405 nm 蓝光 LED 设备在基于胶原蛋白的合成皮肤模型上评估时，对多种伤口病原体表现出抗菌效果。这一简化方法 体外 该方法为光基抗菌疗法的早期评估提供了可重复且符合伦理的替代方案。
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摘要
摘要
传统的伤口管理正日益面临抗菌素耐药性上升以及传统药物细胞毒性副作用的挑战。光疗，特别是蓝光（BL）疗法，提供了一种有前景的非侵入性、非接触式替代方案。本研究采用基于胶原蛋白的合成皮肤模型，评估了一种405 nm BL-LED设备对多种重要临床伤口病原体的抗菌效果与安全性，并强调了将该平台应用于光基抗菌测试的新颖性。这种合成皮肤提供了更接近真实的环境，能够模拟人类皮肤的结构与表面形貌。光照均匀性测绘显示，在10 cm直径范围内辐照度保持一致（30.14 ± 0.78 mW/cm2）。该设备在27 J/cm2剂量下实现了高达3.5个对数级的显著剂量依赖性微生物减少，其效果明显优于类似研究中报道的结果。其广谱抗菌活性已得到证实，可有效对抗ESKAPE病原体和Candida albicans，这对于管理多微生物引起的伤口感染具有重要意义。一项关键发现是不同物种间的敏感性差异：Klebsiella pneumoniae表现出最高的敏感性，而Staphylococcus aureus则最具抗性。这可能与微生物包膜结构及光敏分子含量的差异有关，这些因素影响了活性氧（ROS）的生成。光学透射实验以及表面与嵌入菌落的分析均未显示统计学显著差异，表明蓝光具有抑制皮肤深层病原体的潜在应用价值。红外光谱分析证实，即使在高剂量（108 J/cm2）照射下，蓝光也不会引起胶原基质可检测到的化学或构象降解，而相比之下，杀菌用紫外C波段（UV-C）对照则显示出明显的破坏作用。最后，在气溶胶室中进行的独特评估表明，蓝光处理可使表面微生物沉积减少超过95%，凸显其在减轻医院内感染方面的潜力。这些结果表明，模拟皮肤的基质可作为临床前测试中评估蓝光效果的一种可行替代方案，从而避免使用动物模型。
引言
伤口感染对全球医疗系统构成长期挑战并带来巨大负担，同时影响患者的生活质量。伤口愈合过程常因微生物感染而复杂化，导致皮肤伤口闭合延迟，在老年人群和糖尿病患者中尤为明显，易形成病灶和慢性伤口。传统的伤口管理策略依赖抗生素、消毒剂、化学物质以及天然生物活性成分，主要作用是抑制致病微生物。尽管这些传统方法可通过减少炎性细胞、增加成纤维细胞数量来有效加速愈合过程1，但仍伴随诸多副作用。许多用于伤口敷料的局部抗菌剂通常对皮肤不友好，可能引起皮肤脱水、组织刺激以及对伤口愈合所需细胞产生细胞毒性等不良反应2。由于抗菌剂（尤其是全身性抗生素）的过度使用，抗菌耐药性（AMR）现象已被广泛报道3，严重威胁现有药物治疗的长期有效性。鉴于当前临床实践中存在的这些局限性，人们愈发强调需要更安全、可持续的伤口护理替代方案，特别是非接触式且无痛的方法，如光疗。
光疗利用可见光谱，在多种皮肤科及治疗应用中逐渐受到关注，成为一种有前景的非侵入性、非药物干预手段。其应用范围从一般的皮肤再生4和美容改善，扩展到针对痤疮和抗衰老治疗等特定疾病的靶向治疗。在可见光波长范围（400–760 nm）内，蓝光（通常为400 nm至480 nm）因其多方面的治疗潜力而受到广泛的科学与临床关注5。与紫外线（UV）辐射（尤其是具有杀菌特性、常用于表面消毒的UV-C波段（100–280 nm））相比，蓝光属于非电离辐射。UV-C已被证实存在DNA损伤、致癌作用及皮肤癌等明确风险，而蓝光则因其不具备直接破坏细胞DNA或诱发致突变效应的能量，从根本上被认为对人体组织更为安全5。
蓝光对革兰氏阳性菌的抗菌活性已有报道6 革兰氏阴性7 细菌。一些临床试验已开展，以验证蓝光疗法在常见感染或疾病中的应用效果8，例如，抑制作用 痤疮丙酸杆菌 导致寻常痤疮9, 以及胃部感染的治疗方法10 由……引起 幽门螺杆菌然而，目前尚未见报道针对伤口感染抗菌效果的临床试验。近年来，越来越多的 体外 研究表明，紫光-蓝光（400–420 nm）能够灭活多种 ESKAPE 病原体，同时对哺乳动物细胞的细胞毒性极低11最近研究表明，410–430 nm 范围内的蓝光可调节成纤维细胞活性和胶原蛋白沉积，促进细胞增殖，调控炎症反应，并产生活性氧（ROS）。 通过 内源性卟啉激发破坏细菌细胞12，使其成为伤口愈合应用的有前景候选材料。
然而，伤口愈合过程具有高度复杂性，其受多种变量影响，包括个体差异、伤口类型以及生理和已有的病理状况，这为相关研究带来了重大挑战。由于生物变异性、伦理考量以及伤口环境的复杂性，对伤口疗法进行直接的体内测试仍然十分困难。尽管动物模型被广泛使用，但其往往无法准确反映人类皮肤的生理特性，且受到严格监管要求的限制13。涉及临床试验的伤口愈合研究较为罕见，且通常代表性不足，原因在于样本量较小，而此类研究需要大样本统计、严谨的对照设计以及严格的伦理审批。为克服这些障碍，能够模拟人类皮肤特性的体外模型已逐渐成为初步筛选的有效平台14。基于胶原蛋白的人工皮肤系统（如VITRO-Skin）在pH值、保湿能力及表面纹理方面模拟了人类皮肤，非常适合在受控条件下测试外部干预措施15。尽管已有若干研究证实蓝光具有广谱抗菌作用，但大多数研究采用的是液体培养基、琼脂平板或动物模型，应用于类皮肤基质的研究仍较有限。
在已证实的蓝光潜力及其优势基础上 体外 模型，本研究旨在验证一种峰值波长为405 nm的发光二极管（LED）设备对常见伤口病原体的抑制效果。我们提出了一种基于胶原蛋白合成皮肤上构建的简化微生物组模型，用于评估伤口愈合效果的新型评价方法。该方法还比较了发光二极管蓝光（LED-BL）与杀菌性紫外C波段（UV-C）辐照在抗菌效能及对皮肤表面形貌影响方面的差异。尽管该方法缺乏生物系统的复杂性，但其采用了一种务实的策略，可实现高度可控且可重复的实验，从而规避了与活体系统相关的变异性及伦理复杂性 体内 研究和临床试验，从而加速对类似新型治疗干预措施的初步评估和初期筛选。本研究的核心创新在于应用基于胶原蛋白的皮肤模型作为可重复、可控制的平台，用于评估蓝光抗菌效果，并结合光学穿透性、均匀性以及基于傅里叶变换红外光谱（FTIR）的安全性分析。
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方案
1. 合成皮肤样品的制备
在生物安全柜内，无菌条件下将基于胶原蛋白的合成皮肤模型（VITRO-Skin）片材切割成尺寸为 5.0 cm × 2.5 cm 的矩形样本。每个样本置于无菌培养皿中，并在 4 °C 下保存备用。接种前，将样品平衡至室温，并根据制造商说明在湿度培养箱中进行水合处理，以模拟人体皮肤的水合水平。
2. 微生物培养物的制备
使用美国典型培养物保藏中心（ATCC）的标准菌株，包括Staphylococcus aureus（ATCC 25923）、Escherichia coli（ATCC 25922）、Enterobacter aerogenes（ATCC 13048）、Pseudomonas aeruginosa（ATCC 27853）、Acinetobacter baumannii（ATCC 19606）、Klebsiella pneumoniae（ATCC 13883）和Candida albicans（ATCC 10231）。在无菌条件下，将单菌落接种至5 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中。细菌培养物于35 °C培养24小时，真菌培养物于22 °C培养5天。培养结束后，使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将菌液浊度调整至0.5麦氏比浊标准（约1.5 × 10⁸ CFU/mL），用于抗菌实验。
3. 合成皮肤模型的接种
每个水合的合成皮肤样本均接种100 µL微生物悬液，并使用无菌一次性涂布棒均匀涂布。接种后的表面在无菌室中、常温实验室条件（22–24 °C，60%–70% 相对湿度）下晾干15分钟。样本被分为三组：未处理对照组（A组）、光源照射组（蓝光LED，405 nm，B组）和UV-C LED照射组（265 nm，C组）。图1展示了利用合成皮肤模型评估光源抗菌效果的实验示意图。
4. 光源配置与照射
将405 nm蓝光LED装置安装在铝制散热片上，以防止热量积聚，并确保对合成皮肤样品进行热安全的照射（图2）。使用经校准的光学功率计在精确的处理平面上测量辐照度，并调整探头高度以补偿传感器厚度。通过调节LED的投射距离，将工作辐照度标准化为30 mW/cm²。
通过测量治疗区域内16个均匀分布点的辐照度，验证了照射的均匀性，测得平均值为30.14 ± 0.78 mW/cm²（图3）。为进行杀菌效果的基线比较，采用波长为265 nm的LED光源进行UV-C处理，在20 cm距离处辐照强度为3 mW/cm²，照射时间为2分钟。
辐射能量密度计算公式为辐照度 × 照射时间，其中蓝光为 27 J/cm²（30 mW/cm² × 900 s），UV-C 为 3.6 J/cm²。
在抗菌实验中，将接种了微生物悬液的水合合成皮肤样本无菌地放置于无盖的无菌培养皿中，并直接置于蓝光LED下方。分配至照射组（B组）的样本持续暴露于光照下，直至达到目标辐射剂量（15分钟）。选择15分钟的照射时间（27 J/cm²）是基于初步的杀菌时间实验，该实验表明该时长在不同菌种间均表现出稳定的抗菌效果，同时适用于潜在的临床或即时护理应用。每5分钟使用非接触式红外测温仪监测各样本的温度，以确认光照过程中未发生显著升温。温度监测结果显示，在蓝光照射期间，样本表面温度无明显升高（>2 °C），证实所观察到的抗菌效应为非热效应。
5. 蓝光LED与UV-C对伤口病原体的抗菌效果
处理后，将每块合成皮肤样品转移至含有 9.0 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）的无菌 15 mL 离心管中。将离心管轻轻涡旋振荡 1 分钟，以脱离表面附着的微生物。制备连续十倍稀释液后，取 100 µL 等分试样分别接种于胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板用于细菌计数，以及沙氏葡萄糖琼脂（SDA）平板用于真菌计数。平板进行培养（细菌在 35 °C 培养 24 小时；真菌在 22 °C 培养 5 天），并计数菌落形成单位（CFUs）。采用以下公式定量计算微生物减少量：
对数降低值 = log10(A) - log10(B)
减少百分比 = ((A - B)/A) × 100
其中 A = 对照组的菌落形成单位（CFU）计数；B = 处理组样本的菌落形成单位（CFU）计数。
阴性对照包括仅含培养基的平板和磷酸盐缓冲液（PBS），用于验证无菌性，而未经处理的接种样本则用于比较处理效果。阳性对照平板含有接种的ATCC微生物悬液，以确认培养物的活性。所有实验步骤均在无菌条件下进行。
6. 蓝光照射的时变抗菌效果
为评估光剂量依赖性效应，蓝光照射时间设定为 2 分钟、5 分钟、10 分钟、15 分钟、20 分钟和 30 分钟。通过菌落形成单位（CFU）计数法评估抗菌活性，方法同上，从而可分析剂量依赖性关系。
7. 模拟医院内环境的气溶胶室中蓝光LED的杀菌效果
在受控的环境条件下，使用定制的丙烯酸气溶胶室模拟医疗机构中的空气传播暴露（图4）。通过雾化器引入气溶胶化的微生物悬液（约1.5 × 106 CFU/mL），并将合成皮肤样本暴露30分钟。在整个暴露过程中，蓝光持续照射样本（10 µW/cm²，距离20 cm）。在对照实验中，施加相同的暴露条件，但蓝光LED装置保持关闭状态。通过沉降菌活性测定法监测气溶胶室内的微生物细胞浓度，即将琼脂平板在暴露前置于室内。附着于合成皮肤样本（2 cm × 2 cm）上的可存活微生物细胞数量采用上述标准平板计数法进行定量分析。选择该低辐照度（10 µW/cm²）是为了模拟医疗环境中的真实环境光照条件，因为在这些场所无法实现持续高强度的光照。
8. 光学透射与嵌入菌落检测
- 通过合成皮肤基质的光学透射
为量化蓝光在合成皮肤中的穿透能力，使用经校准的光学功率计置于照射平面处测量辐照度。记录在LED与探测器之间水平放置水合状态的合成皮肤样品前后，蓝光强度（405 nm，30 mW/cm²）的变化。透射率（%）定义为有皮肤样品时的透射辐照度与无皮肤样品时的入射辐照度之比。
在水相条件下的透射性能通过紫外-可见分光光度计进行评估。将一条水合的合成皮肤条垂直插入装有去离子水的标准聚苯乙烯比色皿中，仅装有水的比色皿作为空白对照。记录405 nm处的吸光度，并利用公式 %T = 10(-A) × 100 计算透射百分比。 - 通过嵌入菌落实验进行功能验证
表面菌落与嵌入菌落的微生物减量实验作为透射性能的功能性验证方法，其中样品在一侧表面接种微生物，但从相对的另一侧（底部）进行照射，以模拟微生物位于皮肤表面下方的情况。菌落形成单位（CFU）的定量分析方法同前述抗菌效能部分所述。
9. 蓝光和紫外-C照射后合成皮肤降解的傅里叶变换红外光谱分析
为了评估光照对基于胶原蛋白的人工皮肤基质可能引起的化学和结构变化，进行了傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析。人工皮肤样品（2 cm × 2 cm）按照制造商说明进行水化处理，其处理方式与用于微生物减量实验的样品相同。水化后的样品分别暴露于405 nm蓝光（30 mW/cm²）或265 nm紫外C波段（UV-C，3 mW/cm²）照射下，照射时间为15分钟（标准暴露，27 J/cm²）或60分钟（最差应力条件）。照射后，样品经轻压吸干以去除表面水分，并立即进行FT-IR分析。
10. ATR-FTIR 测量
使用配备兼容分析软件的红外分光光度计采集光谱。所有样品均采用衰减全反射（ATR）iD7模块进行分析。为分离出由辐照引起的光谱变化，（1）在未处理的对照样品与辐照样品之间进行直接光谱比较；（2）以未处理的对照样片作为背景参考，在扫描辐照样品前进行基线扣除比较，从而仅显示新出现或发生变化的峰。
这种双重方法可降低形貌噪声，并提高对酰胺区和指纹区细微变化的检测能力。所有样品的水合水平、样品厚度和取向均保持一致，以减少光谱变异性。每种暴露条件（对照、蓝光照射15分钟、蓝光照射60分钟、紫外光照射15分钟、紫外光照射60分钟）均进行三次重复扫描。
11. 统计分析
除非另有说明，所有实验均使用独立的生物学重复三次进行。数据以均值 ± 标准差（SD）表示，或如图注中所示以均值及95%置信区间（CI）表示。数据分布的正态性通过Shapiro-Wilk检验进行评估。两组之间的成对比较（例如，蓝光 vs. UV-C、表面菌落 vs. 包埋菌落）采用非配对双尾Student t-检验。对于涉及两个以上条件或时间点的比较，则采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行适当的事后检验。每次比较所使用的具体统计检验方法均在相应的图注中注明。当p值<0.05时，认为差异具有统计学显著性。
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结果
蓝光LED与UV-C对伤口病原体的抗菌效果
蓝光LED设备（405 nm）在30 mW/cm²强度下照射15分钟，对合成皮肤模型上的所有测试伤口病原体均表现出显著的抗菌效果（图5）。在所测试的菌种中，Klebsiella pneumoniae对蓝光最敏感，活菌数平均减少3.4个对数级。相反，Staphylococcus aureus的反应最弱，尽管其微生物减少量相对较低，但仍具有显著性（>1 log10 CFU减少量）。相比之下，UV-C辐照（265 nm，3 mW/cm²，照射时间2分钟）作为阳性对照，在所有测试微生物中均产生了更高的对数减少量，与其已知的杀菌效力一致。
通过具有重要医学意义的代表性物种，进一步说明了蓝光和UV-C辐照的抗菌谱：Escherichia coli（一种常作为指示菌的革兰氏阴性细菌），Pseudomonas aeruginosa（一种以对多种抗生素产生耐...
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讨论
本研究展示了405 nm蓝光LED（BL-LED）装置在基于胶原蛋白的人工皮肤模型上，对一组临床相关伤口病原体具有显著的抗菌潜力。在27 J/cm²的辐照剂量下，BL-LED照射可使微生物载量最高减少3.5个对数级（图6），其抗菌效果优于多项先前研究报道的结果6,7,17,18,19，这些研究在相似辐照剂量下使用蓝光（405–470 nm）进行病原体灭活。Dai等人的一项综述8指出，许多研究仅报告了有限的抗菌效果，尤其是在未使用光敏剂的情况下。相比之下，本研究结果表明，在更接近真实伤口环境的模拟人工模型上，以中等辐照剂量靶向递送蓝光，可实现显著的微生物抑制。本研究证实的广谱抗菌效果——包括对ESKAPE病原体...
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致谢
本研究由（W24-21）资助 "应用研究、创新与创业服务" （ARIES），加拿大百年理工学院。微生物材料和BSL-2设施由 "加拿大百年理工学院应用生物与环境科学系（Applied Biological and Environmental Sciences, ABES）。作者感谢Andrew Baer和Gillian Goring在傅里叶变换红外光谱（FT-IR）技术方面提供的指导，以及准备室工作人员在培养基配制与灭菌过程中给予的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 鲍曼不动杆菌 | ATCC 全球生物资源中心 | ATCC 19606 | |
| 蓝光 - 发光二极管 | Violumas | N/A | BL-LED 是一种原型，因此没有目录编号 |
| 白色念珠菌 | ATCC 全球生物资源中心 | ATCC 10231 | |
| 产气肠杆菌 | ATCC 全球生物资源中心 | ATCC 13048 | |
| 大肠杆菌 | ATCC 全球生物资源中心 | ATCC 25922 | |
| 傅里叶变换红外光谱 （傅里叶变换红外光谱，FT-IR）分光光度计 Nicolet iS5 | 赛默飞世尔科技 | IQLAADGAAGFAHDMAZA | OMNIC 软件用于分析 |
| FT-IR Nicolet iS5 iD1 直接光束透射模块（基座适配器） | 赛默飞世尔科技 | IQLAADGAAGFAJAMAYX | |
| FT-IR Nicolet iS5 iD7 金刚石衰减全反射模块 | 赛默飞世尔科技 | IQLAADGAAGFAJAMBFN | |
| 培养箱 | Percival Scientific | 9330.01.06L | |
| 红外温度计 | 赛默飞世尔科技 | 06-664-254 | |
| 肺炎克雷伯菌 | ATCC 全球生物资源中心 | ATCC 13883 | |
| 磷酸盐缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | AM9624 | PBS 目录号（Thermo Fisher Scientific） |
| 铜绿假单胞菌 | ATCC 全球生物资源中心 | ATCC 27853 | |
| 沙保弱葡萄糖琼脂 | BD Difco | DF0109-17-1 | SAB 目录号（BD Difco） |
| 金黄色葡萄球菌 | ATCC 全球生物资源中心 | ATCC 25923 | |
| 胰蛋白胨大豆琼脂 | BD Difco | DF0369-17-6 | TSA 目录号（BD Difco） |
| 胰蛋白胨大豆肉汤 | BD Difco | DF0370-17-3 | TSB 目录号（BD Difco） |
| 紫外发光二极管 | Violumas | N/A | UV-LED 为原型产品，因此无目录编号 |
| 紫外-可见分光光度计（Genesys 10 UV Scanning） | 赛默飞世尔科技 | 335907P | |
| Vitro-Skin | MEDELINK | SKU24000 | Vitro-Skin |
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