使用过氧化物酶体特异性探针对哺乳动物细胞进行染色

摘要

PeroxiSPY 探针用于检测哺乳动物细胞中的过氧化物酶体。本文演示如何使用这些探针对活细胞和固定细胞中的过氧化物酶体进行染色。

摘要

过氧化物酶体是普遍存在的细胞器，在人类健康中具有重要作用，其功能障碍会导致一系列遗传性疾病。过氧化物酶体的可视化对于识别其功能异常至关重要；然而，由于缺乏特异性的过氧化物酶体探针，相关研究进展受到限制。我们开发了PeroxiSPY——一类模拟天然过氧化物酶体代谢物的特异性探针，实现了在活体哺乳动物细胞中对过氧化物酶体动态的实时检测、追踪和定量分析。此外，该技术在患有过氧化物酶体疾病的患者细胞中的应用揭示了其病理表型。本文提供了在活体哺乳动物细胞中检测过氧化物酶体的详细实验方案，以及在固定细胞中染色后检测过氧化物酶体的方法。我们展示了如何使用过氧化物酶体特异性探针对活细胞中的过氧化物酶体进行染色，重点介绍了细胞准备、操作时间、可重复性及问题排查。这些探针实现了快速、特异且无毒的活细胞过氧化物酶体检测，为评估过氧化物酶体功能及其在相关疾病中的功能障碍提供了独特而定量的方法。

引言

过氧化物酶体是最丰富的真核细胞器，某些细胞中的过氧化物酶体数量可超过一千个¹。其功能对生物体的发育和代谢适应至关重要^1,2，这一点在多种人类过氧化物酶体疾病中得到证实，这些疾病通常表现为幼儿无法治愈的神经退行性和神经代谢性疾病^3,4。据我们所知，此前尚缺乏可在活细胞和组织中特异性标记过氧化物酶体的选择性方法。这类工具对于研究和诊断应用具有重要价值，能够直接且定量地测量过氧化物酶体形成与功能的多个方面⁶。这些探针具有足够的通用性，一方面可用于提供细胞中过氧化物酶体功能的定量读数，另一方面也可用于转化疗效检测或作为过氧化物酶体疾病的诊断工具⁶。PeroxiSPY染色是一种快速、特异且无细胞毒性的非侵入性活细胞过氧化物酶体检测技术。本文中，我们描述了如何使用过氧化物酶体探针在哺乳动物细胞系中进行染色（这些探针在斑马鱼胚胎中也已证明可实现特异性过氧化物酶体染色，但不适用于植物拟南芥Arabidopsis thaliana细胞中过氧化物酶体的染色⁶）。染色过程可在10分钟内完成。探针信号可持续检测数小时，也可采用多聚甲醛固定法进行固定，以便后续进行免疫染色。

方案

1. 活细胞染色

1. 活细胞成像的细胞培养准备（耗时：24 小时）
   注意：本研究中所有实验均遵循标准的细胞培养操作规程。SH-SY5Y 细胞系在 DMEM 或 DMEM/F12 培养基中培养，添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素/链霉素，在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下维持。某些成像系统对培养基成分敏感。如果显微镜检测到培养基中酚红的信号，请使用不含酚红的替代培养基。此外，如果显微镜未配备 CO₂ 培养室，请更换为含 HEPES（pH 7.4）的培养基。
   1. 实验前一天，将细胞传代至玻璃底成像培养板中，使次日细胞融合度达到 30–70%。
      注意：本方案中使用了 4 孔 35 mm 培养板。
      1. （关键步骤）请勿使用饥饿或应激状态的细胞进行传代。确保细胞系定期更换新鲜培养基（至少每 2–3 天一次），并在细胞融合度达到 90% 前进行传代。目的是获得健康的细胞系，以确保染色均匀。
         注意：某些细胞（如干细胞）需要在玻璃表面涂覆适当的包被层（如 Matrigel），且该包被层不应干扰染色过程。
2. 成像系统的准备（耗时：1 小时）
   注意：对细胞器及其动态进行成像需要高空间分辨率。本方案使用配备 GaAsP 光电倍增模块、CO₂ 培养室和温度控制单元的共聚焦显微镜。采用双向检流计扫描模式，使用 CFI Plan Apo Lambda 60x 油镜（NA 1.42）进行成像，555 探针使用 561 nm 激光（50 mW），650 探针则使用 640 nm 激光或等效光源。过氧化物酶体在人源细胞系中进行可视化。不同细胞系与探针的孵育时间可能有所不同。建议通过在染色后不同时间点观察细胞来优化孵育时间（图 2A）。
   1. 启动共聚焦系统。在开始染色并将细胞置于显微镜前，确保 CO₂ 和温度（37 °C）已稳定至少 20 分钟。
      注意：（关键步骤）必须通过肉眼观察确认细胞在整个实验过程中保持健康状态，并维持培养基的 pH 和温度。可通过参数控制单元以及观察培养基颜色（若使用酚红）来实现。为此，可使用温度和 CO₂ 控制器。
   2. 设置共聚焦显微镜软件。启动软件并打开 561 nm 激光用于 555 探针染色。调整采集参数和激光功率。本方案使用 1% 激光功率、HV（增益）100，分辨率为 1024 × 1024 像素，放大倍数为 3 倍以成像细胞。
3. 过氧化物酶体染色（耗时：1–5 分钟）
   1. 移取适量探针，使其终浓度为 1 µM。例如，对于 0.5 mL 培养基，加入 0.5 µL 探针。
   2. 选择待染色的孔，并用记号笔在孔外侧标记。
   3. 从选定孔中吸出全部（0.5 mL）培养基，并转移至含有步骤 3.1 中探针的微量离心管中。
      注意：此步骤中必须彻底移除孔内所有培养基，以确保染色均匀。
   4. 上下吹打 3 次以混合培养基与探针。将全部混合液吸入移液器中。
      注意：也可使用涡旋振荡代替吹打进行混合。
   5. 将混合液逐滴加回选定孔中，确保移液器头接触孔壁。加回混合液后，立即启动 10 分钟计时器。
   6. 盖上盖子，在物镜上滴加一滴浸油（本方案使用 60× 油镜），并将培养板置于显微镜上准备成像。
      注意：建议针对每种细胞系优化探针浓度以确保染色均匀。推荐在 5–20 分钟内测试 0.25、0.5、1 和 2 µM 浓度；通常较低浓度背景信号更低（图 2A）。根据细胞系和显微镜探测器的灵敏度，染色后可在 5 分钟至 24 小时内对细胞进行成像。在某些情况下（如干细胞成像），加入探针后超过 180 分钟仍可观察到信号且无明显变化。在任意时间点均可更换培养基以洗去探针，这将导致 HEK293T 细胞的染色信号在约 30 分钟内逐渐减弱。
4. 活细胞中过氧化物酶体的共聚焦成像（耗时：10 分钟–3 小时）
   1. 将培养板置于显微镜上后，调整焦距至已染色孔中的细胞，并开始成像。
   2. 当细胞清晰聚焦后，根据标准共聚焦显微镜设置指南调整增益（HV 或探测器灵敏度）和激光功率参数。
   3. 找到目标细胞群并进行定位（放大），聚焦后调整采集参数以满足所需的图像质量。
      1. 设置图像采集参数：在 NIS-Elements 软件中设置激光功率为 0.5–1%，HV（增益）为 100。检查图像是否过饱和（若过饱和，则调整强度和增益）。
      2. 选择扫描尺寸。采集 1024 × 1024 像素的图像，扫描速度（1/2–1/4），线平均（2），放大倍数（3），以适应当前成像需求。
         注意：过氧化物酶体在图像采集过程中会发生移动，可能导致伪影。推荐参数已优化，可在保证图像定量质量的同时最小化运动痕迹。进行延时成像时，应在开始录像前设定好时间间隔、持续时间和循环次数。探针具有良好的光稳定性。
   4. 采集所有图像并以可访问的标签命名保存（本方案使用 .nd2 格式，由 Nikon NIS-Elements 软件生成）。

2. 固定细胞的染色

1. 活细胞成像的细胞培养准备（时长：24 小时）
   注意：所有实验均遵循标准细胞培养方案。Huh7 细胞在添加了 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素/链霉素的 DMEM/F12 培养基中，于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养。
   1. 实验前一天，将细胞传代至含盖玻片的培养板中，使次日细胞融合度达到 30–70%。
      注意：在带有 18 mm 盖玻片的 12 孔板中，每孔接种 50,000 个细胞；或在带有 13 mm 盖玻片的 24 孔板中，每孔接种 15,000 个细胞。
2. 过氧化物酶体染色（时长：1–5 分钟）
   1. 在避光的微量离心管中，用新鲜培养基将探针稀释至终工作浓度为 4 µM，例如，对于 0.5 mL 培养基，加入 2 µL 探针（储备液浓度：1 mM）。
   2. 选择待染色的孔，并用记号笔在孔外侧做好标记。
   3. 从选定孔中吸除全部（0.5 mL）培养基，并替换为步骤 2.2.1 中配制的含探针培养基。逐滴加入探针培养基，确保移液器枪头接触孔壁。
   4. 加入染色液后，将细胞在 37 °C 下孵育 10–15 分钟。
      注意：自此步骤起，细胞对光敏感，应使用铝箔包裹避光。
3. 染色后固定及固定细胞中过氧化物酶体的成像
   1. 染色完成后，小心吸除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。
   2. 在室温下用含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 溶液固定细胞 20 分钟。
   3. 小心将 PFA 溶液转移至指定的废液容器中，并用 PBS 洗涤细胞一次。
      注意：PFA 具有毒性，必须按照机构规定进行处置。
   4. 如需进行免疫荧光染色，请按以下步骤操作
      1. 加入用 PBS 稀释的 0.5% Triton-X 溶液，以通透细胞，作用 2.5 分钟。
      2. 小心吸除 Triton-X 溶液，并用 PBS 洗涤细胞两次，每次 10 分钟。
      3. 用含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 溶液在室温下封闭 20 分钟，或在 4 °C 下封闭过夜。
      4. 按照标准免疫荧光实验流程继续操作。

结果

PeroxiSPY 探针经过设计，可模拟过氧化物酶体的天然底物——支链和极长链脂肪酸⁵。因此，染色将导致探针通过三磷酸腺苷（ATP）结合盒转运蛋白亚家族 D（ABCD）依赖的方式从细胞质被导入过氧化物酶体^5,6,7。根据细胞的代谢状态，ATP 依赖的 ABCD 转运可能高效且快速地将探针导入，从而产生较高的过氧化物酶体与细胞质之间的荧光强度比（图 1A）。确保该比值较高的关键步骤包括：定期更换培养基以避免细胞饥饿，以及避免细胞在过高融合度下生长。

为验证过氧化物酶体染色的特异性，建议设置多个对照（图1B，C）。可与过氧化物酶体参考标记物进行共定位分析，例如蛋白输入标记GFP-SKL（图1B，C）。此外，若可获得缺乏过氧化物酶体的细胞系（如PEX19基因敲除细胞系），则在这些细胞中应无染色信号（图1B）^5,8。

过氧化物酶体探针可用于测量过氧化物酶体的密度（图1C）^5,9，并正在被开发用于评估底物输入、过氧化物酶体动态变化及其相互作用。在进行定量成像时，标准化染色程序、图像采集时间（例如染色后10–20分钟）、细胞系制备以及采集参数至关重要。某些细胞系需要优化探针浓度和染色时间，以提高过氧化物酶体信号相对于胞质背景的强度，例如，250 nM探针浓度作用20分钟对COS-7细胞效果更佳（图2A）。细胞会代谢这些探针，导致过氧化物酶体染色信号随时间逐渐减弱；然而，过氧化物酶体与细胞质的信号比值可能在24小时内逐步改善（图2B）。此外，我们开发了一种固定方法，可实现与抗体的共染色，并在后续时间点对过氧化物酶体进行可视化观察（图2C、D）。

图1：活细胞中过氧化物酶体的成像。（A）染色示意图。（B）过表达GFP-SKL并用红色过氧化物酶体探针（1 µM，孵育10分钟）染色的野生型（WT）和PEX19基因敲除（KO）HEK293T细胞的共聚焦显微图像。比例尺—1 µm和10 µm。图中显示了代表性的荧光强度分布曲线。（C）过表达GFP-SKL并用PeroxiSPY（1 µM，孵育10分钟）染色的人成纤维细胞的共聚焦显微图像。比例尺—1 µm和10 µm。图中显示了代表性的荧光强度分布曲线。（D）用红色过氧化物酶体探针（1 µM，孵育10分钟）染色的SW13（肾上腺皮质细胞）、SH-SY5Y（神经母细胞）、CCL-136（肌细胞）、HaCat（角质形成细胞）、U2OS（成骨细胞）和HEK293T（人胚胎肾细胞）细胞的共聚焦显微图像。比例尺—2 µm和10 µm。定量分析使用Fiji软件进行，方法如前所述⁹，结果显示每平方微米内的过氧化物酶体数量，数据以均值±标准误（SEM）表示，N = 100个细胞，来自3次独立生物学重复实验；*** - p < 0.001，**** - p < 0.0001，采用Kruskal-Wallis检验。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：过氧化物酶体成像优化及固定细胞染色。（A）根据标准方案（1 µM，孵育10分钟；优化前）和优化条件（250 nM，孵育20分钟；优化后）使用红色过氧化物酶体探针对COS-7（非洲绿猴肾）细胞进行共聚焦显微镜观察。比例尺为10 µm。使用Fiji软件定量分析过氧化物酶体和细胞质的平均像素强度，并以比值形式表示。N = 7个细胞（优化前）和21个细胞（优化后）。数据以均值±标准误表示，*** - p < 0.001，**** - p < 0.0001，Shapiro-Wilks检验。（B）HEK293T细胞经红色过氧化物酶体探针（1 µM）分别染色15分钟和24小时后的共聚焦显微镜图像。定量结果显示过氧化物酶体与细胞质的荧光强度，以及过氧化物酶体与细胞质的荧光强度比值，数据以均值±标准误表示，N = 680个过氧化物酶体，来自3次生物学重复实验的合并数据，**** - p < 0.0001，Shapiro-Wilks检验。（C）采用固定方案对Huh7细胞使用过氧化物酶体探针进行染色，并与抗PEX14一抗（1:100稀释于封闭液中，室温孵育1小时）及二抗（1:1000稀释于封闭液中，山羊抗兔IgG-Alexa Fluor 488，室温孵育1小时）进行共染色。图中显示代表性共聚焦图像。比例尺为10 µm。（D）定量分析按照标准方案在HEK293T细胞上进行固定和通透处理过程中过氧化物酶体荧光强度的变化，数据以均值±标准误表示，N = 100个细胞，来自三次生物学重复实验的合并数据，**** - p < 0.0001，Shapiro-Wilks检验。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

这种简单的过氧化物酶体检测可在动物细胞中10分钟内完成。PeroxiSPY染色可实现活细胞中过氧化物酶体的可视化、定量和示踪，目前提供红色（材料表）和远红探针⁵（材料表）两种形式。该染色方法对过氧化物酶体的可视化效果与经典的基于过氧化物酶体靶向信号（PTS1）的染色方法相当¹⁰（图1B），但无需过表达操作。这些荧光染料具有良好的光稳定性，可用于超分辨率成像以及在不同实验条件下对过氧化物酶体动态进行长期采集^5,9,11。此外，这些探针对过氧化物酶体功能状态敏感，因此可用于检测和定量过氧化物酶体病理变化⁵，适用于科研和诊断应用。过氧化物酶体染色依赖于过氧化物酶体的代谢活性及其摄取和氧化脂肪酸的能力。因此，针对所使用的细胞系优化染色浓度和孵育时间至关重要。本文提供了一种在我们测试的细胞系中有效的标准操作流程；然而，染色时间可延长至24小时，而不会降低过氧化物酶体与细胞质之间的荧光强度比（图2B）。

这些探针已在多种哺乳动物细胞系（图1 和 图2）以及斑马鱼 Danio rerio 的细胞和胚胎中进行了测试⁵，表现出对过氧化物酶体的特异性及使用便捷性。这些探针尚未在其他动物细胞系中进行测试，其使用条件及探针浓度需针对不同细胞系进行优化。这些探针不能标记植物拟南芥 Arabidopsis thaliana 细胞中的过氧化物酶体⁵。

以下讨论了一些常见问题及其相应的解决方案。如果过氧化物酶体与细胞质的比值过低（过氧化物酶体染色较弱），请确保细胞为 freshly split（刚传代）状态，并在染色前再次进行传代。染色时细胞融合度应控制在30-70%。优化探针的浓度（浓度过高会导致探针超出过氧化物酶体的摄取能力）以及孵育时间（例如参见图2A）。建议使用35 mm玻璃底培养皿（在96孔板中染色因液体体积小、混合困难而更具挑战性）。确保将探针加入微量离心管中，并与培养基充分混匀后再加入细胞。不同的细胞系和培养条件均会影响染色效果。最后，洗涤去除未结合的探针可降低背景信号；但信号会随之逐渐减弱，从而缩短有效成像的时间窗口。

若未观察到明显的过氧化物酶体，请确保探针已与培养基充分混合。可提高探针浓度（例如至 2 µM）。引入额外的过氧化物酶体标记物，以确认过氧化物酶体是否可被可视化。若染色存在细胞间差异，重要的是在操作时彻底移除所有培养基，并将其与分装的探针溶液充分混匀后再加回细胞中，以确保染色均匀。若仍存在差异，可能是细胞群体在过氧化物酶体底物导入能力方面具有异质性。通过规律传代使细胞同步化，有助于实现均匀染色。若未检测到信号，请检查显微镜的激光设置是否与探针的激发/发射参数相匹配。若细胞外背景过亮，可通过洗涤去除探针以降低背景；但需注意，信号会随之逐渐减弱，从而缩短有效成像的时间窗口。此外，可采用固定法来降低背景。若固定后的信号非常微弱，请检查在加入 Triton-X 100 后信号是否丢失。此步骤可根据后续应用需求进行调整或省略。减少洗涤步骤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗PEX14抗体	Proteintech	10594-1-AP
共聚焦显微镜	Nikon	A1r	任何配备高数值孔径物镜（例如60倍油镜，NA 1.4）的共聚焦显微镜
DMEM	Pan Biotech	P04-03590	细胞培养基
玻璃底成像培养板	Cellvis	D35C4-20-1.5-N
山羊抗兔Alexa Fluor 488	ABCAM	ab150081
HEK293T	ATCC	CRL-3216
PeroxiSPY555	Spirochrome	https://spirochrome.com/product/peroxi_spy555/	https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2
PeroxisPY650	Spirochrome	https://spirochrome.com/product/peroxi_spy650/	https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2