一种用于从冷冻保存的马精液中分离体细胞作为克隆核供体的简易微吸管技术

摘要

本方案介绍了一种简单的微吸法技术，用于从冷冻保存的马精液中分离具有活力的体细胞（SCs）。与传统方法不同，该技术避免了长时间 体外 培养并克服精子污染，可立即用于体细胞克隆。

摘要

精液是一种复杂的液体，除精子外，还含有其他细胞群体，包括免疫细胞、未成熟的雄性生殖细胞、上皮细胞和成纤维细胞。这些细胞均具有二倍体特性，因此可作为体细胞核移植（SCNT）克隆中理想的细胞核供体。已有研究证实，利用这些细胞能够成功获得可存活的胚胎及后代。从精液中有效分离这些细胞的方法包括离心法和渗透梯度技术；然而，长时间 体外 培养这些分离细胞以建立原代培养物需要一定的培养周期。此外，所获取的样本中含有大量精子，这会干扰原代培养物的建立与维持 体外 培养物。迄今为止，仅能从新鲜精液样本成功建立原代培养，而使用冷冻保存精液的尝试始终未能成功。这一限制严重制约了从冷冻保存精液样本生成克隆个体的潜力。本研究提出一种基于简易显微抽吸的技术，用于从冷冻保存的马精液中分离体细胞。该方法可快速获取足够数量的细胞，直接用于体细胞核移植（SCNT）克隆操作。

引言

体细胞核移植克隆技术是拯救和扩繁具有动物育种及科研价值个体的重要工具。已有多种细胞系被用作核供体，包括皮肤、肌肉、颗粒细胞、淋巴细胞以及尿液来源的细胞^1,2,3,4。值得注意的是，精液已成为获取用于克隆核供体的体细胞（SCs）的一种新型替代来源^5,6。这一发现对于仅保存了精液样本的个体的遗传资源抢救尤为重要。然而，从冷冻精液中分离的体细胞建立原代培养体系一直未能成功，至今仍是利用该来源获得克隆动物的主要障碍^7,8,9。这些细胞可能来源于腺体上皮和导管内壁，来自精液分泌物，更重要的是来自精液中混入的尿液，而尿液是已知具有高增殖能力和未分化潜能的体细胞的重要来源³。

已采用多种方法从精液中分离精原细胞（SCs），包括离心法⁵，渗透梯度^7,8,10，以及流式细胞术¹¹然而，体细胞一旦通过这些方法分离出来，仍需要优化的条件以实现贴附、生长和增殖⁸这些细胞的特定需求使得 体外 使培养更为复杂，因为原代细胞培养的建立需要较长的孵育时间⁹此外，样品中高浓度的精子会干扰这些培养物的建立和维持。⁵.

与先前描述的方法相比，这种微吸技术具有若干明显优势。它可根据大小和形态选择精原细胞¹² 并可从活细胞和非活细胞中回收细胞核，该策略已在无冷冻保护剂的冷冻组织中成功实现¹³ 冻干生殖细胞^14,15,16重要的是，精细胞（SCs）可在精液解冻后立即使用，从而降低通常与长期培养相关的倍性错误风险 体外 用于动物克隆的原代体细胞培养^17,18该技术主要针对冷冻保存的马科动物精子，能够收集到足够数量的精子细胞（SCs），并可立即用于体细胞核移植（SCNT）¹².

微移液管的制备以及微吸管技术的发展在近几十年取得了显著进展。这些工具的使用使得对配子、胚胎及其细胞结构的精确操作成为可能，为生殖生物技术领域开辟了新的前景（https://www.jove.com）。显微操作技术能够评估细胞的力学特性，并为其生理状态提供有价值的见解^19,20，然而该领域仍相对未被充分探索。

迄今为止，尚无研究详细报道过利用任何形式的显微操作技术从精液中有效分离精原细胞（SCs）的方法。鉴于传统分离方法的局限性，本研究提出一种基于显微抽吸的实用方案，用于从冷冻保存的马精液中分离精原细胞（SCs），从而可在采集后立即将其应用于体细胞克隆实验。

方案

冷冻保存的精液样本由墨西哥相关兽医主管部门授权的商业供应商提供，已在液氮中保存超过19年，符合墨西哥官方标准NOM-027-ZOO-1995对家畜精液动物卫生处理的规定。所有精液样本，无论是否用于实验或不适合分析，均按照机构生物安全规程及适用法规进行灭活和处置，包括遵循墨西哥NOM-087-ECOL-SSA1-2002标准对生物感染性废物的管理要求。残留的氢氟酸（HF）在通风橱中安全中和：将其缓慢转移至塑料容器，并逐步加入少量CaCO₃₃ 或 Ca(OH)₂ 直至不再产生气泡，形成不溶性CaF₂中和后悬液的pH值经确认在6至8之间，随后根据当地法规作为无机化学废弃物进行处理。所用试剂和设备列于下文 材料表.

1. 体细胞分离用微量移液针的制备

1. 选择硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.0 mm × 内径 0.78 mm × 长度 100 mm）。
2. 使用微量移液器拉制仪制备尖端细小的毛细管。调节切割点以改变尖端直径。
3. 将毛细管插入拉制仪并牢固固定。
4. 拉制完成后小心取出微量移液器，并水平放置于显微操作仪上。
5. 在显微镜视野内对准加热器与微量移液器。
6. 使用目镜测微尺确定切割位置（图 1A、B）。
7. 使微量移液器尖端接触加热丝上的玻璃珠。
8. 逐渐升高温度，直至尖端熔融进入玻璃珠。
   1. 关闭加热器。
   2. 使尖端附着于玻璃珠并自然分离。
      注：无需弯曲微量移液器，可直接使用其直形状态。但若操作者需要，也可形成一定角度（图 1C）。
9. 不要打磨尖端，此步骤在本实验中非必需。
10. 通过依次将每个尖端浸入以下溶液约 10 秒来清洗移液器尖端：
    1. 20% 氢氟酸（HF）。
       ​警告：氢氟酸具有高度毒性和腐蚀性。请使用供应商建议的个人防护装备，特别强调佩戴眼部/面部防护装置、手套和实验服，并始终在通风橱内操作。
    2. 无菌重蒸水。
    3. 无水乙醇。
       注：为便于清洗移液器尖端，建议将上述溶液分别置于 15 mL 无菌康宁管中备用。
11. 将微量移液器置于 50 °C 烤箱中干燥。
12. 将微量移液器储存于无菌容器中。

2. 微吸入装置

1. 检查微吸管系统是否处于正常工作状态，确保微吸管操纵杆位于控制面板中央。
2. 对于使用油的系统，需确认系统内部无气泡，因为气泡可能影响移动精度。
3. 将体细胞吸取用微吸管插入操作者惯用手一侧的持针器中。
   注意：在体细胞采集过程中，若微吸管尖端发生堵塞，应更换为新的微吸管。

3. 冷冻保存的马精液的解冻与稀释

1. 从液氮中取出麦管，暴露于空气中10秒，然后在37 °C下解冻30秒。
2. 第一次精液稀释：取解冻后精液样品（250 µL），加入含10%胎牛血清、0.1 mg/mL牛血清白蛋白、12.5 µM β-巯基乙醇和1%抗生素-抗真菌剂的DMEM/F12培养基1.0 mL进行稀释。
   1. 将混合物在37 °C孵育30分钟。
3. 第二次精液稀释：取第一次稀释液25 µL，加入含0.1 mg/mL聚乙烯醇（PVA）或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的1x DPBS溶液975 µL中，转移至1.5 mL微量离心管中，轻轻混匀。
   1. 在整个细胞收集过程中，将此混合液保持在37 °C。

4. 准备用于收集 SC 的培养皿

1. 使用两个直径为35 mm培养皿的皿盖收集精原细胞（SCs）。
2. 按以下步骤准备第一个皿盖（皿盖#1，图2A）。
   1. 取100 µL第二次精液稀释液，滴加于皿盖中央（见图2A）。
   2. 在第一滴液滴上方再制备一个微滴（10 µL），该微滴为添加了0.1 mg/mL PVA或PVP的1x DPBS（见图2A）。
   3. 用石蜡油完全覆盖这两个微滴，以防止蒸发，并在吸取精原细胞过程中维持温度稳定。
3. 准备第二个皿盖用于去除细胞碎片及伴随的精子细胞（皿盖#2，图2B）。
   1. 在皿盖中央放置三滴30–50 µL的1x DPBS，每滴均添加0.1 mg/mL PVA或PVP；不要用矿物油覆盖。
      ​注意：仅在所有体细胞均已筛选完毕后才准备此培养皿，以避免DPBS溶液因暴露于空气中而发生理化性质改变。
4. 所有显微注射操作均应在室温下倒置显微镜下进行。避免温度骤变。

5. 从冷冻保存的马精液中分离精原干细胞的微吸管操作步骤

1. 将第一个皿盖（皿盖 #1，图 2A）放置在显微镜载物台上，准备收集体细胞（SCs）。
2. 选择合适直径的显微操作毛细管用于收集体细胞，并将其连接至机械抽吸系统。
3. 小心地将毛细管插入微滴中，并使其与培养皿盖底部对齐。一旦毛细管吸入培养基，即可开始逐个捕获体细胞。
4. 在培养皿底部，应可观察到多种细胞形态（图 3）。
5. 将毛细管尖端置于每个体细胞旁，在负压下进行抽吸。无论细胞大小，均需吸取消除所有圆形和伸长形细胞。每次捕获体细胞时的抽吸体积可能有所不同。
6. 捕获10个细胞后，将其转移至上方的微滴（10µL）中（图 2A）。重复此步骤，直至获得克隆实验所需数量的体细胞。
7. 在整个收集过程中，将所有捕获的体细胞保留在该微滴中。
8. 当获得克隆所需的体细胞数量后，使用微滴进行简单的洗涤操作，以去除伴随的精子、细胞碎片及微生物污染物。
9. 取第二个培养皿盖，对体细胞进行三步连续洗涤（皿盖 #2，图 2B）：
   1. 用显微毛细管捕获体细胞，并小心地将其转移至第一滴液表面。静置3–5分钟（图 2B；滴液 #1）。
   2. 重复步骤5.9.1，将细胞转移至第二滴液中（图 2B；滴液 #2）。
   3. 重复步骤5.9.1，将体细胞转移至第三滴液中（图 2B；滴液 #3）。
10. 最后一步，将分离后的体细胞转移至一个最终的微滴中，用于后续体细胞核移植操作（图 4D）。
    注意：每次重新捕获体细胞时，应尽可能以最小体积的培养基进行抽吸，以最大限度减少精子、碎片及微生物污染物的残留。

结果

表1显示，微吸法可高效回收冷冻保存的马精液中的体细胞，三匹种马的捕获率分别为317.7 ± 9.60 至 424.7 ± 33.65 个细胞/小时。其中，种马#03的回收量最高，表明该方法即使对长期储存的样本也具有良好的效果。数据表明，该技术能够稳定且有效地从精液中分离体细胞，平均捕获率及标准差为效率和重复性提供了定量评估依据，从而支持其在体细胞核移植中的应用。

分离每个体细胞时不需要施加显著的吸力，尽管某些细胞在操作过程中 tends to 黏附于微移液管的尖端。操作过程中观察到的一个显著特征是分离细胞的刚性较强且变形能力较低。

使用钠硼硅酸盐玻璃可制备出耐用且具有足够透明度的微吸管，便于在细胞吸取过程中监测所有操作。在本实验条件下，使用直径为25–30 µm的微吸管即可收集所有已识别的体细胞。有...

讨论

细胞和配子的显微操作技术使得复杂的辅助生殖技术得以简化。这些技术包括手工克隆（Hand Made Cloning）介导的体细胞克隆²¹、辅助孵化²²、卵胞质内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）²³以及受精卵原核显微注射²⁴等。

开发从精液中有效分离体细胞的方法是现代动物繁殖技术中一项极为宝贵的工具。然而，许多生物学特性仍不明确，各种技术因素也继续限制着这些细胞在体细胞克隆等生物技术中的应用。与以往基于离心⁵或渗透梯度^7,8的分离方法不同，这些传统方法依赖长期的in vitro培养，且数周后仅能以有限的效率获得原代细胞系^9<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	SIGMA	M7522	体细胞培养
1× DPBS	GIBCO	REF-21600010	体细胞操作
无水乙醇	HYCEL	EL CRISOL 50181-1L73	用于拉制移液管
抗生素-抗真菌素 100×	INVITRO SA. México		体细胞培养
硼硅酸盐毛细管（外径 1.0 mm × 内径 0.78 mm × 长度 100 mm）	HARVARD APPARATUS, USA	EC1-30-0035	用于拉制移液管
牛血清白蛋白（BSA）	SIGMA	A3311	体细胞培养
DMEM/F12 培养基	GIBCO	REF-12500-062	体细胞培养
马冷冻精液样本			冷冻精液样本购自商业供应商，已在液氮中保存超过19年。所有冷冻马精液样本均来自墨西哥相关兽医主管部门授权的商业供应商，符合墨西哥官方标准 NOM-027-ZOO-1995《家畜精液的动物卫生处理规程》。
目镜测微尺		用于拉制移液管的工具	所需设备
胎牛血清	GIBCO	REF-26140-079	体细胞培养
氢氟酸	SIGMA-ALDRICH	339261	用于拉制移液管
倒置光学显微镜	Eclipse, TE 200	NIKON	体细胞显微操作
实验室 干燥烘箱		用于拉制移液管的工具	所需设备
显微操作仪（Microforge）		用于拉制移液管的工具	所需设备
倒置显微镜用显微操作装置套装		细胞显微操作	所需设备
微量移液管拉制仪	P-97, SUTTER INSTRUMENT	用于拉制移液管的工具	使用以下设置—加热温度：720；拉力：30；速度：50；时间：220；压力
矿物油	SIGMA	M8410	体细胞操作
Nunclon 细胞培养皿，直径 × 高度 35 mm × 10 mm	NUNCLON	Nunc 153066
聚乙烯醇（PVA）	SIGMA	P8136	体细胞培养
聚乙烯吡咯烷酮（PVP）	SIGMA	P5288	体细胞培养
0.4% 台盼蓝溶液	GIBCO	REF- 15250061	细胞染色剂