使用Hoechst 33342（蓝色）进行对比染色。比例杆：50微米（n = 4）。（E，F）在无DHT（Ctrl）、1nM或10nM的类器官模型中，对（E）KRT5⁺和（F）CD24a⁺细胞进行图像定量。数据以每个视场正细胞的百分比表示。统计检验：单因子方差分析，采用Tukey的事后检验。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：基于类器官的模型，采用10 nM DHT分化，显示细胞极化度高于对照组。 （A） 在无（Ctrl;粉色）且存在DHT（10 nM;绿色）的情况下，对基于类器官模型的TEER分析，培养时间为7天。误差条表示标准差（n = 3）。统计检验：单因子方差分析，采用Tukey的事后检验。（B，C）代表性免疫荧光显微镜图像，基于类器官模型的7天培养，未使用（Ctrl;顶部）或10 nM DHT（下方），并染色（B）F-肌动蛋白（红色）和（C）ZO-1（红色）。核点则使用Hoechst 33342（蓝色）进行对比染色。比例尺：50微米（n = 3） 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：类器官模型中感染动态分析。（A） 感染协议的示意图（第4节）。（B）代表性免疫荧光显微镜图像，显示感染后0、1和24小时（hpi;从左到右）的类器官模型。UPEC以红色表示。核点则使用Hoechst 33342（蓝色）进行对比染色。比例尺：50微米（n = 3）。（C）对UPEC阳性细胞（mCherry阳性感染细胞）在0、1和24 hpi的流式细胞术分析。门控策略见 补充图4。误差条代表SEM（n =3）。统计检验：单因子方差分析，采用Tukey的事后检验。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：基于类器官模型随时间的形态演变。 （A，B）基于类器官模型的明场图像，在（A）缺失（Ctrl）和（B）存在10 nM DHT的情况下，拍摄于第0、1、3、5和7天（从左到右）。比例杆：200微米（n = 3） 请点击此处下载此文件。

补充图2：DHT浓度影响三维前列腺类器官生长。 （A）类器官模型在无（Ctrl;上方）和存在10 nM DHT（下）时的明场图像，拍摄于第0、1、3、5和7天（从左到右）。比例尺：200微米（n = 3）。（B） 在第7天在三种不同条件下培养的三维类器官尺寸定量：无DHT（Ctrl;粉色）、1 nM DHT（紫色）和10 nM DHT（绿色）。统计检验：采用Tukey事后检验（n =3）进行单向方差分析。 请点击这里下载此文件。

补充图3：前列腺类器官形态和上皮极性的特征描述。 （A） 共焦点z堆栈的正交投影，展示不同DHT浓度（Ctrl、1 nM和10 nM DHT）下上皮组织及顶端至基底极性。基底细胞对KRT5（品红色）和腔内细胞（CD24a（绿色）进行了染色。比例尺：50微米（B）对OCT嵌入的小鼠前列腺组织进行免疫荧光染色，显示基底（KRT5，品红）和腔内（CD24a，绿色）上皮标志。核内用DAPI（蓝色）染色。比例杆：50微米。简要地，小鼠组织片段用4%PFA固定，用30%蔗糖脱水，并嵌入^OCT32。切片随后在PBS中重新加水10分钟，并在第3切片后进行免疫染色。（C） 对人类前列腺组织中CD24a和KRT5蛋白表达的免疫组化分析 （面板C 取自人类蛋白质图谱数据库（版本25.0;人类蛋白质图谱 proteinatlas.org），Uhlén， M. 等（2015）^{33，https://www.proteinatlas.org/ENSG00000186081-KRT5/tissue/prostate}）。 请点击这里下载此文件。

补充图4：流式细胞术门控策略用于识别感染细胞。 首先根据侧向散射高度（SSC-H）和前向散射高度（FSC-H）进行格栅门控以排除碎片，随后对SSC-H与侧向散射面积（SSC-A）进行门控以选择单个单元格。随后通过Counts vs PE-Texas Red-H荧光（直方图）鉴定了mCherry阳性（感染细胞）。 请点击这里下载此文件。

讨论

多种疾病都可能影响前列腺，包括良性前列腺增生、前列腺炎和前列腺癌。这些疾病非常普遍，并且显著影响患者的生活质量².尽管这些疾病对医疗有重大影响，我们对这些疾病，尤其是非癌性疾病中潜在机制和宿主反应的理解仍然有限。这主要是因为缺乏具有生理学意义的实验模型。一方面，永生化细胞系无法捕捉正常前列腺上皮的复杂性或分化状态。另一方面，动物模型，主要是啮齿动物，带来了伦理问题，且成本效益不高。另一种方法是使用人类原级细胞或患者来源的组织样本。然而，新鲜前列腺组织的供应有限，限制了其广泛应用。这些局限性凸显了需要其他具有生理相关性、易用且实验可控的体外系统。在此背景下，成人干细胞类器官技术彻底改变了疾病建模。这些三维培养具备自我组织能力，保持上皮身份和上皮细胞多样性 23,34,35,36,37,38。虽然其三维结构使得癌症研究、药物检测和再生医学的应用得以实现 23,34,35,36,37,38,39,40,41，但其封闭结构，顶端朝内，在实验访问上尤其面临实际挑战，尤其是在体外受精感染模型。顶端外出类器官通过反转上皮极性来解决这一限制，使顶端表面暴露于直接感染研究中^27,28。然而，其作为感染模型的有效性可能受限于体型变异、病原体暴露不均以及长期感染期间的脆弱性。

本文介绍了一种基于类器官的小鼠前列腺模型的生成方案，该模型能重现本地小鼠上皮的上皮细胞组成和转录特征，同时便于访问其顶端表面。在我们之前的工作中优化的³²号模型，允许精确控制关键实验变量，包括播种密度、均匀刺激暴露、定义的细菌与细胞比（MOI）以及在传统三维类器官系统中难以标准化的高通量成像参数。

根据动物实验中的3Rs原则（替代、减少、精炼）⁴²，该模型用作初级细胞来源的类器官源自野生型的幼鼠，这些小鼠被用于无关目的，如繁殖。前列腺通过附近动物设施的捐赠获得，从而减少了专门为该方案牺牲额外动物的需求。

对类器官和类器官模型的稳健可靠分化对于忠实复现原生组织的细胞组成和功能特征至关重要，确保其作为体外模型的相关性。类器官内的细胞分化受到培养基的特定成分强烈影响，包括生长因子和药物抑制剂（即药物抑制剂）的精确浓度。控这些因子可以直接分化到特定细胞谱系，正如在各种类器官系统中所证明的那样。例如，在肠道类器官中，去除WNT促进肠细胞分化，干扰素γ进一步增强分化（见^第38页综述）。分化为杯状细胞可以通过去除p38抑制剂和烟酰胺，或通过DAPT/DBZ进行Notch抑制实现（见^第38页综述）。IGF-1和FGF-2也被证明支持分泌细胞富集培养物的长期扩增⁴³。此外，IL-22促进潘奈斯细胞分化，肠内分泌细胞通过抑制包括Notch和BMP³⁸在内的通路产生。同样，胃类器官和类器官单层在从培养基中取出WNT时会向凹细胞分化，而向培养基添加烟酰胺则使细胞形成腺体表型（颈部细胞和主细胞）31,44,45。

在前列腺中，雄激素受体（AR）在维持组织稳态中发挥关键作用，46,47,48,49。睾丸中的莱迪希细胞产生的睾酮，在前列腺上皮细胞中被5α还原酶转化为DHT。DHT激活AR，AR二聚体，转位到细胞核，并结合雄激素反应元件，调控参与细胞分化和稳态的基因⁵⁰。以往研究表明，在三维小鼠前列腺类器官中补充1 nM即可实现细胞分化为腔腔细胞⁵¹。还有研究显示，补充维生素D（特别是1,25-二羟基维生素D）通过抑制典型的WNT活性和抑制WNT家族成员DKK3，促进人类类器官生长和加速分^化。然而，在这些研究中，仅使用了三维类器官。我们之前的研究³²和其他⁵³的研究显示，在三维类器官中补充10 nM DHT不足以实现完全分化。相比之下，使用此处描述的二维模型，即在二维中向细胞植入10 nM DHT，足以将模型区分到类似原生组织的状态³²。要理解三维与二维模型之间的差异，还需进一步研究，但这可能由系统间不同的机械物理线索，或三维模型中含有ECM生长因子来解释。

成人前列腺组织中主要有三种上皮细胞类型：腔内细胞、基底细胞和神经内分泌细胞。在这些模型中，迄今为止所有已发表的类器官模型中仅存在腔细胞和基底细胞。罕见神经内分泌细胞的缺失表明当前类器官方案可能尚未完全优化。在腔内细胞和基底细胞之间，前列腺中间细胞群体也被描述为一种过渡状态，同时表达腔内（即CD24a）和基底（即SCA-1）标记^18,51。该亚群通常存在于尿道周围前列腺区域，因此常被称为尿道周腔细胞⁵⁴。尽管在某些三维类器官系统中，特定分化或信号条件下已有报道，^53,55，但我们系统中未观察到腔内细胞与中间细胞之间有明确的^分离。一种可能的解释是，在三维类器官生成过程中，我们无法区分不同的前列腺区域，为了避免尿道细胞污染，我们会切除紧邻尿道前列腺连接处的组织。因此，来自近端或尿道邻近区域的类器官培养物更有可能产生中间细胞。

屏障完整性被视为成熟且分化的上皮的标志，能够保护毒素和微生物进入底层组织。紧密连接（富含ZO-1蛋白⁵⁶）在调节细胞旁通透性和维持上皮屏障完整性方面起着关键作用（⁵⁷）。随着上皮细胞分化，这些细胞间连接的成熟会增强屏障⁵⁸。因此，评估屏障完整性是体 外 上皮模型的重要读数。本方案展示了三种互补的屏障完整性评估方法：TEER测量、ZO-1免疫染色和F-肌动蛋白染色。虽然三种方法都能有效评估屏障完整性，但它们在所需设备和资源上存在显著差异。TEER测量提供可随时间追踪的定量值，动态洞察屏障功能;然而，这种技术需要专用的硬件和软件，而这些硬件和软件可能并非每个实验室都具备。相比之下，用抗ZO-1抗体或法洛伊丁染色在时间和成本上都更为可控（例如法洛伊丁染色大约3小时即可完成——第3节）。

该协议描述了如何利用三维小鼠前列腺类器官生成一个顶端可访问的二维模型。多项综述概述了类器官及类器官系统在研究宿主-病原体相互作用中的优缺点 23,36,59。在感染研究中，考虑病原体与宿主上皮的自然相互作用位置至关重要。在前列腺中，腔内细胞通常是最先接触的部位，因此，访问顶端表面对于准确模拟感染动态至关重要。在传统的三维前列腺类器官中，顶端面朝向类器官腔，无法直接接触。在这些方法中，病原体暴露可通过显微注射实现，这种方法通量低且技术上具有挑战性，或通过破坏类器官实现，后者破坏上皮极性并导致非生理性相互作用位点²³。相比之下，该协议中呈现的顶端可访问二维模型则可直接访问光表。这使得可控且生理学上相关的病原暴露、精确调控MOI以及兼容高通量、高分辨率或活细胞成像平台成为可能。在这里，我们展示了该模型作为体外感染系统的应用，使用UPEC参考株UTI89，该菌株广泛使用，代表了导致细菌性^{前列腺炎9}号的主要细菌物种。然而，该模型也可以轻松应用于研究其他前列腺病原体，如粪肠球菌或铜绿假单胞菌，使其成为前列腺感染生物学的多功能平台。

三维类器官的解离是成功建立类器官模型的关键步骤。未能完全解离三维类器官导致大片段，会削弱细胞对培养表面的附着，而长时间暴露于解离试剂超过30分钟则降低细胞存活能力。此外，保持大约七天的持续传代间隔至关重要，因为类器官的生理状态强烈影响其附着和分化能力。另一个影响前列腺类器官模型成功发展的关键变量是播种密度。这里使用的播种浓度经过优化，用于7天的分化。增加或减少该浓度可能会导致不同的分化时间。此外，在镀板前细胞悬浮不足，可能导致细胞在孔中的分布不均，导致细胞密度变化，进而影响增殖和分化。此外，与其他类器官模型类似，不同批次的ECM或生长因子会影响生长和分化能力。因此，验证类器官模型在生长因子批次或批号变化后是否保持一致表型非常重要。

建立类器官模型后，感染参数也必须被仔细优化。根据细菌菌株和所选读数，通常需要不同的MOI来实现稳健且可复现的感染水平。对于UPEC株UTI89（此处及^第32例使用）及若干前列腺炎分离株^32，MOI为100已足以获得贯穿粘附、侵袭和复制时间点的可靠感染细胞数量。然而，如果需要将细胞与细菌的培养期延长超过1小时，应使用较低的MOI，以防止UPEC在培养基中的细胞外过度增生及随后对细胞的毒性。该方案通过两种方法评估感染情况：I）流式细胞术以定量感染细胞比例，II）共聚焦显微镜以评估细菌定位。此外，还可以采用多种方法，如菌落形成单元测定以测量细菌³²，免疫染色检测宿主或细菌标记³²，或转录组分析以描绘宿主反应。

虽然基于前列腺类器官的模型提供了一个生理学相关的系统，但在将其应用于感染研究时应考虑若干局限性。该模型的一个主要限制是缺乏常驻或外围免疫细胞，这限制了其完全捕捉宿主对感染反应的能力（例如免疫细胞招募或免疫介导清除）。模型中缺失的其他重要组成部分包括血管、基质和神经，这些都可能影响宿主与病原体的相互作用。引入更多细胞类型，如间质成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞，有助于重建更完整的组织微环境。先进的共培养系统或微流控器官芯片平台可进一步支持复杂的细胞相互作用，并实现感染的动态研究。此外，在使用动物模型衍生的类器官时，必须考虑物种特异性差异，尤其是在研究人类特异性病原体时。尽管我们之前的研究³² 显示，基于小鼠前列腺类器官模型的发现可以在人类组织中复现，但基因调控、受体表达或激素反应的物种间差异仍可能限制该模型对人体生理的直接相关性。在可能的情况下，纳入人类来源类器官，将通过研究人类特异性病原体的相互作用与反应，提升转化价值。虽然这些补充可能增强类器官模型作为研究前列腺生物学、感染致病机制和治疗开发的强大工具，但我们所呈现的纯上皮模型提供了一个简化且分隔化的系统。这使得能够聚焦于上皮特异性宿主-病原体相互作用的研究，而不会受到其他组织成分的干扰。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
48个井板	萨斯泰特	83.3923	底部形状：平坦
5&α;-雄性睾酮-17&β;-ol-3-one 二氢睾酮	西格玛-奥尔德里奇	A8380	它被指定为DHT。库存解 10μM在100%乙醇中
8孔PET滑台，每孔40电极;	应用生物物理学	8W10E+	用于TEER测量的幻灯片
96个井板	萨斯泰特	82.1583	底部形状：锥形
前进杜尔贝科改装鹰中型/F12及nbsp;	赛莫飞世尔科学	12634028	当补充10 mmol L&minus时，该型号被命名为adDMEM/F12+/+;1个HEPES和1个GlutaMAX
氨基林	罗斯	K029.2	浓度：100 mg/mL
抗CD24a抗体	蛋白质技术	10600-1-AP	初级抗体;稀释1：100,1xPBS 1%BSA
抗细胞角蛋白5 Alexa Fluor 647抗体及nbsp;	Abcam	AB193895	初级抗体;稀释1：100,1xPBS 1%BSA
抗兔IgG Alexa Fluor 488 抗体	Invitrogen	A21441	二级抗体;稀释1：500,1xPBS 1%BSA
抗ZO-1多克隆抗体	蛋白质技术	21773-1-AP	初级抗体;1：750 稀释，1x PBS 1% BSA
B27,50倍	赛莫飞世尔科学	12587010
牛血清白蛋白（BSA）Fraktion V，新西兰起源	罗斯	8076.3	阻断缓冲液的分量，1x PBS中以1%使用。
膛室和微型;-滑套8孔	伊比迪	80806	表面改造：ibiTreat
锥形管（15毫升）	西格玛·奥尔德里奇	T1943	平底更适合小颗粒。nbsp;
二氢钠乙基二氨四甲酸酯2H2O（EDTA）	罗斯	8043.2	自制：93.0克浸400毫升水，pH调整至8.0，水量调整至500毫升;0.5 米 EDTA;流式细胞计缓冲液的组成部分
杜尔贝科平衡盐溶液（DPBS）	吉布科	14190-144	PBS
ECHO旋转显微镜	回声
ECIS Z-Theta - 基于阻抗的单元分析系统	应用生物物理学	ECIS Z-Theta	系统包括：16口和/或96口井站;外部控制模块;笔记本电脑;ECIS控制、获取和显示软件;用于自动细胞迁移和电穿孔的高架场模块 
胎儿牛血清（FBS）优良	西格玛·奥尔德里奇	S0615	流式细胞计缓冲液的成分;293T细胞系培养基的组分;培养基HEK293T细胞系的组成部分
闪电Phalloidin Red 594	生物传说	424203	稀释1：250,1xPBS 1%BSA
流式细胞计缓冲液			1xPBS，10% FBS，5 mM EDTA
庆大霉素	西格玛·奥尔德里奇	G1272
GlutaMAX	赛莫飞世尔科学	35050-038	L-异丙酰-L-谷氨酰胺二肽，adDMEM/F12+/+ 的成分;
哈佛生物色铬Ultrospec 10细胞密度计	费舍尔科学	10704417
HCS CellMask深红色染色	生命科技	H32721	稀释1：1000,1x1xPBS 1%BSA
HEK293T用小鼠Noggin-Fc表达载体转染的细胞系	来自克莱弗斯教授博士的细胞系		用于生产诺金;培养基：500毫升DMEM，高葡萄糖，GlutaMAX，丙酮酸（Gibco Life Technologies，31966）+ 50毫升FBS;Farin 等，《胃肠病学》143卷6期（2012）：1518-1529
HEPES	赛莫飞世尔科学	15630056	adDMEM/F12+/+ 的成分;
霍赫斯特33342	生命科技	H3570	稀释1：5000,1倍PBS
人类表皮生长因子（EGF）和nbsp;	Peprotech	AF-100-15	500 & 微量浓缩库存;克/毫升
接种环	萨斯泰特	86.1567.010
接种管	萨斯泰特	62.515.006
徕卡Stellaris 5共焦显微镜	徕卡
卢里亚·贝尔塔尼·布罗斯（LB 布罗斯）	罗斯	X968.1
马特里格尔	科宁	356231	细胞外基质（ECM）
N-乙酰半胱氨酸	西格玛-奥尔德里奇	A9165-25G	500 mM 浓缩库
诺金·CM
新生细胞量子子	安捷伦		流式细胞仪
对甲醛（PFA）	西格玛·奥尔德里奇	P6148	4%浓度用于1xPBS，4%蔗糖
普莫辛	生前者	蚁-pm-1
Q-VETTES 半微型	Ratiolab	2712120
RHOKi（Y-27632）	潜鼠	M1817	RhoA/ROCK抑制剂;浓缩库 10 mM
R-spodin1 CM
表达293T细胞系的R-Spondin1	西格玛·奥尔德里奇	SCC111	用于生产R-spo1 CM;培养基：500毫升DMEM，高葡萄糖，GlutaMAX，丙酮酸（Gibco Life Technologies，31966）+ 60毫升FBS
TGFβi（A-83-01）	托克里斯	2939	ALK4/5/7抑制剂;浓缩物5 mM
特里顿 X-100	西格玛·奥尔德里奇	T9284	在PBS中稀释后使用0.5%
TrypLE表达酶	吉布科	12605028	酶促细胞解离剂用于消化小鼠前列腺类器官
尿路病原性大肠杆菌株UTI89	多布林特教授博士的WT株		用pFPV-mCherry（添加基因#20956）转化