一种简单的微吸取技术，用于从冷冻保存的马中分离体细胞，作为克隆的核供体

摘要

该方案采用了一种简单的微吸技术，用于从冷冻保存的马中分离出可存活的体细胞（SCs）。与传统方法不同，该技术避免了长时间体 外 培养，克服了精子污染，使得能够立即用于体细胞克隆。

摘要

是一种复杂的液体，除了精子外，还包含其他细胞群体，包括免疫细胞、未成熟的男性生殖细胞、上皮细胞和成纤维细胞。这些细胞具有二倍体特性，因此适合作为体细胞核移植（SCNT）克隆的核供体候选。利用这些细胞已证明可生成可存活胚胎和后代。从中分离的有效方法包括离心和渗透梯度技术;然而，建立这些分离细胞的原级培养是必要的，需要较长时间的 体外 培养。此外，采集的样本中含有大量精子，这会干扰体 外 培养的建立和维持。迄今为止，初级培养仅成功通过新鲜样本建立，而使用冷冻保存的尝试一直失败。这一限制显著限制了从冷冻保存样本中生成克隆的可能性。本研究提出了一种基于微吸的简单方法，用于从冷冻保存的马中分离体细胞。该方法能够快速提取足够数量的细胞，立即用于SCNT克隆程序。

引言

体细胞核转移克隆是拯救和繁殖具有动物技术和科学兴趣个体的宝贵工具。许多细胞系被用作核供体，包括皮肤、肌肉、肉芽豆、淋巴细胞和^尿液细胞1,2,3,4。有趣的是，已成为收集体细胞（SCs）的新替代方案，用于克隆^5,6。这一发现对于仅保存的个体救助尤为重要。然而，从冷冻中分离出的SC建立初级培养尚未成功，至今仍是从^{该来源获得}克隆动物的主要障碍^7,8,9。这些细胞很可能起源于腺体上皮和小管内衬、分泌物，以及——重要的是被尿液污染，后者是高增殖和未分化电位体细胞的著名来源³。

已实施多种方法从中分离SC，包括离心^法5、渗透梯度^7、8、10和流式细胞术¹¹。然而，体细胞一旦通过这些方法分离出来，仍需优化的附着、生长和增殖条件^8。这些细胞的特殊需求使体外培养更加复杂，因为建立原级细胞培养需要较长时间的潜伏^期9。此外，样本中精子的高浓度干扰了这些培养的启动和维持^5.

与之前描述的方法不同，这种微吸技术具有几个明显优势。它允许根据大小和形态选择细胞核¹²，并能从存活和不可存活细胞中回收细胞核，这一策略已在无低温^保护剂的冷冻组织和冻干生殖细胞^14、15、16中成功验证。重要的是，S-C可以立即在解冻后使用，从而降低了通常与用于动物克隆的原级体细胞延长体外培养相关的倍性错误风险^17,18。具体来说，该技术专注于低温保存马，能够收集足够数量的SCs，立即用于SCNT¹²。

近几十年来，微量移液器的制造和微吸技术的发展取得了显著进展。这些工具的使用使得对配子、胚胎及其细胞结构的精确作成为可能，为生殖生物技术领域创造了新可能（https://www.jove.com）。微作技术能够评估细胞的机械特性，并为其生理状况提供宝贵见解^19,20，但该领域仍相对未被充分探索。

迄今为止，尚无研究详细说明使用任何微作变体方法从中分离SCs的有效方法。鉴于传统分离方法的局限性，本研究提出了一种实用的微吸方法，用于从冷冻保存的马精中分离SC，使其在采集后立即用于体细胞克隆。

方案

冷冻保存的样本在液氮中保存超过19年，均由墨西哥相关兽医部门授权的商业分销商获得，符合墨西哥官方标准NOM-027-ZOO-1995，该标准规范家畜的动物卫生流程。所有样本，无论已使用或不适合分析，均依照机构生物安全规范和相关法规进行灭活并处置，其中包括墨西哥生物传染性废物管理的NOM-087-ECOL-SSA1-2002。残留的氢氟酸（HF）在排气罩下通过缓慢转移到塑料容器中，逐渐加入少量CaCO3_或Ca（OH）₂，直到起泡停止，形成不可溶的CaF₂，从而安全地中和。根据当地法规，中和悬浮液的pH值被确认在6至8之间，作为无机化学废物管理。试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 用于体细胞分离的微量移液针制备

1. 部分硼硅玻璃毛细管（1.0毫米内径×0.78毫米内径×100毫米）。
2. 使用微量移液器拉出细尖毛细血管。调整切割点以改变刀尖直径。
3. 将毛细管插入拉拔器并牢牢锁住。
4. 拉出后小心取出微量移液器，水平放置于微锻炉上。
5. 将加热器和微量移液器对齐在显微镜的视野内。
6. 使用目镜准星定位切割点（图1A，B）。
7. 将微量移液器的尖端接触到玻璃珠（在加热器耗材上）。
8. 逐渐加大火力，直到尖端融入珠子中。
   1. 关掉暖气。
   2. 让尖端粘附在珠子上并分离。
      注意：微量移液器无需弯曲;它可以直接使用。然而，如果算符偏好，可以形成一个角度（图1C）。
9. 不要将尖端磨平，因为这一步对手术中是不必要的。
10. 通过依次将每个吸头浸泡在以下环境中，连续浸泡1~10秒来清洁移液器尖端：
    1. 20%氢氟酸（HF）。
       注意：氢氟酸具有高度毒性和腐蚀性。使用供应商指定的个人防护装备。强调佩戴眼睛/面部防护、手套和实验室外套，并且始终使用排气罩工作。
    2. 无菌双蒸馏水。
    3. 绝对是乙醇。
       注意：为便于移液器尖端清洗，请在15毫升无菌康宁管中制备上述溶液。
11. 将微量移液器放入50°C的烘箱中干燥。
12. 微量移液器存放在无菌容器中。

2. 微吸气装置

1. 检查微吸气系统是否正常工作，微吸气纵杆位于控制面板中央。
2. 对于使用油的系统，确保系统内部没有气泡，因为气泡会影响移动精度。
3. 将体细胞吸吸微移液器插入操作员惯用手侧的持枪作器。
   注意：如果在体细胞采集过程中吸头堵塞，请更换新的微量移液器。

3. 冷冻保存马的解冻与稀释

1. 取出吸管，暴露于空气中10秒，然后在37°C解冻30秒。
2. 首次稀释：取解冻样本（250微升），并用1.0毫升DMEM/F12培养基稀释，辅以10%胎儿牛血清、0.1 mg/mL牛血清白蛋白、12.5 μM β巯哰乙醇和1%抗生素-抗真菌剂。
   1. 将混合物在37°C下孵育30分钟。
3. 第二次稀释：取25微升，加入975微升1xDPBS中，补充0.1 mg/mL聚乙烯醇（PVA）或聚乙烯基吡咯里酮（PVP），放入1.5毫升微离心管中，轻轻混合。
   1. 在整个细胞采集过程中，保持该混合物在37°C。

4. 为收集 SC 准备餐具

1. 使用直径35毫米的培养皿中的两个盖子采集 SCs。
2. 准备第一个盖子的步骤如下（盖子#1， 图2A）。
   1. 取100微升第二种稀释液，置于盖子中央（见 图2A）。
   2. 在第一滴上再加一滴微滴（10微升），1x的DPBS补充0.1 mg/mL的PVA或PVP（见 图2A）。
   3. 将两粒微滴剂完全覆盖在石蜡油上，以防止蒸发并保持SC吸入时的温度稳定。
3. 准备第二个盖子以去除细胞残渣及随附的精子（盖子#2， 图2B）。
   1. 在盖子中央滴三滴30-50微升的1xDPBS，补充0.1 mg/mL的PVA或PVP;不要用矿物油覆盖它们。
      注意：在所有体细胞被选定以防止空气暴露导致DPBS溶液物理化性质变化后，准备此培养皿。
4. 在室温下，在倒置显微镜下完成所有微吸作步骤。避免突然的温度变化。

5. 用于从冷冻保存马中分离SC的微吸法

1. 将第一个盖子（盖子#1， 图2A）放在显微镜台上，准备采集SCs。
2. 选择直径合适的微量移液器收集 SC，并将其连接到机械吸气系统。
3. 小心地将微量移液器插入微滴液，并对准碗盖底部。移液器吸取培养基后，开始单独采集单一培养基。
4. 在盘子底部，应能看到各种细胞形态（见图3）。
5. 将微量移液器尖端置于每个单层旁边，并在负压下抽取。无论细胞大小，都要抽取全圆细胞和细长细胞。各捕获 SC 的吸气体积会有所不同。
6. 捕获10个细胞后，将其沉积到顶部的微滴液（10微升）（见图2A）。重复此步骤，直到获得克隆实验所需的 SC 数量。
7. 在整个采集过程中，将所有捕获的体细胞保持在该微滴中。
8. 一旦获得克隆所需的数量的 S，使用微滴液进行简单的清洗程序，去除随附的精子、细胞残渣和微生物污染物。
9. 取第二个碗盖，依次对洗涤器进行三步清洗（盖子#2， 图2B）：
   1. 用微量移液器捕捉体细胞，并小心地将其沉积在第一滴液的表面。让它们静置3-5分钟（见图2B;掉落#1）。
   2. 重复步骤5.9.1，并将它们投入第二个滴落点（图2B;掉落#2）。
   3. 重复步骤5.9.1，将体细胞沉积到第三滴中（图2B;掉落#3）。
10. 最后一步，将分离出来的体细胞沉积到最终微滴液中，准备用于体细胞核移植手术（见图4D）。
    注意：每次重新捕获时，抽取最小的中等体积的SCs，以减少精子、碎屑和微生物污染物。

结果

表1 显示，微吸技术能高效回收冷冻保存马中的体细胞，捕获率从317.7±9.60到424.7±33.65细胞/小时，涵盖三匹种马。种马#03产量最高，证明了该方法即使在长期储存样本中也有效。数据表明，该技术能够持续且有效地从中分离体细胞，平均捕获率和标准差提供了效率和一致性的定量指标，从而支持其在体细胞核移植中的应用。

分离每个体细胞不需要显著的吸气力，尽管部分细胞在此过程中倾向于附着于微量移液器的尖端。作过程中观察到的一个显著特征是孤立细胞的刚性和低变形性。

使用硼硅酸钠玻璃，提供耐用且具足够透明度的微量移液器，以监测细胞吸入过程中的所有运动。在我们的实验条件下，利用直径25-30微米的微量移液器收集了所有已识别的单核。有趣的是，根据大小和形态，识别出五种不同的体细胞类型（

讨论

细胞和配子的微作使得复杂的辅助生殖技术变得简单化。例如手工克隆²¹的体细胞克隆、辅助孵化²²、胞质内精子注射（ICSI）²³，以及受精卵²⁴的核前显微注射等。

开发有效分离体细胞的方法是现代动物繁殖技术中极具价值的工具。然而，许多生物学方面仍不为人知，且各种技术因素仍在限制这些细胞在生物技术（如体细胞克隆）中的应用。与此前报道的基于离心法⁵或渗透梯度^7,8的分离方法不同，后者依赖延长体外培养，且仅在^数周后效率有限地产生原级细胞系。该方法能够立即从冷冻保存的马中恢复体细胞，数量足以进行常规克隆

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 β 巰基乙醇	SIGMA	M7522	体细胞培养
1个DPBS	GIBCO	参考号-21600010	体细胞作
绝对乙醇	HYCEL	埃尔克里索尔 50181-1L73	用于移液器制造
抗生素-抗胶类药物100倍	体外受孕。M&teacute;西科		体细胞培养
硼硅酸盐毛细血管（内径1.0毫米，内径0.78毫米，长度100毫米）	哈佛设备，美国	EC1-30-0035	用于移液器制造
BSA	SIGMA	A3311	体细胞培养
DMEM/F12 中等音	GIBCO	参考号-12500-062	体细胞培养
马匹冷冻保存样本			冷冻保存的样本来自商业分销商，并在液氮中保存了超过19年。所有冷冻马样本均来自墨西哥相关兽医部门授权的商业分销商，依据墨西哥官方标准NOM-027-ZOO-1995《家畜的动物检疫流程》。
目镜准星		移液器制造工具	所需设备
胎牛血清	GIBCO	参考号-26140-079	体细胞培养
氟酸	西格玛-奥尔德里奇	339261	用于移液器制造
反转光学显微镜	Eclipse，TE 200	尼康	体细胞微作
实验室及nbsp;干烤箱		移液器制造工具	所需设备
微锻炉		移液器制造工具	所需设备
倒置显微镜微作手套组		细胞的微作	所需设备
微型移液器拔除器	P-97，萨特仪器	移液器制造工具	请使用以下设置—热量：720;拉力：30;速度：50;时间：220;压力
矿物油	SIGMA	M8410	体细胞作
Nunclon 细胞培养皿，直径和时间;H 35毫米及时间;10毫米	双克隆	南克·153066
志愿军	SIGMA	P8136	体细胞培养
PVP	SIGMA	P5288	体细胞培养
锥蓝溶液 0.4%	GIBCO	参考资料 - 15250061	细胞染料