标准化分离与细胞因子预处理小鼠骨髓来源间充质基质细胞以增强免疫调节功能

摘要

本文展示了一种从小鼠骨髓中分离间充质基质细胞的实验方案，以及通过细胞因子预处理增强骨髓间充质基质细胞对免疫细胞免疫抑制作用的方法。

摘要

间充质基质细胞（MSCs）具有强大的再生能力和免疫调节功能。这些特性使MSCs成为治疗多种免疫系统疾病的有力细胞药物。骨髓是MSCs的主要来源，也是最常使用的来源。利用小鼠模型进行的临床前机制研究对于了解骨髓源性间充质基质细胞（BMSCs）在人类临床试验中的最佳给药策略至关重要。因此，小鼠MSCs制备过程的标准化对于获得更好的治疗效果也极为关键。本实验方案的核心目标是展示如何通过可控的干扰素-γ（IFN-γ）预刺激来增强BMSCs内在的免疫抑制特性。我们描述了从未经处理或经IFN-γ预激活的BMSCs中制备条件培养基（CM）的方法，并利用原代腹腔巨噬细胞评估其生物学活性。通过ELISA和流式细胞术分析，该方案详细说明了BMSC来源的分泌组——特别是经IFN-γ预刺激后——如何诱导抗炎型巨噬细胞极化，表现为IL-10分泌增加以及M2相关表面标志物的上调。总体而言，本方案建立了一个统一的框架，用于制备功能一致的小鼠BMSCs，并评估其免疫调节效力。通过减少技术变异性并提供可视化和操作上的清晰指导，该方案有助于提高临床前MSC研究的可重复性，并促进转化研究中MSC应用策略的优化。

引言

骨髓来源的间充质基质细胞（BMSCs）在临床前和临床研究中具有广泛的应用。由于其免疫原性低、易于获取以及具有多向分化潜能，BMSCs被视为在临床环境中用作细胞药物的有前景候选者^1,2,3。其免疫抑制和再生修复特性已在临床研究中被广泛用于治疗移植物抗宿主病（GVHD）⁴、脓毒症⁵和炎症性肠病（IBD）⁶等炎症性疾病。骨髓基质微环境包含一群异质性的基质细胞。然而，所有间充质基质细胞（MSCs）均符合国际细胞治疗学会（ISCT）所定义的标准，这些标准包括：贴壁生长能力、表达特定表面受体——人类为CD73、CD90和CD105，小鼠为CD29、CD44和CD90——不表达造血或内皮细胞标志物（如CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45、CD79a、HLA-DR），并具备向脂肪细胞、软骨细胞或成骨细胞分化的潜能⁷。

骨髓间充质干细胞（BMSCs）通过释放一组被称为分泌组（secretome）的旁分泌因子维持其功能，分泌组包括细胞因子、趋化因子、生长因子、细胞外囊泡以及多种其他可溶性及接触依赖性分子^8,9。间充质干细胞（MSCs）的分泌组通过与先天免疫系统组分双向相互作用来调节微环境¹⁰。MSCs与巨噬细胞相互作用过程中释放的因子可促使巨噬细胞向促炎或抗炎表型转化^11,12。相反，MSCs的功能状态也通过反馈机制受到局部免疫细胞——尤其是巨噬细胞——的调控¹¹。这种MSCs与巨噬细胞之间的相互作用对于MSCs的免疫抑制功能至关重要。在结肠炎小鼠模型中观察到，只有当巨噬细胞存在时，过继转移的MSCs才能减轻组织炎症。相比之下，在缺乏巨噬细胞的情况下，MSCs与B淋巴细胞或T淋巴细胞的相互作用不足以发挥其治疗作用¹³。

首个使用同种异体骨髓间充质干细胞治疗激素难治性移植物抗宿主病的III期临床试验由美国Osiris Therapeutics公司完成（NCT00366145）¹自那时以来，尽管基于临床前研究结果人们对临床试验寄予厚望，但已开展的大量临床前和临床研究显示，临床试验的成功率尚未达到预期。为了提高基于间充质干细胞（MSC）的临床试验成功率，优化药物递送策略至关重要。明确最佳给药途径、治疗性细胞剂量以及细胞在给药时的生理状态尤为关键。例如，在一项 体内 结肠炎小鼠模型研究表明，冷冻保存的间充质干细胞或静脉输注是次优的给药方法¹⁴.

不同的方法，如细胞因子预刺激、基因修饰或低氧预处理，已被广泛研究以增强间充质干细胞（MSCs）的功能 体内 持久性与治疗效用¹⁵在小鼠后肢缺血模型中，低氧预处理（2% O₂）₂通过上调热休克蛋白和78-kD葡萄糖调节蛋白（GRP78）的表达，增强了间充质干细胞的增殖和迁移能力¹⁶IL-1β（白细胞介素-1β）预刺激可增强间充质干细胞动员中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的能力¹⁷。之后 体内 递送后，间充质干细胞（MSCs）暴露于活化的T细胞和NK细胞分泌的IFNγ，从而增强MSCs中吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）的产生¹⁸IDO 是间充质干细胞分泌组中的关键组分，可降低 T 细胞增殖速率。有趣的是，当间充质干细胞与来源于 IFNγ-/- 小鼠的 T 淋巴细胞共培养时，其免疫抑制能力减弱。¹⁹研究表明，IFN-γ预处理可降低冻存间充质干细胞中T细胞介导的凋亡速率^13,20IFNγ预处理可改善骨髓间充质干细胞的治疗效果¹³ 所有这些证据共同表明，IFNγ在产生更强效的免疫抑制性MSCs中具有不可或缺的作用。

为了确定间充质干细胞（MSCs）最有效的递送方式，动物模型因其伦理上的可及性而被广泛使用。为了减少临床前研究结果的变异性，建立优化的MSCs制备工艺方法至关重要，该方法需确保高产量、高细胞活力以及长期的一致性²¹。MSCs的传代次数是一个重要的变量，可能产生不同的治疗效果。在体外（in vitro）培养过程中，传代可调控MSCs的特性与效力，经过一定次数的传代后，细胞会进入衰老状态²²。因此，在任何临床或临床前研究中，必须统一使用相同的MSCs传代次数。同样，采用特定的MSCs分离方案保持一致性，也是实现MSCs应用结果可重复性的关键因素。在众多方法中，基于抗体的细胞分选²³、阴性筛选法²⁴和酶消化法²⁵是常用的MSCs分离方法。然而，这些方法的适用性取决于细胞来源，不当使用会降低细胞得率、效力以及三系分化能力。

本文介绍了一种标准化的骨髓间充质干细胞（BMSCs）分离与表征实验方案，重点强调了推荐的传代次数、冻存技术以及BMSC来源的条件培养基的收集方法。我们还提供了一种干扰素-γ（IFN-γ）介导的MSC预激活方案，并最终展示了一项比较研究，揭示腹腔巨噬细胞对正常BMSCs与经IFN-γ预激活的BMSCs的不同反应。

方案

本研究经印度医学研究委员会-生殖与儿童健康国家研究所动物伦理委员会（IAEC 项目编号：09/23）以及威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理和使用委员会批准，并遵循其指导原则进行。实验选用6至8周龄的雌性C57Bl/6J小鼠，小鼠在特定病原体阴性（SPF）条件下繁殖并饲养，用于本研究。

注意：我们在进行实验时遵循了机构生物安全委员会（IBSC）制定的生物安全规程 体内 或 体外 研究。简言之，在动物实验中，我们采用轻柔的操作方式以减少动物的应激反应和受伤风险。我们佩戴适当的个人防护装备（PPE），包括护目镜、手套、实验服、口罩和一次性无菌帽。对于DMSO等生物危害性化学试剂，我们在生物安全柜中进行操作。生物危害性试剂或锐器均弃置于专用的废弃物容器中。

1. 小鼠骨髓间充质基质细胞的分离

注意：在收集后肢后，其余步骤应在组织培养用超净工作台中进行，并采用无菌操作技术²⁶。

1. 通过颈椎脱位处死小鼠，随后用70%乙醇彻底冲洗小鼠。使用眼科镊子轻轻提起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，并用剪刀小心剪开皮肤。
2. 轻轻向足部方向牵拉，分离皮肤。在髋关节和踝关节处剪断，取下后肢。
3. 迅速将后肢转移至含有冰冻DMEM培养基（添加1×青霉素/链霉素和2%胎牛血清）的容器中，以避免组织损伤，直至进行后续解剖操作。
4. 将每条后肢置于含有冰冻培养基的培养皿中。用镊子轻轻刮除股骨和胫骨干骺端的肌肉及结缔组织，剥离干净。将清理后的骨骼转移至另一含有冰冻培养基的新培养皿中。
5. 分离股骨与胫骨，随后在胫骨和股骨末端骨髓腔末端稍下方处进行剪切。在解剖股骨和胫骨过程中应尽可能保护骨髓腔。
6. 取一支1 mL无菌注射器（配备21 G针头），从培养皿中吸取培养基。用无菌镊子夹住分离的股骨，将针头轻轻插入骨髓腔，冲洗骨髓腔以获取骨髓细胞。重复此步骤直至骨骼变白。以相同方式冲洗胫骨。
7. 轻轻吹打培养皿中的液体，使细胞团块分散。使用70 μm滤网过滤细胞悬液，以去除骨碎片。收集滤液，并在室温下以230 × g 离心5分钟。
8. 弃去上清液，用完全培养基（DMEM、10% FBS、5% L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素）重悬细胞沉淀。使用台盼蓝染色法结合血细胞计数板测定细胞产量和活力。
9. 将细胞以5000个细胞/cm²的密度接种于75 cm²组织培养处理过的培养瓶中，使用完全DMEM培养基¹³。培养48小时后通过更换培养基去除非贴壁的造血细胞。每隔3-4天更换一次新鲜培养基。
   注意：建议使用细胞培养瓶而非培养皿，以避免污染。不要频繁将培养瓶从培养箱中取出观察细胞，以免干扰细胞生长。
10. 为分离贴壁细胞，先用PBS洗涤细胞一次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，使细胞在胰酶中孵育5分钟，有助于细胞从培养瓶壁脱落。
11. 加入完全培养基终止消化，重悬细胞，并在室温下以230 × g 离心5分钟。弃去上清液，向细胞沉淀中加入完全DMEM培养基，重悬后以5,000个细胞/cm²的密度重新接种。
12. 每周传代一次，每3-4天更换一次培养基。第三次传代后，按照步骤6所述进行流式细胞术分析MSCs培养物。实验应使用第3至第5代细胞。
    注意：如需将细胞冷冻保存以备将来实验使用，可将细胞离心至所需体积，用冻存液重悬，每支冻存管中加入1 mL冻存液并含有1 × 10⁶个细胞，先于-80 °C过夜保存，随后转移至液氮中长期储存。
    冻存液配方：70% DMEM、20% FBS、10% DMSO。

2. 培养间充质干细胞条件培养基的制备

1. 以每平方厘米5000个细胞的密度接种细胞² 在6孔板中培养MSCs，直至细胞融合度达到80%。
2. 从细胞培养板中收集条件培养基，并在230 x g 室温下放置5分钟，过滤后用于处理。

3. 培养的间充质干细胞制备经IFNγ预处理的条件培养基

1. 以 5000 个细胞/cm² 的密度将细胞接种于 6 孔板中。用 25 ng/mL IFNγ 处理细胞 48 小时。进行剂量依赖性研究，以确定 IFNγ 对 MSCs 的最佳作用效果。在本实验中，选择一系列 IFNγ 浓度（5、10、25、50、100 ng/mL）对 MSCs 进行预刺激。其中 5 和 10 ng/mL 浓度在巨噬细胞极化中效果显著较差，而 25 ng/mL 被确定为最佳浓度（补充图 1）。
2. 倾去含 IFN-γ 的培养基后，用 PBS 洗涤孔板 2 次，以确保完全去除 IFN-γ。任何残留的 IFN-γ 都可能干扰实验结果。
3. 在 37 °C 下，将细胞继续在正常 DMEM 培养基中孵育 24 小时。24 小时后，按照步骤 2 收集条件培养基。

4. 腹腔来源巨噬细胞的分离与培养

1. 向小鼠腹腔内注入5 mL预冷的PBS（含3% FBS），随后轻轻按摩腹部。
2. 使用无菌注射器回收 PBS 溶液，收集至 10 mL 离心管中。将溶液在 300 x g 5 分钟。
3. 移去上清液。将沉淀物重悬于完全RPMI培养基（RPMI，10% FBS，1×青霉素和链霉素）中。以每平方厘米5000个细胞的密度接种细胞。².
4. 24小时后去除非贴壁细胞，继续培养至融合。根据需要将细胞用于后续实验操作。

5. 酶联免疫吸附测定

1. 为检测经BMSCs-CM处理的巨噬细胞产生的IL-10，请按以下步骤操作。
   1. 用BMSCs-CM处理巨噬细胞24小时，次日收集上清液。
   2. 按照试剂盒说明书，使用IL-10 ELISA试剂盒测定IL-10的含量。
2. 为检测BMSCs或IFNγ处理的BMSCs产生的CCL2，请按照试剂盒说明书使用CCL2 ELISA试剂盒进行检测。

6. 间充质干细胞和巨噬细胞表型的流式细胞术分析

1. 将细胞接种于6孔板中，培养至完全汇合。用PBS（1 mL）洗涤1次，随后进行胰蛋白酶消化。加入0.25%胰蛋白酶，于37°C孵育5分钟，使细胞完全从培养板上脱落。
2. 加入培养基以终止胰蛋白酶活性。将细胞收集至10 mL聚苯乙烯管中。对于巨噬细胞，在4 °C条件下以300 × g 离心5分钟；对于骨髓间充质干细胞（BMSCs），在4 °C条件下以230 × g 离心5分钟。
3. 弃去上清液，将细胞重悬于2 mL染色缓冲液（含2% FBS和0.05%叠氮化钠的冰浴PBS）中。在230 × g 条件下离心7分钟。倾去上清并充分吹打重悬细胞沉淀。加入1 mL Ghost Red 780活力染料和50 μL FACS缓冲液，混匀后转移至流式管中。避光孵育30分钟。
4. 孵育30分钟后，用1 mL染色缓冲液洗涤细胞。倾去上清并吹打重悬细胞沉淀。加入适量体积的抗体或同型对照抗体，避光孵育30分钟。再次用染色缓冲液洗涤细胞，弃上清后将细胞重悬于400 μL染色缓冲液中。样品管即可用于上机检测。
5. 制备活死细胞染色对照时，在胰酶消化和离心后，将细胞沉淀溶解于2 mL染色缓冲液中。取1 mL转移至另一微量离心管中，并加入10 μL DMSO以杀死细胞。涡旋混匀后室温孵育10分钟。随后将此溶液与剩余的1 mL活细胞悬液混合于同一流式管中。
6. 加入1 mL染色缓冲液，于230 × g 离心7分钟。弃上清并吹打重悬细胞沉淀。加入1 mL Ghost Red 780活力染料和50 μL FACS缓冲液，混匀后转移至流式管中。避光染色30分钟。染色结束后，用1 mL染色缓冲液洗涤细胞，弃上清并吹打重悬细胞沉淀，最后重悬于400 μL染色缓冲液中。活死染色样品即可用于上机检测。
   注意：对小鼠巨噬细胞染色时，应在标准染色流程前增加一个额外步骤。为避免流式数据偏差，必须进行Fc受体封闭，以防止抗体非特异性结合细胞表面Fc受体。封闭操作方法为：向细胞悬液中加入1 mL Fc封闭试剂（纯化的抗小鼠CD16/CD32抗体），室温孵育15分钟。后续流式抗体染色步骤无需洗去Fc封闭试剂，直接进行。
7. 分析流式数据时，首先应根据前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）参数圈选单细胞群体，此步骤至关重要，用于排除碎片和细胞团聚物。随后根据活死染色结果对单细胞进行门控。基于活细胞群体开展进一步分析（补充图2）。

结果

整体实验流程如图1所示。从小鼠股骨和胫骨中收集骨髓，进行接种、传代培养，并通过流式细胞术进行表征分析（图1A）。收集经或未经IFNγ预刺激的骨髓间充质干细胞条件培养基（BMSCs-CM），并将部分BMSCs-CM分装后储存于-80 °C，以备后续实验使用（图1B）。

使用血细胞计数板对骨髓来源的细胞进行计数（图2A），并以5000个细胞/cm²的密度接种于完全DMEM培养基中。48小时后更换首次培养基，之后每3至4天更换一次培养基，直至细胞完全融合。当细胞融合度达到80%时进行传代（图2B）。在第4代时，根据间充质干细胞（MSC）特异性标志物的表达对细胞进行表征。细胞表达CD44、CD29和CD90，而不表达CD45、CD11b和CD34（图2C）。骨髓间充质干细胞（BMSCs）可分化为脂肪源性、成骨源性和软骨源性谱系^14,27,28,29。此特性符合国际细胞治疗学会的身份鉴定指南。

为了理解间充质干细胞条件培养基（MSCs-CM）的免疫抑制作用，我们分离了腹腔来源的巨噬细胞（PMφ），并用骨髓间充质干细胞条件培养基（BMSCs-CM）进行处理（图3A）。随后对经BMSCs-CM处理的巨噬细胞进行流式细胞术分析（图3B、C）。将腹腔驻留的、适应体外培养的巨噬细胞用M1和M2特异性表面标志物进行染色。在加入染色抗体前，通过使用纯化的抗小鼠CD32/CD16抗体（即小鼠Fc阻断剂）孵育巨噬细胞，以避免非特异性抗体结合。检测了M1特异性标志物CD86和iNOS，以及M2特异性标志物CD206和CD163的表达水平。细胞首先根据造血细胞标志物CD45.2（适用于C57BL/6小鼠）进行设门。IL-10是M2表型的特征性细胞因子。通过ELISA检测MSCs-CM处理的巨噬细胞所释放的IL-10水平（图3D）。由于LPS/IFNγ可诱导M1极化³⁰，因此该处理组作为阴性对照。

CCL2 是在间充质干细胞（MSCs）分泌组中鉴定出的一种标志性细胞因子，可触发巨噬细胞极化¹³。通过 ELISA 检测到 MSCs 释放的 CCL2（图 3E）。为验证 CCL2 在巨噬细胞极化中的作用，我们先用 CCR2 抑制剂预处理巨噬细胞，再给予 MSC-CM 处理（图 3F），并通过 IL-10 ELISA 检测再次评估巨噬细胞极化情况（图 3F）。

我们的结果明确表明，间充质干细胞的分泌组可诱导抗炎性巨噬细胞极化，这由经条件培养基处理后肠道来源巨噬细胞中IL-10产生增加所证实（图3）。

图 1：研究流程图。 （A）处死 C57BL/6 小鼠，冲洗出股骨和胫骨中的骨髓，离心后接种培养，每 3 天更换一次培养基，培养一周。MSCs 传代至第 4 代，并通过流式细胞术和成脂分化实验进行鉴定。（B）将第 4 代 MSCs 接种于 6 孔板中，一组加入 25 ng/mL 的 IFNγ 进行处理，另一组不作处理。48 小时后更换为正常的新鲜完全 DMEM 培养基。24 小时后收集培养板中的培养基，离心并过滤，将条件培养基储存于 -80 °C 以备后续使用。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：表型鉴定。（A）接种前使用血细胞计数板对骨髓来源的细胞进行计数。（B）每次传代前，细胞培养至融合度达80%。（C）通过流式细胞术分析第4代细胞，并使用小鼠间充质干细胞特异性标记物进行表型鉴定。比例尺代表100 mM。图 2C 修改自¹⁴。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：BM-MSC分泌组分析。（A）实验示意图。（B）经MSC-CM处理的PMφ流式细胞术分析代表性图谱。腹腔来源的细胞根据造血标志物CD45.2阳性群体设门。所选群体进一步通过M1特异性标志物CD86或iNOS、M2特异性标志物CD206或CD163进行染色，并在每种情况下联合CD11b双染色。（C）定量分析M1或M2细胞群体的百分比。以LPS/IFNγ处理的细胞群体作为阴性对照。（D）通过ELISA定量检测经MSC-CM处理的PMφ释放的IL-10。（E）通过ELISA定量检测MSC-CM释放的CCL2，（F）PMφ释放的IL-10。如图所示，一组实验在存在CCR2拮抗剂的情况下进行。误差线表示均值±标准误（SEM）。数据代表3次独立实验，每组包含3个MSC样本。所有实验均采用Student t检验进行统计分析。∗p < 0.05，∗∗p < 0.01，∗∗∗p < 0.001，∗∗∗∗p < 0.0001。图3B-F经修改自¹³。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：BMSCs经0、5、10、25、50、100 ng/mL IFNγ预处理。巨噬细胞接受经IFNγ预处理的MSCs条件培养基（MSCs-CM）处理。采用ELISA检测经MSC-CM处理的PMφ释放的IL-10水平。误差线表示均值±标准误（SEM）。数据代表3次独立实验，每组包含3个MSC样本。请点击此处下载该文件。

补充图 2：（A-C）根据前向散射和侧向散射参数选取单细胞。（D）根据死活染色对单细胞进行设门。 请点击此处下载该文件。

讨论

从小鼠骨髓中分离间充质基质细胞是研究间充质基质细胞（MSCs）内在免疫抑制和再生特性的一项关键技术 体内 动物模型。尽管该方法看似简单易行，但多个步骤必须精确操作，以防止细菌污染并确保最佳的细胞产量。整个实验步骤应在超洁净环境中无菌操作。

为避免细胞产量过低，应选择6至8周龄的小鼠。在剪除股骨和胫骨两端时，应尽可能保护骨髓腔，冲洗过程应坚定而轻柔，以确保完全取出骨髓。分离的细胞应在适当的CO₂浓度及湿润条件下孵育。更换培养基时，必须在更换前用磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤细胞，以清除污染的造血细胞。为避免造血细胞污染，传代时胰酶消化时间不应超过5分钟。早期传代时，培养基更换不宜过快，因为频繁更换培养基可能引起细菌污染。

每次传代时，必须将细胞分装保存于多个批次中，以保持细胞的一致性和可及性。对于干扰素-γ（IFN-γ）预刺激，应进行剂量依赖性实验，以确定MSC条件培养基的最佳预处理条件。在我们的实验中，测试了不同浓度的IFN-γ（即5、10、25、50、100 ng/mL）对MSC进行预处理，最终确定25 ng/mL为最适浓度。

为保持数据完整性，所有实验检测应始终使用特定传代次数的细胞。进行间充质干细胞（MSCs）的流式细胞术表征时，应使用第3代或更高代次的细胞，以确保表面受体表达的可靠检测。流式细胞术染色过程中进行活/死细胞区分至关重要，因为这可降低出现假阴性结果的可能性。

研究结果揭示了外源性递送的骨髓间充质干细胞（BMSCs）在结肠炎期间减轻肠道炎症的关键机制。干扰素-γ（IFN-γ）预处理可增强间充质干细胞条件培养基对巨噬细胞极化的影响。BMSCs释放的CCL2是一种关键趋化因子，可作用于巨噬细胞以诱导其向M2型极化。我们先前的研究发现，CCL2与CXCL12趋化因子可协同作用于巨噬细胞，促进其极化。这一过程对于通过后续调节T细胞和B细胞表型来传递抗炎信号至关重要¹³。

在本研究中，我们特别采用了一种基于间充质干细胞（MSCs）贴壁特性的简单方案来分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）。也可利用流式细胞分选或免疫磁珠分选技术，根据MSC特异性表面标志物来分离BMSCs。然而，这两种方法在样本制备过程中均可能导致大量细胞丢失。由于小鼠骨髓中MSC的数量极低（约占骨髓细胞总数的0.001%至0.08%），我们更倾向于使用基于标准贴壁特性进行分离的方法。然而，该方法也存在一些缺点。其中主要风险是可能受到造血细胞的污染，从而降低MSCs的治疗潜能。因此，确定一个关键的传代次数至关重要，在该代次中需有大量细胞稳定表达MSC特异性表面受体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
配备紫外灯的垂直层流细胞培养罩
无菌手术剪
25/75 cm2 培养瓶
5/10 mL 注射器（带 27G 针头）
6 孔培养板
Accutase	Corning	#AT104
抗小鼠 F4/80 APC	Biolegend	#123116
抗小鼠 CD11b PE	BD PharMingen	#557397
抗小鼠 CD45.2 APC	BD PharMingen	#558702
抗小鼠 CD163 Percp eFluor710	eBioscience	#46-1631-80
抗小鼠 CD206 PE	Biolegend	#141706
抗小鼠 CD86 FITC	BD PharMingen	#553691
抗小鼠 iNOS PE-Cy7	eBioscience	#25-5920-80
CCL2 ELISA 试剂盒	Invitrogen	#554722
CCR2 拮抗剂（RS 102895）	Sigma	#R1903
离心机
DPBS	Corning	#21-031-CV
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Corning	# 10-013-CV
胎牛血清	Sigma	#F8067
滤网（70 mm）
Ghost Red 780 活性染料	Tonbo Bioscience	#13-0865-T100
IL-10 ELISA 试剂盒	Invitrogen	#88-7105-88
L-谷氨酰胺	Corning	#25-005-CI
带相差设备的显微镜
小鼠 IFNγ	R&D Systems	#485-MI-100
青霉素-链霉素	Corning	#30-002-CI
大鼠抗小鼠 CD16/CD32	BD PharMingen	#553142
RPMI 培养基	Corning	#10-040-CV
无菌手术镊（直头和弯头）
温度和气体浓度可控培养箱
胰蛋白酶	Corning	#25052-cl
带温度控制的水浴锅