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建立基于小鼠前列腺类器官的宿主-病原体相互作用研究模型

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DOI：

10.3791/69385

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2026年2月27日

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1Host Pathways in Urinary Tract Infections Group, Institute of Molecular Infection Biology, University of Würzburg

本文内容

摘要

本方案描述了一种基于小鼠前列腺类器官的二维培养模型的建立方法。内容包括类器官解离、细胞接种、分化、上皮完整性评估以及 体外 感染尿路致病性 大肠杆菌该模型具有顶端可及性，适用于研究宿主-病原体相互作用，克服了传统三维类器官系统的局限性。

摘要

老年男性极易受到前列腺疾病的影响，例如良性前列腺增生、前列腺炎和前列腺癌。这些疾病共同构成了全球重要的健康负担，并是男性患病的主要原因。类器官模型通过模拟上皮结构与功能的关键特征，已彻底改变了疾病建模的方式 体外然而，类器官的闭合管腔结构限制了对顶膜表面的实验操作，阻碍了宿主-病原体相互作用的研究。为克服这些挑战，我们建立了一种生理相关性良好的培养系统，将小鼠前列腺类器官来源的细胞以二维（2D）模型形式接种。该方法在维持上皮细胞关键特性的同时，提供了对顶膜表面的直接接触途径。本逐步操作方案详细描述了成熟小鼠前列腺类器官的解离过程以及支持细胞贴附、增殖和分化的最佳接种条件。免疫荧光显微镜检测证实，该类器官来源模型表达前列腺特异性标志物，并准确再现了前列腺组织的细胞空间结构。跨上皮电阻（TEER）测量结果，结合F-actin和紧密连接蛋白染色，进一步验证了细胞的分化状态及屏障结构的形成。利用尿路致病性大肠杆菌感染该模型 大肠杆菌 (UPEC) 在研究宿主-病原体相互作用方面展现了其应用价值。该模型为研究前列腺上皮生物学及疾病机制提供了一个有价值的平台，尤其适用于宿主-病原体相互作用的研究以及潜在治疗策略的评估。

引言

前列腺是一个位于膀胱下方、包绕尿道的小型器官。它是男性生殖系统的重要组成部分，主要功能是产生前列腺液。这种液体可占精浆总量的30%，在精子通过女性生殖道的过程中起着营养和保护的关键作用1。前列腺疾病，如前列腺炎、良性前列腺增生和前列腺癌，发病率很高，对全球医疗系统构成了重大负担2,3,4,5。尽管良性前列腺增生和前列腺癌已被广泛研究，但前列腺炎，尤其是细菌性前列腺炎，仍相对研究不足。全球最多有16%的男性受到前列腺炎影响6,7，其中约10%的病例由细菌感染引起。尽管该病发病率较高，但目前对细菌性前列腺炎的认识仍然有限。Escherichia coli （E. coli）菌株，特别是尿路致病性E. coli（UPEC），是导致细菌性前列腺炎的主要原因8,9。

前列腺感染分子机制的研究因缺乏生理相关性模型而受到限制 体外 模型。传统上，大多数前列腺疾病研究依赖于细胞系或动物模型。特别是，诸如 LNCaP 或 RWPE-1 等癌变或转化细胞系已被广泛用于模拟前列腺疾病及其对治疗的反应。10,11,12,13然而，这些模型缺乏健康或癌变前列腺上皮的细胞组成及其复杂性。此外，许多其他研究采用动物模型（主要是小鼠模型）来探讨有关前列腺感染、免疫反应、前列腺肿瘤生长及转移的不同假设。14,15,16,17尽管这些模型迄今为止最为先进且信息量丰富，但通常会引发伦理问题，需要耗费大量时间和资源，且成本较高。相比之下， 离体 组织外植体和原代细胞培养也已被用于药物对组织反应或癌症发生的短期研究18,19,20然而，这些模型的寿命有限，且新鲜人体组织的获取通常受限。

源自成体干细胞的三维（3D）类器官培养已成为模拟上皮组织的一种有前景的替代方法 体外与传统细胞系不同，类器官保留了原始上皮组织的关键特征，例如细胞异质性、组织特异性结构以及功能特性21,22,23与原代细胞培养相反 离体 类器官培养物可长期扩增和传代，而不会进入衰老状态。这些特性使得类器官系统特别适用于在生理相关背景下研究疾病及宿主-病原体相互作用。前列腺类器官已从健康和癌变的人体组织以及小鼠模型中成功建立，主要用于前列腺癌研究24,25,26然而，在感染研究中，类器官的三维结构带来了显著挑战，主要原因是腔内细胞表面难以接触。传统上，完整的三维类器官感染通常通过显微注射病原体实现，或先将类器官解离为片段或单个细胞，再与病原体共孵育23在此，类器官的大小和三维结构的变异性可能影响实验的可重复性与通量。作为一种替代方案，顶膜朝外的类器官可克服管腔不可及性的局限。将类器官以悬浮方式培养于超低吸附细胞培养板中，或培养于涂覆非黏附性表面活性剂的表面上，可诱导类器官极性的逆转。结果使顶膜朝向外部，从而可直接用于病原体感染研究。27,28然而，这些培养物无法长期维持，类器官大小和细胞数量的变异性也给感染复数（MOI）的确定带来困难。此外，极性逆转的潜在机制及其对类器官细胞的影响尚未完全阐明。为克服类器官作为 体外 感染模型，已利用胃、肠或肺等器官的类器官开发出具有顶侧可及性的类器官模型29,30,31此类系统可保留上皮细胞的主要特征，并更便于进行操作、成像以及对病原体和/或药物的可控暴露。然而，支持细胞分化的培养条件并不总能从类器官培养体系直接转化至二维培养模型。31,32.

在此，我们描述了一种利用小鼠前列腺类器官构建顶侧可接触的前列腺上皮模型的实验方案。该模型此前已在我们的实验室中建立并验证，证明其与天然前列腺组织具有高度相似性，并适用于涉及尿路致病性大肠杆菌（UPEC）的感染生物学研究。32该系统在密切模拟前列腺上皮细胞组成和极性的同时，为实验操作提供了更便捷的可及性。此外，我们展示了其在研究前列腺中宿主-病原体相互作用方面的适用性，为相关研究提供了一种更易操作的替代方案 体内 相较于传统细胞系或三维类器官模型，该模型是一种更为接近生理状态的系统。

方案

伦理声明：所有动物实验均符合维尔茨堡大学的动物护理与使用指南，并依照相关机构及政府法规获得批准。本研究仅使用了由本机构其他研究团队因独立研究目的实施安乐死的野生型小鼠。根据“3R原则”（替代、减少、优化），未为本研究专门处死任何动物。

注意：本方案基于作者先前发表的一项研究32。文中所述所有步骤均须在无菌生物安全柜中，采用适当的无菌技术并佩戴合适的个人防护装备进行操作。小鼠前列腺类器官来源于C57BL/6小鼠，并如先前所述在三维培养体系中维持培养25,26。为遵循3R原则，实验所用小鼠前列腺由动物设施提供，来源于因其他原因被安乐死的未经处理的野生型（WT）小鼠（至少6月龄）。简言之，将小鼠前列腺组织剪碎后，使用胶原酶和TrypLE Express酶分两步进行消化。随后将细胞接种于细胞外基质（ECM）液滴中以形成三维类器官。加入培养基进行培养，并每3天更换一次。三维类器官培养物每周传代一次，并从第3代开始用于二维接种。本方案采用培养1周的小鼠前列腺类器官，将其接种至二维培养表面。本方案无需使用ECM蛋白包被组织培养板。

1. 前列腺类器官模型的建立

  1. 三维类器官分离
    1. 从24孔板中所需数量的孔中吸除培养基。每孔加入500 µL adDMEM/F12+/+培养基（参见材料表）。
    2. 使用P1000移液器机械性破坏ECM液滴。将悬液收集至15 mL锥形离心管中。每管最多收集两个孔的样品。
    3. 用adDMEM/F12+/+补至 10 mL。轻轻倒置管体3–4次以混匀。在4 °C下以450 ×g离心5分钟。
  2. 将三维类器官解离为单细胞
    1. 吸除上清液。将沉淀重悬于2 mL预热（37 °C）的TrypLE Express酶溶液中，该溶液需添加10 µM RHOKi。
    2. 在37 °C水浴中孵育15分钟。每隔5分钟使用P1000移液器混匀细胞悬液。
      ​注意：在倒置显微镜下使用4倍物镜观察细胞悬液，确认细胞基本呈单细胞状态。允许存在少量2–3个细胞的小聚集体。通常15分钟孵育已足够，但可根据需要适当延长。
    3. 加入adDMEM/F12+/+至10 mL。轻轻倒置管体3–4次以混匀。在4 °C下以450 × g离心5分钟。
  3. 接种单细胞悬液
    1. 吸除上清液，注意不要扰动沉淀。将细胞沉淀重悬于含10 µM RHOKi的培养基中（每孔用于步骤1.1.1的三维类器官使用300 µL培养基）。
      注意：培养基成分为：Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12、10 mmol L−1 HEPES、1× GlutaMAX、1× B27、1 mM N-乙酰半胱氨酸、10% Noggin条件培养基、10% R-spondin 1条件培养基、50 ng·mL-1 EGF、1 nM 5α-双氢睾酮（DHT）、0.2 µM TGFβi以及100 ng·mL-1 Primocin（参见材料表）。进行感染实验时，应使用不含Primocin的培养基。
    2. 使用Neubauer计数板对悬液中的细胞数量进行计数。
    3. 将细胞悬液用含10 µM RHOKi的培养基稀释至浓度为62,500 cells·mL-1。每孔加入200 µL细胞悬液接种于48孔板（厂家为组织培养处理过的板，参见材料表），或每孔300 µL接种于腔室载玻片（µ-滑片，参见材料表）。将板置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中。
      注意：步骤1.1.1中每孔三维类器官通常可获得约200,000个细胞。
    4. 一天后，大多数单细胞已贴附于二维培养表面。每2–3天更换一次培养基。7天内可达到汇合状态。
      注意：RHOKi仅在初始接种时添加，后续换液时不再添加。
  4. 诱导类器官模型分化。
    注意：按照以下步骤操作可获得富含腔样细胞的分化型类器官模型。
    1. 向细胞悬液（步骤1.3.3）中添加10 nM DHT。后续换液（每2–3天一次）也使用含10 nM DHT的培养基。
      注意：若细胞悬液（及后续换液）中未添加DHT，则类器官模型将富含基底细胞。

2. 跨上皮电阻（TEER）测量

  1. 以 62,500 个细胞·mL-1 的浓度接种类器官细胞悬液，每孔加入 300 µL（来自步骤 1.3.3.），接种于每孔含 40 个电极的 8 孔 PET µ-载玻片上（参见 材料表）。向其中一个不含细胞的孔中加入 300 µL 步骤 1.3.1 中所述的培养基。
    注意：不含细胞的孔用作测量的空白对照。
  2. 将 µ-载玻片连接至基于阻抗的细胞分析系统（参见 材料表），并将 16 孔工作站置于组织培养孵育箱中。在 400 Hz 频率下连续测量跨上皮电阻（TEER）7 天，每 2–3 天更换一次培养基。

3. 免疫荧光染色

注意：本方法中，请确保将细胞接种于腔室载玻片（µ-slide）中（参见材料表），此类载玻片适用于高分辨率显微镜成像。

  1. 在选定的时间点，移除培养基，并用 1× PBS 洗涤细胞 3 次。在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞 15 分钟（避免光照）。
    警告：4% 多聚甲醛可能引起过敏性皮肤反应、严重眼损伤，并可能具有致癌性。操作时务必穿戴适当的个人防护装备（PPE）。避免吸入粉尘、烟雾、气体、雾气、蒸气或喷雾。佩戴防护手套，并确保受污染的衣物在实验室内部保存，直至经过适当去污处理。内容物及容器应通过经批准的废弃物处理设施进行处置。
  2. 固定后，用 1× PBS 洗涤细胞 3 次（每次 5 分钟）。在室温下用 0.5% Triton X-100（参见 材料表）对细胞进行透化处理 15 分钟。
    警告：Triton X-100 会引起皮肤刺激和严重眼损伤。对水生生物具有剧毒且具有长期持续影响，并可能在环境中引起内分泌干扰。操作时应佩戴防护手套以及眼和面部防护用具。内容物及容器应通过经批准的废弃物处理设施进行处置。避免释放至环境中。
  3. 用 1× PBS 洗涤细胞 2 次（每次 5 分钟）。在室温下用封闭缓冲液（含 1% BSA 的 PBS，参见 材料表）封闭细胞 30 分钟。
  4. 将一抗用封闭缓冲液（含 1% BSA 的 1× PBS）稀释后，在 4 °C 摇床上与细胞孵育过夜。次日在室温下继续孵育 1 小时。（一抗稀释比例参见 材料表）。
    注意：若使用鬼笔环肽（phalloidin）染色 F-actin 或使用 CellMask 染色质膜（参见 材料表），请跳过步骤 3.4。
  5. 用 1× PBS 洗涤细胞 3 次（每次 5 分钟）。将二抗、鬼笔环肽或 CellMask（参见 材料表）用封闭缓冲液（含 1% BSA 的 1× PBS）稀释后，在室温下与细胞孵育 1 小时。
  6. 用 1× PBS 洗涤细胞 3 次（每次 5 分钟）。在室温下用 Hoechst（参见 材料表）稀释于 1× PBS 中对细胞孵育 15 分钟，以染色细胞核。
  7. 用 1× PBS 洗涤细胞 3 次（每次 5 分钟），最后保留 1× PBS 覆盖细胞。于 4 °C 保存。
  8. 使用激光扫描共聚焦显微镜或荧光显微镜对带腔室的 µ 载玻片（参见 材料表）进行成像。
    注意：可使用荧光显微镜配备 20× 物镜获取概览图像，以评估整体感染效率和分布情况。使用配备 40× 水浸物镜的共聚焦显微镜获取更高分辨率图像，以观察附着于或内化于上皮细胞中的单个细菌。根据所用荧光染料的不同，分别采用 405、499、590 和 653 nm 的激光激发。发射光检测范围设置如下：Hoechst 为 415 至 516 nm，GFP 或 Alexa 488 为 509 至 573 nm，mCherry 或 Alexa 594 为 600 至 651 nm，Alexa 647 为 663 至 720 nm。Z 轴层扫以 0.5 µm 步长采集，覆盖整个上皮层厚度。图像采集分辨率为 1024 × 1024 像素，扫描频率为 400 Hz，帧平均设为 4，以获得良好的图像质量。在同一实验的不同条件下，激光功率和探测器增益保持恒定。所有成像参数（包括激光功率、探测器增益、扫描速度和平均次数）应根据所使用的共聚焦显微镜进行优化和调整。

4. 尿路致病性细菌感染 E. coli （尿路致病性大肠杆菌，UPEC）

注意：以下步骤请使用未添加普列霉素（Primocin）且已培养 7 天的类器官模型（参见材料表）。

本研究使用了尿路致病性大肠杆菌（E. coli）菌株UTI89，该菌株通过质粒pFPV-mCherry（氨苄青霉素抗性）组成型表达mCherry蛋白。

警告：处理传染性病原体（生物安全二级）时，须佩戴手套以及适当的眼部和面部防护装备。实验过程中必须穿好完全扣紧的实验服。所有操作均应在经过认证的生物安全柜内进行。处理生物材料后，须对工作台面进行去污，并彻底洗手。生物安全二级废弃物应收集在指定的、适用于高压灭菌的生物危害容器中。在丢弃前，须通过高压灭菌或其他适当的去污方法对废弃物进行去污处理。

  1. 感染实验前3天，将UPEC菌株划线接种于添加相应抗生素的LB琼脂平板上（本方案中使用氨苄青霉素，100 µg·mL-1），在37 °C下培养16–24小时。
    注意：某些抗生素可能引起过敏反应或接触性刺激，若处置不当还可能导致抗菌素耐药性。配制和添加抗生素时，务必在生物安全柜内操作，并穿戴适当的个人防护装备（手套和眼部防护）。含抗生素的溶液应作为化学废弃物，通过经批准的废弃物处理机构进行处置。
  2. 感染实验前2天，从琼脂平板（步骤4.1）上挑取单个UPEC菌落，接种至3 mL添加相应抗生素（氨苄青霉素100 µg·mL-1）的LB液体培养基中。在37 °C静置培养12–16小时。
  3. 感染实验前1天，涡旋振荡步骤4.2中的细菌培养物，测定其OD600。根据以下公式计算所需培养物体积，用于接种3 mL含氨苄青霉素（100 µg·mL-1）的LB液体培养基，使其初始OD600为0.05：体积（µL）=（0.05 × 3,000 µL）/ 实测OD600。将计算所得体积的培养物加入新鲜LB液体培养基中，在37 °C静置培养24小时。
    注意：步骤4.2中过夜培养物的OD600应在1.7至2.2之间。
  4. 感染当天，涡旋振荡步骤4.3中的细菌培养物，测定其OD600。取OD600为1的培养物，于室温下以12,000 × g离心2分钟，弃去上清液。
  5. 用1 mL不含DHT且不含Primocin的类器官培养基重悬菌体，并稀释至感染复数（MOI）为100。
    注意：在第7天时，48孔板中每孔约含有150,000个细胞。该数值是通过多次实验在感染前对单孔细胞计数得出的估计值。为准确调整MOI，建议在感染前额外接种一孔用于细胞计数。为确定所需细菌悬液（步骤4.4）的体积，将每孔细胞数乘以MOI，得到每孔所需细菌总数，再除以细菌浓度（8 × 10⁵ 细菌/µL），即可获得所需体积（µL）。
  6. 将类器官模型的培养基更换为含细菌的培养基。根据培养表面积调整体积：48孔板每孔使用200 µL，µ-载玻片每孔使用300 µL。在细胞培养箱中于37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。
  7. 孵育结束后，吸除含细菌的培养基。用adDMEM/F12+/+洗涤孔内3次，以去除胞外细菌。
  8. 加入含50 µg·mL-1庆大霉素的培养基，以杀灭胞外细菌。孵育30分钟。
    注意：庆大霉素的浓度可能需要根据所用细菌菌株进行调整。若使用高于50 µg·mL-1的浓度，建议检测细胞毒性。
  9. 移除培养基，更换为含10 µg·mL-1庆大霉素的新鲜培养基，继续完成剩余感染时间。
    按照第3节对感染后的细胞进行荧光染色处理，或按照第5节通过流式细胞术进行定量分析。

5. 通过流式细胞术进行感染定量

  1. 吸去培养基，用 1× PBS 洗涤细胞 3 次。加入 100 µL TrypLE Express 酶使细胞脱落。孵育 5–10 分钟，直至所有细胞完全脱落。
    注意：每种实验条件使用 48 孔板中的一个孔即可。
  2. 收集细胞悬液，转移至 96 孔板（锥底）的一个孔中。加入 100 µL 流式细胞仪缓冲液（1× PBS、10% FBS、5 mM EDTA）以灭活 TrypLE Express 酶。
  3. 在 4 °C 条件下，以 450 × g 离心 96 孔板 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 150 µL 流式细胞仪缓冲液中。
  4. 使用流式细胞仪 获取数据并定量感染细胞（参见 材料表）。
    注意：流式细胞术检测采用 488 nm 激光激发，615/20 nm 发射滤光片检测 mCherry 阳性细胞。数据采集时使用高流速（66 µL·min⁻¹），每样本至少收集 10,000 个事件，并仅包含前向散射高度值大于 80,000 的事件。通过与未感染（ naïve）对照组比较 mCherry 荧光信号来鉴定感染细胞，同时排除碎片和双联体。可在设门策略中加入活力标记物（如碘化丙啶或其他活/死染料）以评估细胞活力。在初次使用该模型时，此步骤尤为有用，可确保细胞解离过程未对细胞造成不良影响。

结果

本方案描述了一种基于类器官的小鼠前列腺上皮模型的构建方法，该模型可重现天然组织上皮区室的细胞类型及转录表达特征。该模型利用来自成年小鼠前列腺组织的三维成体干细胞类器官构建而成。这些类器官培养物在体外维持培养，并每周传代一次。对于基于类器官的模型，工作流程的第一步（图1A）始于使用培养7天的三维类器官。此培养时间对于类器官达到适宜的大小和细胞密度，以便后续接种至二维表面至关重要。传代后，将类器官的小片段（图1B，第0天）接种于细胞外基质（ECM）中并使其生长。随着时间推移，它们在第7天发育为具有明确内腔的大型球状结构（图1B）。将培养7天的类器官解离为单细胞后，使用与三维类器官培养相同的培养基（1 nM DHT）将细胞接种至组织培养处理过的培养板上（图1C，第0天），以形成单层细胞。至第1天，贴壁细胞已开始增殖。在随后的几天中，单层细胞不断扩展，并在第3至第5天之间达到汇合状态，明场显微镜观察可证实此现象（图1C）。为表征细胞形态随时间的变化，并监测基于类器官的模型达到汇合状态的时间点，我们使用CellMask对细胞膜进行染色，并在多个时间点进行荧光成像分析（图1D）。

由于雄激素受体（AR）信号通路是前列腺细胞分化的重要调控因子，且已有研究显示，通过调节类器官培养基中睾酮（或DHT）的浓度，可引导干细胞向基底细胞或腔细胞定向分化32，我们通过调节培养基中的DHT浓度，以促进腔细胞（DHT 10 nM）或基底细胞（无DHT，对照组；方法1, 图2A）。如图所示 图2 （B-F），未观察到细胞生长或融合度存在显著差异。如预期所示，在对照条件（不含双氢睾酮DHT的类器官培养基）下，大多数细胞表达细胞角蛋白5（KRT5），即前列腺基底干细胞的标志物图2B，E）。相比之下，仅有少数细胞表达低水平的CD24a，即分化型前列腺腔细胞的标志物（图2B，F).

如我们先前所述32，添加1 nM DHT可产生包含基底细胞和腔样细胞的混合细胞群。然而，CD24a的表达水平仍然较低，表明向腔样细胞的分化不完全（图2C、F32）。将DHT浓度提高至10 nM可在培养7天后促进腔样细胞的完全分化，同时仍保留部分基底细胞（图2D–F）。基于类器官模型的分化情况也可通过明场显微镜进行评估。尽管在细胞密度较低时不同培养条件之间的差异并不明显（第0–5天，图1C，附加图1A），但在培养第7天时，三种培养条件下的细胞形态和外观在明场显微镜下已呈现出明显且可区分的特征（图1C，附加图1A、B）。在无DHT的条件下，细胞形态较扁平且不规则；而在含10 nM DHT的条件下，细胞排列紧密，呈多边形，呈现出类似鹅卵石的形态特征（附加图1B）。

值得注意的是，三维类器官培养物在不同浓度的双氢睾酮（DHT）培养条件下也发生了形态学变化。具体而言，类器官大小呈现出明显的剂量依赖性增加，在10 nM DHT存在时形成最大的类器官（图1B，补充图2A、B）。这些结果表明，雄激素受体（AR）信号通路不仅对细胞分化至关重要，而且在调控小鼠前列腺类器官生长动态中也发挥关键作用。

为了评估模型的上皮完整性和极化状态，我们对在无DHT或含10 nM DHT条件下培养的类器官模型进行了跨上皮电阻（TEER）测量。在两种条件下，TEER值均随时间增加，但在10 nM DHT存在时显著更高（图3A），表明上皮屏障功能增强。这一结果得到了肌动蛋白丝phalloidin染色的支持，肌动蛋白丝在腔内前列腺上皮细胞的细胞间连接处通常组织成顶端环状结构。在10 nM DHT条件下，肌动蛋白环比对照组更清晰，提示细胞极性和上皮组织性增强（图3B）。此外，对闭合小带蛋白1（ZO-1）的免疫荧光染色显示，在10 nM DHT条件下紧密连接数量增加（图3C），进一步支持上皮屏障完整性的增强以及向腔内表型的分化。正交投影显示，用10 nM DHT培养的类器官表现出明确的上皮极性（补充图3A）。基底KRT5⁺细胞位于底部，而腔内CD24a⁺细胞沿上皮层分布，并在顶端侧显示出更强的染色强度。这种结构与小鼠前列腺组织中观察到的结构相似（补充图3B）。值得注意的是，人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）的数据表明，这些标志物在人类前列腺组织中具有类似的定位方式，即KRT5⁺基底细胞位于CD24a⁺腔内层下方（补充图3C）33。相比之下，在对照组或1 nM DHT条件下培养的细胞未显示出基底和腔内标志物之间的明显空间分离，且细胞高度远低于10 nM DHT条件下的细胞（补充图3A）。这表明，10 nM DHT的添加可促进2D模型中上皮细胞的分化和极化，其程度可与天然前列腺上皮相媲美。由于在10 nM DHT条件下培养的类器官模型在结构上与天然小鼠前列腺上皮高度相似（图2D，补充图3A,B），因此可作为研究宿主-病原体相互作用的相关平台。为展示该模型的应用性，我们以尿路致病性大肠杆菌（UPEC）感染为例，具体使用UTI89菌株——这是泌尿生殖道研究领域中最常用的UPEC菌株之一。如图4A所示，细菌在LB肉汤中培养24小时（见方法4描述），随后与细胞共孵育1小时。使用庆大霉素杀灭胞外细菌，以定量细菌侵袭和胞内复制情况。在感染类器官模型后，UPEC大量黏附于上皮细胞表面（0 hpi；图4B左图；图4C）。随后，在庆大霉素处理后（1 hpi），UPEC阳性细胞数量显著减少，这是由于胞外细菌被清除所致（图4B中图；图4C）。在24 hpi时，感染细胞数量保持不变（图4C），但共聚焦显微镜成像显示，胞内细菌持续复制，形成类似群落的结构，与先前在膀胱上皮中报道的结构相似（图4B右图）。通过使用未感染（naïve）对照作为参考，并排除碎片和双联体后，利用mCherry荧光识别感染细胞（补充图4）。

类器官到单细胞悬液过程、细胞生长、腔面细胞和基底细胞的显微镜图像。
图1：前列腺类器官及基于类器官模型随时间变化的工作流程与形态学演变概览。（A）实验流程示意图（方法1）。（B）明场图像显示补充1 nM DHT的前列腺类器官在第0、1、3、5和7天（从左至右）的形态发育情况。比例尺：200 µm。（n = 3）。（C）补充1 nM DHT的基于类器官模型的明场图像，拍摄于第0、1、3、5和7天（从左至右）。比例尺：200 µm。（n = 3）。（D）补充1 nM DHT并用CellMask（红色）染色的基于类器官模型的代表性免疫荧光显微图像，拍摄于第1、3、5和7天（从左至右）。细胞核使用Hoechst 33342复染（蓝色）。比例尺：50 µm。（n = 3）请点击此处查看该图的放大版本。

DHT对细胞分化的影响；免疫荧光；KRT5、CD24a标志物；带p值的柱状图。
图2：DHT在类器官模型中调控谱系分化。 (A) 用于分化的不同实验条件的示意图。(B–D) 类器官模型在(B)无DHT（对照组）或(C)含1 nM或(D)10 nM DHT条件下培养7天的代表性免疫荧光显微图像。图像分别在第1、3、5和7天（从左至右）采集。类器官模型经CD24a（腔面细胞标志物，绿色）和KRT5（基底细胞标志物，洋红色）染色。细胞核使用Hoechst 33342复染（蓝色）。比例尺：50 µm。（n = 4）。(E,F) 在无DHT（对照组）、1 nM或10 nM DHT条件下培养的类器官模型中，(E) KRT5+ 和 (F) CD24a+ 细胞的图像定量分析。数据以每视野阳性细胞百分比表示。统计检验：单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey事后检验。请点击此处查看该图的放大版本。

TEER分析示意图，显微镜图像显示DHT处理细胞中F-actin和ZO-1的表达。
图3：使用10 nM DHT诱导分化的类器官模型相较于对照组显示出更高的细胞极化水平。（A）类器官模型在无DHT（对照组；粉色）或含DHT（10 nM；绿色）条件下培养7天后的TEER分析结果。误差线表示标准差（n = 3）。统计检验方法：单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey事后检验。（B,C）类器官模型在无DHT（对照组；上方）或含10 nM DHT（下方）条件下培养7天后的代表性免疫荧光显微图像，分别针对（B）F-actin（红色）和（C）ZO-1（红色）进行染色。细胞核使用Hoechst 33342复染（蓝色）。比例尺：50 µm。（n = 3）请点击此处查看该图的放大版本。

UPEC 培养感染过程；显微镜图像（细胞核/UPEC）、流式细胞术结果图。
图 4：类器官模型中感染动态的分析。（A）感染流程示意图（第 4 节）。（B）代表性免疫荧光显微镜图像，显示感染后 0、1 和 24 小时（hpi；从左至右）的类器官模型。UPEC 以红色显示，细胞核用 Hoechst 33342 复染（蓝色）。比例尺：50 µm。（n = 3）。（C）感染后 0、1 和 24 小时 UPEC 阳性细胞（mCherry 阳性，即感染细胞）的流式细胞术分析。门控策略见补充图 4。误差线表示标准误（SEM）（n = 3）。统计检验：单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey 事后检验。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：类器官模型随时间推移的形态学演变。（A,B）类器官模型在（A）无（对照组）和（B）含有10 nM DHT条件下，于第0、1、3、5和7天（从左至右）拍摄的明场图像。比例尺：200 µm。（n = 3）请点击此处下载该文件。

补充图2：双氢睾酮浓度影响三维前列腺类器官的生长。（A）类器官模型在无双氢睾酮（对照组；上方）和含10 nM 双氢睾酮（下方）条件下的明场图像，分别在第0、1、3、5和7天拍摄（从左至右）。比例尺：200 µm。（n = 3）。（B）在三种不同条件下培养第7天的三维类器官大小的定量分析：无双氢睾酮（对照组；粉色）、1 nM 双氢睾酮（紫色）和10 nM 双氢睾酮（绿色）。统计检验：采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析（n = 3）。请点击此处下载该文件。

补充图3：前列腺类器官形态及上皮极性的表征。（A）共聚焦z轴层扫的正交投影图像，展示在不同二氢睾酮（DHT）浓度（对照、1 nM 和 10 nM DHT）下上皮组织结构及顶-基底极性。基底细胞用KRT5（品红色）标记，腔面细胞用CD24a（绿色）标记。比例尺：50 µm。（B）OCT包埋的小鼠前列腺组织免疫荧光染色，显示基底层（KRT5，品红色）和腔面层（CD24a，绿色）上皮标志物表达。细胞核用DAPI复染（蓝色）。比例尺：50 µm。简言之，小鼠组织样本经4%多聚甲醛固定，30%蔗糖中过夜脱水，随后进行OCT包埋32。切片在PBS中再水化10分钟，按第3节步骤进行免疫染色。（C）人前列腺组织中CD24a和KRT5蛋白表达的免疫组织化学分析（图C数据来源于《人类蛋白质图谱数据库》（版本25.0；Human Protein Atlas proteinatlas.org），Uhlén M. 等(2015)33，https://www.proteinatlas.org/ENSG00000186081-KRT5/tissue/prostate）。请点击此处下载该文件。

补充图4：用于鉴定感染细胞的流式细胞术设门策略。 首先根据侧向散射高度（SSC-H）与前向散射高度（FSC-H）对细胞设门，以排除碎片；随后通过SSC-H与侧向散射面积（SSC-A）设门，选择单细胞。最后通过计数与PE-Texas Red-H荧光的直方图（Counts versus PE-Texas Red-H）鉴定mCherry阳性（感染）细胞。请点击此处下载该文件。

讨论

多种疾病可影响前列腺，包括良性前列腺增生、前列腺炎和前列腺癌。这些疾病发病率较高，对患者的生活质量有显著影响2尽管这些疾病对医疗保健具有重大影响，但目前对其认知仍十分有限，尤其是对非癌性病变中潜在机制及宿主反应的理解。这在很大程度上是由于缺乏生理相关性良好的实验模型。一方面，永生化细胞系无法真实反映正常前列腺上皮的复杂性或分化状态；另一方面，动物模型（主要是啮齿类动物）存在伦理争议，且成本较高。另一种替代方案是使用人原代细胞或患者来源的组织外植体，然而新鲜前列腺组织的获取受限，严重制约了其广泛应用。这些局限性凸显了开发其他替代模型的迫切需求 体外 具有生理相关性、易于使用且实验上可操作的系统。在此背景下，成体干细胞类器官技术已彻底改变了疾病建模研究。这些三维培养物具有自我组织能力，能够维持上皮细胞特性及上皮细胞多样性23,34,35,36,37,38尽管其三维结构已在癌症研究、药物测试和再生医学中实现了应用23,34,35,36,37,38,39,40,41其封闭的结构，顶面朝内，为实验操作带来了实际困难，尤其是当 体外 感染模型。顶端朝外类器官通过逆转上皮细胞极性，使顶端表面暴露，从而可用于直接感染研究27,28然而，由于其个体大小存在差异、对病原体的暴露不均以及在长期感染过程中较为脆弱，它们作为感染模型的有效性可能受到限制。

本文介绍一种基于类器官的小鼠前列腺模型构建方案，该模型可重现天然小鼠上皮组织的上皮细胞组成和转录谱特征，同时便于对顶端表面进行操作。该模型已在我们先前的研究中得到优化32，能够精确控制多个关键实验变量，包括接种密度、刺激物的均匀暴露、明确的细菌-细胞比例（MOI），以及高通量成像参数，而这些参数在传统的三维类器官系统中往往难以标准化。

根据动物实验的“3R”原则（替代、减少、优化）42，本模型所用的原代细胞来源类器官取自因非本研究目的（如繁育）而被处死的野生型 naïve 小鼠。前列腺组织通过附近动物设施的捐赠获得，从而减少了为本实验方案专门处死额外动物的需求。

类器官及基于类器官的模型若要稳健且可靠地实现分化，对于准确模拟天然组织的细胞组成和功能特性至关重要，从而确保其作为体外（in vitro）模型的相关性。类器官内部的细胞分化过程在很大程度上受培养基特定成分的影响，包括生长因子和药理学试剂（即药物抑制剂）的精确浓度。通过调控这些因素，可直接引导细胞向特定谱系分化，这已在多种类器官系统中得到证实。例如，在肠类器官中，去除WNT可促进肠上皮细胞的分化，而干扰素γ（interferon gamma）可进一步增强该过程（综述见38）。通过去除p38抑制剂和烟酰胺，或通过DAPT/DBZ抑制Notch信号通路，可诱导杯状细胞的分化（综述见38）。IGF-1和FGF-2也被证明可支持富含分泌细胞的培养物长期扩增43。此外，IL-22可促进潘氏细胞的分化，而肠内分泌细胞则可通过抑制Notch和BMP等信号通路产生38。类似地，当从培养基中撤除WNT时，胃类器官及基于类器官的单层培养可向颈黏液细胞（pit cells）方向分化 ；而在培养基中添加烟酰胺则可引导细胞向腺体表型（颈细胞和主细胞）分化31,44,45。

在前列腺中，雄激素受体（AR）在维持组织稳态中发挥关键作用46,47,48,49。由睾丸间质细胞产生的睾酮，在前列腺上皮细胞中通过5α-还原酶转化为双氢睾酮（DHT）。DHT激活AR，使其形成二聚体，转位至细胞核，并结合雄激素反应元件，调控参与细胞分化和稳态的基因表达50。先前的研究表明，在三维小鼠前列腺类器官中添加1 nM的雄激素足以诱导细胞向腔细胞分化51。其他研究也发现，补充维生素D（特别是1,25-二羟基维生素D）可通过抑制经典WNT信号通路并下调WNT家族成员DKK3，促进人前列腺类器官的生长并加速其分化52。然而，在这些研究中仅使用了三维类器官模型。我们之前的工作32及其他研究53表明，在三维类器官中添加10 nM DHT仍不足以实现完全分化。相比之下，采用本文所述的二维模型，即在二维培养条件下接种细胞并添加10 nM DHT，足以使模型分化至接近天然组织的状态32。要理解三维与二维模型之间的这种差异，尚需进一步研究，但该差异可能源于两种系统间不同的力学-物理信号，或与三维模型中细胞外基质（ECM）所含生长因子的存在有关。

成年前列腺组织中存在三种主要的上皮细胞类型：腔细胞、基底细胞和神经内分泌细胞。其中，迄今为止已发表的所有类器官模型中仅包含腔细胞和基底细胞。罕见的神经内分泌细胞的缺失提示当前的类器官培养方案可能尚未完全优化。在腔细胞与基底细胞之间，还存在一种前列腺中间细胞群体，被描述为表达腔细胞（如 CD24a）和基底细胞（如 SCA-1）标志物的过渡状态18,51。该亚群常位于尿道周围前列腺区域，因此常被称为尿道周围腔细胞54。尽管在某些特定分化或信号条件下的一些三维类器官系统中已有相关报道53,55，但在我们的系统中并未观察到腔细胞与中间细胞之间的明确分离32。一种可能的解释是，在三维类器官生成过程中，我们并未区分不同的前列腺区域；同时，为避免尿道细胞污染，我们移除了紧邻尿道前列腺连接处的组织。因此，来源于近端或邻近尿道区域的类器官培养物可能更具备生成中间细胞的能力。

屏障完整性被认为是成熟且分化上皮的一个标志性特征，可提供保护性屏障，防止毒素和微生物侵入下方组织。紧密连接（富含ZO-1蛋白）56在调节细胞旁通透性和维持上皮屏障完整性方面发挥关键作用57随着上皮细胞的分化，这些细胞间连接的成熟增强了屏障功能。58因此，评估屏障完整性是衡量屏障功能的重要指标 体外 上皮模型。在本方案中，我们展示了三种用于评估屏障完整性的互补方法：跨上皮电阻（TEER）测量、ZO-1 免疫荧光染色和 F-actin 染色。尽管这三种方法均可有效评估屏障完整性，但它们在所需设备和资源方面存在显著差异。TEER 测量可提供可随时间追踪的定量数值，从而动态反映屏障功能；然而，该技术需要特定的硬件和软件，而这些设备可能并非所有实验室都具备。相比之下，使用抗 ZO-1 抗体或鬼笔环肽（phalloidin）进行染色在时间和成本上更易操作（例如，鬼笔环肽染色可在约 3 小时内完成——第 3 节）。

本方案描述了如何利用3D小鼠前列腺类器官构建具有顶侧可及性的2D模型。多篇综述已概述了类器官及基于类器官的系统在研究宿主-病原体相互作用中的优势与局限性23,36,59在感染研究中，必须考虑病原体与宿主上皮相互作用的自然位点。在前列腺中，腔面细胞通常是病原体接触的第一位点，因此，对顶膜表面的可及性对于准确模拟感染动态至关重要。在传统的三维前列腺类器官中，顶膜表面朝向类器官腔内，无法直接接触。在此类模型中，病原体暴露通常需通过显微注射实现，该方法通量低且技术难度高；或者通过破坏类器官结构来实现，但会破坏上皮极性，导致非生理性的相互作用位点23相比之下，本方案中介绍的顶侧可及的2D模型可直接接触管腔表面，从而实现对病原体的可控且符合生理条件的暴露，精确调控感染复数（MOI），并兼容高通量、高分辨率或活细胞成像平台。本文展示了该模型作为一种 体外 使用UPEC参考菌株UTI89的感染系统，该菌株是代表引起细菌性前列腺炎主要致病菌种的常用参考菌株9然而，该模型可轻松调整用于研究其他前列腺病原体，例如 粪肠球菌 或 铜绿假单胞菌使其成为前列腺感染生物学研究的多功能平台。

三维类器官的解离是成功建立类器官模型的关键步骤。若未能充分解离三维类器官，导致产生较大碎片，会影响细胞在培养表面的黏附能力；而解离试剂作用时间超过30分钟则会降低细胞活力。此外，在解离与传代接种前保持约七天的稳定传代间隔至关重要，因为类器官的生理状态会显著影响其黏附和分化能力。另一个影响前列腺类器官模型成功建立的关键变量是接种密度。本实验所用的接种浓度已优化为适合7天内的分化过程。提高或降低该浓度可能导致分化时间发生变化。此外，接种前细胞重悬不充分会导致细胞在孔板中分布不均，造成细胞密度差异，从而影响细胞增殖和分化。同时，与其他类器官模型类似，不同批次的细胞外基质（ECM）或生长因子也可能影响类器官的生长和分化能力。因此，在更换生长因子批次或货号后，必须验证类器官模型是否仍能维持一致的表型。

一旦建立了类器官模型，还需仔细优化感染参数。根据不同的细菌菌株和所选的检测方法，通常需要使用不同的感染复数（MOI）以获得稳定且可重复的感染水平。对于尿路致病性大肠杆菌（UPEC）菌株UTI89（本文及文献32中使用）以及多种前列腺炎分离株32，MOI为100时即可在黏附、侵袭和复制等不同时间点获得足够数量的感染细胞。然而，如果细胞与细菌共孵育的时间需要超过1小时，则应使用较低的MOI，以防止UPEC在培养基中胞外过度生长，进而对细胞产生毒性。在本实验方案中，采用两种方法评估感染情况：I）流式细胞术定量感染细胞的比例；II）共聚焦显微镜观察细菌的定位。此外，也可采用其他多种方法，例如菌落形成单位实验检测细菌数量32、免疫染色检测宿主或细菌标志物32，或转录组学分析宿主反应谱。

尽管基于前列腺类器官的模型提供了一个具有生理相关性的系统，但在将其应用于感染研究时，仍需考虑若干局限性。该模型的一个主要限制是缺乏常驻或外周免疫细胞，这限制了其全面模拟宿主对感染的反应能力（例如免疫细胞募集或免疫介导的清除）。模型中缺失的其他重要组分包括脉管系统、间质和神经，这些都可能影响宿主与病原体之间的相互作用。引入其他细胞类型，如间质成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞，将有助于重建更完整的组织微环境。先进的共培养系统或“器官芯片”微流控平台可进一步支持复杂的细胞间相互作用，并实现对感染过程的动态研究。此外，在使用来自动物模型的类器官时，必须考虑物种特异性差异，尤其是在研究人类特异性病原体时。尽管我们先前的研究32表明，小鼠前列腺类器官模型中的发现可在人类组织中重现，但基因调控、受体表达或激素反应方面的种间差异仍可能限制该模型对人类生理的直接适用性。在条件允许的情况下，使用人源类器官将通过研究人类特异性病原体相互作用和宿主反应，提高模型的转化价值。尽管上述改进可增强类器官模型作为研究前列腺生物学、感染致病机制及治疗开发的强大工具，但我们所呈现的纯上皮模型提供了一个简化且区室化的系统，可在不受其他组织成分干扰的情况下，专注于上皮特异性宿主-病原体相互作用的研究。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作由BMFTR （FiRe-UPec，项目号01KI2107，资助C.A.）和德国研究基金会（DFG GRK 2157；“用于研究人类病原体微生物感染的3D组织模型”，项目11，资助C.A.）提供支持。我们感谢维尔茨堡大学医院的Natalie Burkard和Nicolas Schlegel在ECIS1600R设备使用方面提供的帮助。示意图使用BioRender.com制作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
48 孔板Sarstedt83.3923底部形状：平底
5α-雄甾烷-17β-醇-3-酮 双氢睾酮Sigma-AldrichA8380标记为 DHT。储存液为 10μM，溶于 100% 乙醇
每孔含 40 个电极的 8 孔 PET 载玻片 Applied Biophysics8W10E+用于 TEER 测量的载玻片
96 孔板Sarstedt82.1583底部形状：锥形
Advance Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基/F12 Thermo Fisher Scientific12634028当添加 10 mmol L−1 HEPES 和 1x GlutaMAX 后，标记为 adDMEM/F12+/+
氨苄青霉素RothK029.2 储存液浓度为 100 mg/mL
抗 CD24a 抗体Proteintech10600-1-AP一抗；稀释比例 1:100，溶于 1x PBS 含 1% BSA
抗角蛋白 5 Alexa Fluor 647 抗体 Abcam ab193895一抗；稀释比例 1:100，溶于 1x PBS 含 1% BSA
抗兔 IgG Alexa Fluor 488 抗体InvitrogenA21441二抗；稀释比例 1:500，溶于 1x PBS 含 1% BSA
抗 ZO-1 多克隆抗体Proteintech21773-1-AP一抗；稀释比例 1:750，溶于 1x PBS 含 1% BSA
B27，50xThermo Fisher Scientific12587010
牛血清白蛋白 (BSA) V 级，新西兰来源Roth8076.3封闭缓冲液组分，使用浓度为 1%，溶于 1x PBS
8 孔腔室载玻片 µ-SlideIbidi80806表面修饰：ibiTreat
锥形管 (15 mL)Sigma AldrichT1943平底更适合收集小量沉淀。 
乙二胺四乙酸二钠 2H2O (EDTA)Roth 8043.2自制：93.0 g 溶于 400 mL H2O，调节 pH 至 8.0，加 H2O 定容至 500 mL；0.5 M EDTA；流式细胞仪缓冲液组分
Dulbecco 平衡盐溶液 (DPBS)Gibco14190-144PBS
ECHO Revolve 显微镜 ECHO
ECIS Z-Theta -  基于阻抗的细胞分析系统Applied BiophysicsECIS Z-Theta系统包括：16 孔和/或 96 孔站；外部控制模块；笔记本电脑；ECIS 控制、采集和显示软件；用于自动细胞迁移和电穿孔的增强电场模块 
胎牛血清 (FBS) SuperiorSigma AldrichS0615流式细胞仪缓冲液组分；293T 细胞系培养基组分；HEK293T 细胞系培养基组分
Flash Phalloidin Red 594Biolegend424203稀释比例 1:250，溶于 1x PBS 含 1% BSA
流式细胞仪缓冲液1x PBS，10% FBS，5 mM EDTA
庆大霉素 Sigma AldrichG1272
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific35050-038L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，adDMEM/F12+/+ 的组分 
Harvard Biochrom Ultrospec 10 细胞密度计Fisher Scientific10704417
HCS CellMask Deep Red 染色剂Life TechnologiesH32721稀释比例 1:1,000，溶于 1x PBS 含 1% BSA
转染小鼠 Noggin-Fc 表达载体的 HEK293T 细胞系来自 Prof. Dr. Clevers 的细胞系用于生产 Noggin；培养基：500 mL DMEM，高糖，含 GlutaMAX 和丙酮酸盐 (Gibco Life Technologies, 31966) + 50 mL FBS；Farin 等，Gastroenterology 143.6 (2012): 1518-1529
HEPES Thermo Fisher Scientific15630056adDMEM/F12+/+ 的组分 
Hoechst 33342 Life TechnologiesH3570稀释比例 1:5,000，溶于 1x PBS
人表皮生长因子 (EGF) PeprotechAF-100-15储存液浓度 500 µg/mL
接种环Sarstedt86.1567.010
接种管Sarstedt62.515.006
Leica Stellaris 5 共聚焦显微镜Leica
LB 肉汤 (Luria Bertani Broth)Roth X968.1
MatrigelCorning356231细胞外基质 (ECM)
N-乙酰半胱氨酸 Sigma-AldrichA9165-25G储存液浓度 500 mM
Noggin CM
NovoCyte Quanteon Agilent流式细胞仪
多聚甲醛 (PFA)Sigma AldrichP6148使用浓度为 4%，溶于 1x PBS 含 4% 蔗糖
PrimocinInvivogenAnt-pm-1
Q-VETTES 半微量比色皿Ratiolab2712120
RHOKi (Y-27632)AbMoleM1817RhoA/ROCK 抑制剂；储存液浓度 10 mM
R-spodin1 CM
表达 R-Spondin1 的 293T 细胞系Sigma AldrichSCC111用于生产 R-spo1 CM；培养基：500 mL DMEM，高糖，含 GlutaMAX 和丙酮酸盐 (Gibco Life Technologies, 31966) + 60 mL FBS 
TGFβi (A-83-01)Tocris2939ALK4/5/7 抑制剂；储存液浓度 5 mM 
Triton X-100 Sigma AldrichT9284使用浓度为 0.5%，溶于 1x PBS
TrypLE Express 酶 Gibco12605028用于消化 3D 小鼠前列腺类器官的酶解细胞解离试剂
尿路致病性 Escherichia coli 菌株 UTI89来自 Prof. Dr. Dobrindt 的野生型菌株转化 pFPV-mCherry 质粒 (addgene #20956)

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