需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

模拟肿瘤相关巨噬细胞 体外肿瘤微环境动态中分泌因子的作用

452 次观看

⸱

DOI：

10.3791/69406

⸱

2025年12月30日

 ,  ,  , 
1Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICET, Academia Nacional de Medicina

本文内容

摘要

本文介绍了一种 体外 通过将人单核细胞暴露于肿瘤细胞系的条件培养基来生成类似肿瘤相关巨噬细胞的实验方案。

摘要

巨噬细胞具有显著的可塑性，能够根据多种环境信号获得不同的功能状态。在实体瘤中，巨噬细胞通常是肿瘤微环境中最丰富的免疫细胞群体，被称为肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）。TAMs 与恶性细胞密切相互作用，积极促进肿瘤进展、血管生成及免疫逃逸。肿瘤细胞可通过直接的细胞间接触以及多种分泌因子对巨噬细胞进行重编程，诱导其极化为促肿瘤表型。为研究这些 TAM 极化机制 体外我们提出一种方法，将人单核细胞暴露于肿瘤细胞系条件培养基中存在的可溶性因子。该方案可在受控条件下生成类似肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的巨噬细胞，便于分析肿瘤来源信号诱导的表型与功能变化。本方法提供了一种可重复且具有生理相关性的模型，用于研究肿瘤细胞与巨噬细胞之间的相互作用，加深对巨噬细胞重编程机制的理解，并支持癌症免疫学与免疫治疗领域中新型治疗策略的研究。

引言

巨噬细胞是具有多种功能的天然免疫细胞，其显著的可塑性使其能够根据环境信号采用不同的表型1。在实体瘤中，巨噬细胞常成为最丰富的免疫细胞群体，并分化为肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）2。这些细胞被肿瘤微环境主动重编程，以支持肿瘤生长、促进血管生成、协助转移，并抑制有效的抗肿瘤免疫应答。肿瘤细胞通过直接的细胞间相互作用以及一系列复杂的分泌因子（包括细胞因子、趋化因子和生长因子）驱动这种极化过程，从而重塑巨噬细胞的转录和功能程序3。这种动态的相互作用构成了TAMs在癌症生物学中的核心作用，同时也凸显了巨噬细胞可塑性在治疗干预中既是挑战也是机遇2。

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的临床意义正日益受到重视：其在肿瘤中的丰度通常与不良预后及治疗耐药性相关4,5。因此，TAMs6 已成为有前景的治疗靶点。目前正在进行多种策略的研究，旨在阻断其招募、抑制其存活，或将其重编程为促炎性和杀瘤表型6。因此，阐明肿瘤来源因子将巨噬细胞极化为 TAMs 的机制，对于开发有效的免疫疗法至关重要。尽管免疫检查点阻断在多种癌症中已显示出显著疗效，但在其他癌症中其效果仍然有限7。将靶向 T 细胞的疗法（如抗程序性死亡蛋白 1（PD-1）或抗程序性死亡配体 1（PDL-1）抗体）与巨噬细胞重编程策略联合使用，可能增强整体抗肿瘤免疫应答。

研究肿瘤相关巨噬细胞（TAM）生物学的传统实验模型包括体内小鼠癌症模型，这类模型提供了复杂且具有生理相关性的环境8。这些模型已为TAM的募集和功能提供了基础性认识。然而，免疫信号传导、肿瘤生物学以及巨噬细胞发育起源方面存在显著的种间差异，可能限制其向人类疾病的直接转化9,10。此外，体内系统的复杂性使得研究驱动巨噬细胞极化的特定信号通路或分子事件变得困难。

相比之下，体外（in vitro）模型提供了更简单且可控的条件，可用于解析这些机制。目前最广泛使用的方法是利用特定刺激物诱导人单核细胞来源的巨噬细胞极化：使用干扰素γ（IFN）和细菌脂多糖（LPS）诱导生成促炎性巨噬细胞（M1），或使用白细胞介素4（IL-4）和白细胞介素10（IL-10），或地塞米松诱导获得多种抗炎性巨噬细胞（M2）亚型11,12,13,14。这些模型有助于鉴定与经典巨噬细胞极化状态相关的分子标志物和转录程序。然而，它们仍无法完全模拟巨噬细胞在肿瘤内所处的复杂且多因素并存的微环境，在该环境中，巨噬细胞的极化受到多种可溶性介质、代谢信号以及细胞间相互作用的共同影响15,16。尽管经典的M1/M2分类对于描述巨噬细胞功能状态仍具有实用价值，但目前已有明确证据表明，巨噬细胞群体的多样性远超以往认知。Ginhoux博士团队及其他研究者利用单细胞转录组学方法，已证实巨噬细胞亚群在生理条件和疾病状态下均具有广泛的异质性17,18。这表明，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）虽然常被描述为具有类似M2的表型，但并不完全等同于仅由经典细胞因子诱导分化的巨噬细胞；相反，它们虽共享某些特征，但也表现出独特且依赖于微环境的差异性。

为了弥补这一差距，我们提出了一种 体外 通过将人单核细胞来源的巨噬细胞暴露于肿瘤细胞系收集的条件培养基中，建立模拟肿瘤相关巨噬细胞（TAM）样极化的实验方案。该方法可捕捉肿瘤分泌组的影响，即癌细胞分泌的多种细胞因子、趋化因子和生长因子的复杂混合物。因此，该体系为研究巨噬细胞在肿瘤来源可溶性因子作用下的表型与转录重编程提供了相关且易于操作的实验平台。与以往将单核细胞直接暴露于肿瘤条件培养基的方法不同，本方案专注于巨噬细胞的重编程过程，从而更真实地反映肿瘤微环境中组织驻留巨噬细胞的行为特征19,20此外，该方法包含一组经过优化且简洁的表面标志物组合，可用于通过流式细胞术评估巨噬细胞极化状态，操作简便，并可根据研究者的需要进行扩展。14,21最后，由于M-CSF已被证明可促使单核细胞向M2样表型极化10,15,22,23,24我们特意省略了它，以确保所观察到的巨噬细胞极化结果 specifically 源于暴露于肿瘤细胞系来源的条件培养基。

该方法具有多个优势：它保留了体外（in vitro）系统的可重复性和简便性，采用原代人源细胞以提高转化相关性，并且相较于单一细胞因子模型，更能反映肿瘤微环境的异质性和多因素特性25,26,27,28。此外，该方法有助于比较巨噬细胞对不同肿瘤类型或基因修饰癌细胞所分泌的条件培养基的反应，并可作为测试可能改变肿瘤相关巨噬细胞（TAM）极化状态的药理学试剂的平台。除了具有广泛的适用性外，通过选择适当的细胞系或调整条件培养基的比例，该方法还可针对不同的肿瘤模型进行优化。然而，使用者应注意，不同健康供体和肿瘤细胞系之间的变异性可能影响实验的可重复性，因此强调了严谨的实验设计和标准化的重要性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

在符合《赫尔辛基宣言》的要求并获得知情同意后，从健康供者处采集外周血样本。本方案已获得布宜诺斯艾利斯大学机构伦理委员会的批准。有关本方案中使用的所有材料和试剂的详细信息，请参见材料表。

注意：整个实验过程中需保持无菌条件，在生物安全二级（BSL-2）生物安全柜中操作，并确保细胞活力 >90%。所有生物废弃物必须先浸泡于10%次氯酸钠溶液中至少30分钟进行去污处理，然后放入指定的生物危害废弃物容器中处置。

1. 肿瘤细胞系培养及条件培养基制备

  1. 从液氮中取出MDA-MB-231三阴性人乳腺癌（或其他选定肿瘤）细胞系，迅速将其置于37 °C水浴中，轻轻摇动冻存管，以确保细胞快速且均匀地解冻。当细胞大部分已解冻时，立即取出冻存管。
  2. 将解冻后的细胞转移至含有5 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的15 mL离心管中。在室温（RT）下以400 × g离心5分钟。
    注意：解冻过程必须迅速完成，以保持细胞活性。
  3. 小心弃去上清液，并迅速将细胞沉淀重悬于1 mL新鲜的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，该培养基含有高糖（4.5 g/L）、10%胎牛血清（FBS）、4 mM谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠。对重悬后的细胞进行计数，操作如下两步连续稀释：
    1. 首先用无菌DMEM培养基将细胞悬液按1:5比例稀释，再用台盼蓝活性染料按1:2比例稀释，最终获得1:10的稀释度。
    2. 使用光学显微镜在纽鲍尔血细胞计数板（或计数室）中计数活细胞。仅计数排除蓝色染料的活细胞，并计算每个大角方格中活细胞的平均数量。
    3. 使用以下公式计算最终浓度：细胞/mL =（每方格平均细胞数）×（稀释倍数）× 10,000。
      注意：将细胞重悬于适量的完全DMEM培养基中，使最终浓度达到1×105个细胞/mL。
  4. 将2.5×105至5.0×105个细胞接种到含有5 mL完全DMEM培养基的T25培养瓶中。将培养瓶置于37 °C、含5% CO2 的湿润培养箱中培养，直至达到所需收获细胞密度。
  5. 接种后次日，在显微镜下检查细胞贴壁情况。若超过50%的细胞漂浮（提示细胞死亡），则轻柔吸除旧培养基，并更换为2.5 mL新鲜预温的培养基。
  6. 每日监测细胞生长情况。当培养物达到约90%融合度（T25培养瓶中约含2.3×106个细胞），通常在5天内，即可进行传代（分瓶）。按1:8比例传代时，请按以下步骤操作：
    1. 使用无菌巴斯德吸管移除用过的培养基。
    2. 用3 mL无菌1×PBS冲洗细胞单层一次，以去除残留血清（血清会抑制胰蛋白酶活性）。吸除并弃去1×PBS。
    3. 向细胞中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，在37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育3分钟，使细胞脱落。
      注意：胰蛋白酶/EDTA的最佳孵育时间因细胞系而异，可能需要调整。3分钟后在显微镜下观察细胞，确保其完全脱落。
    4. 加入3 mL完全DMEM培养基以中和酶活性。随后立即轻柔吹打数次，使细胞完全脱落并悬浮。
  7. 将3.5 mL细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，在室温下以400 × g离心5分钟。
  8. 小心弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL冻存液中（冻存液必须含90% FBS和10%二甲基亚砜（DMSO））。将细胞悬液转移并分装至冻存管中，确保每管含5×105个细胞，以备后续使用。
    1. 冻存过程需逐步降温：将冻存管放入“Mr. Frosty”（或类似程序降温容器）中，随后转移至-80°C冰箱，过夜冷冻。细胞可在-80°C保存数天，但应尽快转移至液氮中进行长期保存。
      注意：详细记录细胞代次，实验应使用早期代次细胞。建议使用代次少于20代的细胞。
  9. 当新培养的细胞再次达到约90%融合度时，吸除培养基并将上清液收集至15 mL锥形管中。如需继续维持培养，应补充等体积的新鲜完全DMEM培养基。
    1. 在4 °C下以400 × g离心5分钟，沉淀并去除细胞碎片。保留上清液（即澄清的条件培养基），弃去沉淀。
  10. 将澄清的条件培养基分装为每份1 mL，标记管号后于-20 °C保存备用。
    注意：为保证质量控制，应始终记录条件培养基的收集日期以及分装样本是否曾解冻过。强烈建议同一分装样本解冻不超过两次。此外，应在冷冻后一个月内使用条件培养基，以确保其最佳活性。

2. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离

注意：外周血单个核细胞（PBMC）从40 mL经3.8%枸橼酸钠抗凝的外周血中分离获得。分离过程采用Ficoll-Hypaque密度梯度介质（1077）并进行离心。整个实验操作必须在生物安全二级（BSL2）柜中的无菌条件下进行。

  1. 将抗凝的外周血样本分装至15 mL或50 mL的锥形离心管中，以备后续离心步骤使用。
  2. 以低速（200 × g）在室温下离心15分钟，以分离血液成分。此过程将产生富含血小板的血浆（PRP）作为上层，细胞组分（红细胞和白细胞）位于下层。离心机的加速度设置为4，减速度设置为2（最大值为5）。
  3. 离心后，用移液器小心吸出上清液（即PRP），并转移至新的无菌离心管中。
    注意：如后续实验需要，可将收集的PRP在室温下以600 × g离心10分钟（最大加速度和减速度）以去除血小板，并将去除了血小板的血浆在-20 °C保存，用于其他检测。
  4. 将步骤2中初次离心获得的下层细胞组分用无菌的室温1×PBS轻柔稀释至最终体积为原体积的2至3倍。通过轻轻颠倒混匀所得悬液，并用于Ficoll-Hypaque密度梯度离心。
  5. 将15 mL室温Ficoll-Hypaque溶液加入无菌的50 mL离心管中。
  6. 小心且缓慢地将30 mL稀释后的血液样本叠加于Ficoll-Hypaque溶液之上，确保两相不混合。
  7. 将Ficoll-血液分层管在室温下以600 × g离心25分钟。离心机设置为无刹车模式（加速度：1；减速度：0）。
  8. 使用无菌巴斯德吸管弃去至少4 mL的上层液体，以避免扰动。然后使用同一吸管回收位于上层液体与Ficoll-Hypaque透明层之间的白色环状层（含外周血单个核细胞，PBMCs）。注意避免将Ficoll溶液一并吸出。
  9. 将PBMC环状层从离心管转移至含至少3 mL 1×PBS的无菌15 mL离心管中。
  10. 向15 mL离心管中补充更多1×PBS，以600 × g（最大加速度和减速度）在室温下离心10分钟。
  11. 通过倒置弃去上清液，再次加入1×PBS，以600 × g（最大加速度和减速度）在室温下离心10分钟。
  12. 弃去上清液，将PBMC沉淀重悬于2至3 mL无菌的1×PBS加2%热灭活胎牛血清（1×PBS-2% FBS）中，然后补液体积至10 mL。进行细胞计数：用无菌冷1×PBS将细胞悬液稀释1:5，再用0.4%台盼蓝稀释1:2，最终稀释倍数为1:10。使用光学显微镜下的细胞计数板进行计数，方法如步骤1.3.2所述。
  13. 将PBMC悬液在8–10 °C下以300 × g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于适量无菌、冰冷的1×PBS-2% FBS中，调整细胞终浓度为108个细胞/mL。将细胞置于4 °C保存，直至下一步操作。
    注意：此时收集的PBMCs可使用冻存液（90% FBS-10% DMSO）重悬，按108 个细胞/mL分装至冻存管中。将冻存管置于Mr. Frosty容器中，在-80 °C冰箱中过夜，以实现缓慢降温。次日，将细胞转移至冻存盒中，在-80 °C继续保存数天，或转移至液氮罐中长期保存，也可继续进行后续实验步骤。

3. 使用磁珠分选 CD14+ 单核细胞

注意：使用人 CD14+ 阳性选择磁珠分选试剂盒11 从外周血单个核细胞（PBMC）中获取纯化的 CD14+ 单核细胞。PBMC 中 CD14+ 细胞的比例因供体而异，但可估计为 10%（范围为 5–20%）。根据实验所需的单核细胞数量，调整起始 PBMC 数量和最终反应体积。建议的最小反应体积为 100 µL，即使处理的 PBMC 数量少于 1 × 107 时也应如此。

  1. 每 100 µL PBMCs 中加入 10 µL 阳性筛选混合液，用移液器吹打混匀，冰上孵育 15 分钟。
  2. 使用前将磁珠悬液涡旋振荡 30 秒。然后每 100 µL PBMC 悬液中加入 10 µL 磁珠，充分混匀后冰上孵育 15 分钟。
  3. 加入 1× PBS-2% FBS-1 mM EDTA 至终体积为 2.5 mL，轻轻混匀悬液，将离心管置于磁力架上孵育 5 分钟。
  4. 将磁力架连同离心管一起倒置在废弃用的收集管上方 2–3 秒，避免晃动。阳性细胞将保留在管中。
  5. 将离心管从磁力架上取下，沿管壁缓慢加入 1× PBS-2% FBS-1 mM EDTA，至终体积为 2.5 mL。
  6. 再次将离心管放入磁力架中，孵育 5 分钟。
  7. 将磁力架连同离心管一起倒置在废弃用的收集管上方 2–3 秒，避免晃动。从磁力架上取下离心管，沿管壁加入 3 mL 1× PBS-2% FBS，以充分回收所有细胞。
  8. 取 10 µL 样品，在光学显微镜下使用血细胞计数板（Neubauer 计数板）计数 CD14+ 细胞数量。用台盼蓝按 1:2 比例稀释。
    注意：按以下公式计算细胞数量：CD14+ 细胞数 = 每个象限活细胞平均数 × 稀释倍数 × 10,000。
  9. 将 CD14+ 细胞悬液转移至新的无菌 15 mL 离心管中，于 4 °C 下以 600 × g（最大加速度和减速度）离心 10 分钟，洗涤细胞。
  10. 用含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素（P/S）的完全 RPMI 1640 培养基重悬 CD14+ 细胞，调整体积使细胞浓度达到 2.5 × 106 个/mL，用于下一步实验，具体体积根据所获细胞数量确定。
    注意：在进行下一步操作前，应将 CD14+ 单核细胞置于冰上，以防止细胞贴附于塑料管壁。

4. 巨噬细胞的分化

  1. 在48孔处理板中，每孔加入250 µL完全RPMI培养基（含10% FBS和1% PS），接种纯化的CD14+单核细胞，密度为2.5 × 105 个细胞。
    注意：也可使用96孔处理板，细胞数量减半。
  2. 向周围空孔中加入无菌水，以减少培养板孵育过程中的蒸发。
  3. 将细胞置于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育5天，期间避免扰动，并每日观察细胞形态、分化情况及活力。
    注意：尽管可添加M-CSF（25 ng/mL）促进分化，但我们确认本方案仅使用10%高质量FBS，在培养5天后即可获得M0型巨噬细胞。由于M-CSF可能促使单核细胞向类似M2表型极化，我们特别建议避免使用10,22。

5. 巨噬细胞暴露于条件培养基及分析

  1. 分化第5天，轻柔地从每个孔中移除50%（125 µL）的培养基，并替换为以下任一种：
    1. 125 µL 新鲜RPMI完全培养基（对照），
    2. 125 µL 肿瘤细胞系条件培养基（例如，来自MDA-MB-231细胞系），或
    3. 125 µL DMEM完全培养基（条件培养基的对照）。
      注意：在使用新的肿瘤细胞系进行初步优化时，应测试一系列不同浓度的条件培养基（例如，10%、25%和50%）。建议采用该浓度范围以确保巨噬细胞的存活率及分化状态的变化。选择能够维持较高巨噬细胞存活率的较高浓度条件培养基。
  2. 继续培养至第7天。
    注意：第5天获得M0型巨噬细胞，随后在条件培养基存在下再培养2天，足以诱导表面极化标志物的表达。极化表面标志物通过流式细胞术检测，该方法与使用标准化细胞因子诱导M1或M2型巨噬细胞时的方法类似11,14。
  3. 每天在显微镜下评估巨噬细胞的存活率和形态。
    注意：在整个7天培养期间，应每日监测巨噬细胞的分化情况。细胞贴壁情况可作为培养物健康和存活状态的指标。在条件培养基（CM）处理组中，梭形细胞比例较高，提示分化和极化程度增加，如图2所示。

6. 通过流式细胞术收获巨噬细胞以评估极化标志物

注意：可选地，为进一步扩展对肿瘤相关巨噬细胞表型的表征，可分离RNA，通过定量聚合酶链式反应（qPCR）检测极化相关基因（如 TGM2、IRF-4 和 CXCL10）的表达水平，或收集培养上清液，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测经典细胞因子的产生（如 TNFα、IL-6 和 IL-10），具体方法见我课题组先前报道11,14。

  1. 用无菌巴斯德吸管或吸头轻轻抽吸，弃去每孔中的全部培养基，然后加入 200 µL 冷的 1× PBS-2% FBS-1 mM EDTA 缓冲液以收集细胞。
  2. 冰上孵育 10 至 15 分钟，然后加入 200 µL 1× PBS-2% FBS 以稀释 EDTA 缓冲液。在冰上用移液器反复吹打 5 分钟，直至所有细胞完全脱落，收集巨噬细胞。
    注意：此步骤对于获得足够数量的活巨噬细胞至关重要。为保持细胞活力，EDTA 处理时间不应超过推荐时长。操作完成后应在显微镜下检查细胞，确保其已完全脱落。
  3. 将巨噬细胞收集至 1.5 mL 微管中，加入 1 mL 1× PBS-2% FBS，于 8–10 °C、400 × g 离心 5 分钟洗涤细胞。
  4. 用 200 µL 1× PBS-5% FBS 重悬巨噬细胞沉淀，转移至 96 孔圆底微孔板中，在室温下封闭非特异性结合位点 15 分钟。于 8–10 °C、400 × g 离心 5 分钟。
  5. 通过快速倒置微孔板弃去上清液。
  6. 在 1× PBS-2% FBS 中配制适当的一抗混合液，每种抗体按 1:50 的稀释比例配制。每份样品加入 50 µL 抗体混合液，冰上避光孵育 30 分钟。
    注意：抗体混合液组成为：CD11b-PE/Cy7（200 µg/mL）、CD64-AlexaFluor 647（150 µg/mL）、CD163-PerCP/Cy5.5（200 µg/mL）、HLADR-PE（40 µg/mL）和 CD206-AlexaFluor 488（400 µg/mL）。预滴定的抗体浓度见表 1；货号详见材料表。
  7. 加入 150 µL 1× PBS 洗涤标记后的巨噬细胞，于 8–10 °C、400 × g 离心 5 分钟。
  8. 通过快速倒置微孔板弃去上清液。
  9. 为检测细胞活力，加入 100 µL 可固定活力染料 Zombie Violet（1:1,000 溶于 1× PBS），冰上避光孵育 30 分钟。
  10. 加入 100 µL 1× PBS 洗涤标记后的细胞，于 8–10 °C、400 × g 离心 5 分钟。再用 200 µL 1× PBS 重复洗涤一次。
  11. 用 20 µL 新鲜配制的 1% 多聚甲醛重悬细胞沉淀，冰上避光孵育 20 分钟进行固定。
    注意：本步骤使用 1% 多聚甲醛进行固定，不进行透化处理。可选：也可使用 BD 固定/透化试剂盒中的固定组分11。
  12. 加入 180 µL 1× PBS-2% FBS 洗涤细胞，于 8–10 °C、400 × g 离心 5 分钟。再用 200 µL 1× PBS-2% FBS 重复洗涤一次。
  13. 倒置微孔板弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 200 µL 1× PBS 中，送至流式细胞仪进行检测。
    注意：若标记并固定的样品无法在当天进行流式检测，应于 4 °C 避光保存，并在随后几天内尽快完成分析。
  14. 使用 FlowJo 软件分析流式细胞术结果。设门策略首先通过前向散射光与侧向散射光（FSC/SSC）排除碎片。随后选择 CD11b⁺ Zombie Violet- 细胞作为活的巨噬细胞。
    注意：由于巨噬细胞的自发荧光具有供体依赖性，每个实验必须使用来自同一供体的对照样本。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

我们通过使用来自 MDA-MB-231 细胞系的 50% 条件培养基（CM）处理单核细胞来源的巨噬细胞，生成了三阴性乳腺癌肿瘤相关巨噬细胞（TAM）样细胞。单核细胞来自六位独立健康供体的外周血单个核细胞（PBMC），并按照我们的方案进行分化。CM 的制备采用处于 90% 汇合度的 MDA-MB-231 细胞图1). 第5天将CM加入巨噬细胞培养物中，第7天收获细胞。 图2 显示了第7天有无CM条件下细胞的形态，其中梭形细胞比例较高表明CM处理组细胞的分化和极化程度增加。通过流式细胞术及一组表面标志物CD206、HLA-DR、CD64和CD163对极化状态进行了明确的定量分析。 图3 展示了对照组（DMEM培养基）与CM处理组之间这些标志物的代表性比较。对全部六名健康供体数据的分析结果（图4)证实该方案具...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文所述方案提供了一种可重复且实用的方法，通过将人单核细胞来源的巨噬细胞暴露于肿瘤细胞系条件培养基中，以研究肿瘤相关巨噬细胞样极化。该系统能够捕捉肿瘤细胞分泌的可溶性因子的影响，这些因子已知在肿瘤微环境中巨噬细胞的重编程过程中发挥关键作用7,9,10,15,19,20。通过将直接的细胞间接触从分析中分离，该方法可专注于研究调节巨噬细胞表型和功能的可溶性组分。

为确保本实验方案的成功与可重复性，必须严格控制多个关键步骤。高活力的CD14+单核细胞的分离至关重要，因为纯度或活力低下会影响分化效率。供体间的差异是导致实验异质性的常见原因，因为不同来源的原代单核细胞在基础活化状态和反应性方面存在差异...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢国家科学技术促进局（ANPCyT-FONCYT）通过以下项目提供的资金支持：PICT 2021 I-INVI-00034（授予 DR）、PICT 2021-I-A-00807（授予 E.A.C.S.）和 PICT 2021-I-A-00716（授予 A.E.E.）。我们还感谢国家科学技术研究委员会（CONICET）为 A.E.E. 提供的 PIP 2022-0763 项目资助，以及布宜诺斯艾利斯大学提供的 PIDAE 2022 项目资助。

M.C.L. 获得了布宜诺斯艾利斯大学医学院 Legado Peruilh 奖学金，并获得了 ANPCyT-FONCYT 博士研究生奖学金。D.R.、E.A.C.S. 和 A.E.E. 是 CONICET 的职业研究员。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 488 小鼠抗人  CD206 抗体，克隆号 15-2BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥货号# 321113；RRID:AB_571874
Alexa Fluor 647 小鼠抗人 CD64 抗体，克隆号 10.1BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥货号# 305012；RRID:AB_528867
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences，美国新泽西州圣何塞货号# 554714固定/透化试剂盒
DMEM 高糖培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）Gibco Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 货号# 11965092
EasySep 人 CD14 阳性选择试剂盒；EasySep 阳性选择混合液；EasySep 磁性纳米颗粒；EasySep 磁力架STEMCELL Technologies，加拿大温哥华货号# 18058
FACS Canto 流式细胞仪 Becton Dickinson，美国新泽西州富兰克林湖
胎牛血清，经鉴定，新西兰来源 Gibco™ Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 货号# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - Life Sciences，美国货号# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID:SCR_008520
GraphPad Prism  GraphPad Software Inc.RRID:SCR_002798
Partec CyFlow space 流式细胞仪 Sysmex Partec，德国
PE 标记抗人 HLA-DR 抗体，克隆号 L243BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥货号# 307605；RRID:AB_314683
PE/Cy7 标记大鼠抗小鼠/人 CD11b 抗体，克隆号 M1/70BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥货号# 101216；RRID:AB_312799
PerCP/Cy5.5 标记小鼠抗人 CD163 抗体，克隆号 GHI/61BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥货号# 333607；RRID:AB_1134006
RPMI 1640 培养基Gibco Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 货号# 11875119
丙酮酸钠溶液Sigma-Aldrich Merck，美国密苏里州圣路易斯 货号#  S8636
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红Gibco Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 货号# 25200056
Zombie Violet 可固定活力检测试剂盒BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥货号# 423113

参考文献

  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  2. Goswami, S., Anandhan, S., Raychaudhuri, D., Sharma, P. Myeloid cell-targeted therapies for solid tumours. Nat Rev Immunol. 23 (2), 106-120 (2023).
  3. Christofides, A., et al. The complex role of tumor-infiltrating macrophages. Nat Immunol. 23 (8), 1148-1156 (2022).
  4. Umakoshi, M., et al. Macrophage numbers in the marginal area of sarcomas predict clinical prognosis. Sci Rep. 13 (1), 1290(2023).
  5. Toor, S. M., et al. Myeloid cells in circulation and tumor microenvironment of breast cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (6), 753-764 (2017).
  6. Chen, Y., et al. Targeting tumor-associated macrophages: A potential treatment for solid tumors. J Cell Physiol. 236 (5), 3445-3465 (2021).
  7. Caverzan, M. D., et al. Exploring monocytes-macrophages in immune microenvironment of glioblastoma for the design of novel therapeutic strategies. Brain Sci. 13 (4), 542(2023).
  8. Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).
  9. Linde, N., Gutschalk, C. M., Hoffmann, C., Yilmaz, D., Mueller, M. M. Integrating macrophages into organotypic co-cultures: A 3D in vitro model to study tumor-associated macrophages. PLoS One. 7 (7), e40058(2012).
  10. Karimova, A. F., et al. In vitro functional assays to assess the reciprocal interplay between tumor cells and macrophages. FASEB J. 38 (13), e23730(2024).
  11. Carrera Silva, E. A., Errasti, A. E. Reprograming model of human monocyte-derived macrophages for in-vitro assays. J Vis Exp. (218), e67651(2025).
  12. Colado, A., et al. The kinase inhibitors R406 and GS-9973 impair T cell functions and macrophage-mediated anti-tumor activity of rituximab in chronic lymphocytic leukemia patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (4), 461-473 (2017).
  13. Colado, A., et al. Effect of the BTK inhibitor ibrutinib on macrophage- and gammadelta T cell-mediated response against Mycobacterium tuberculosis. Blood Cancer J. 8 (11), 100(2018).
  14. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  15. Gattas, M. J., et al. A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro. Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).
  16. Risnik, D., et al. Immunoregulatory effects of lurbinectedin in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Immunol Immunother. 69 (5), 813-824 (2020).
  17. Mulder, K., et al. Cross-tissue single-cell landscape of human monocytes and macrophages in health and disease. Immunity. 54 (8), 1883-1900.e5 (2021).
  18. Silvin, A., et al. Dual ontogeny of disease-associated microglia and disease inflammatory macrophages in aging and neurodegeneration. Immunity. 55 (8), 1448-1465.e6 (2022).
  19. Maeda, A., Digifico, E., Andon, F. T., Mantovani, A., Allavena, P. Poly(I:C) stimulation is superior than imiquimod to induce the antitumoral functional profile of tumor-conditioned macrophages. Eur J Immunol. 49 (5), 801-811 (2019).
  20. Ummarino, A., Anfray, C., Maeda, A., Andon, F. T., Allavena, P. In vitro methods to evaluate macrophage polarization and function in cancer. Methods Mol Biol. 2614, 81-91 (2023).
  21. Carestia, A., et al. Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice. Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).
  22. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  23. Ferrer, M. F., et al. Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity. Front Immunol. 10, 2499(2019).
  24. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype. Front Immunol. 14, 1162671(2023).
  25. Dunsmore, G., et al. Timing and location dictate monocyte fate and their transition to tumor-associated macrophages. Sci Immunol. 9 (97), eadk3981(2024).
  26. Wang, X., Chen, J., Jia, G. From dichotomy to diversity: Deciphering the multifaceted roles of tumor-associated macrophages in cancer progression and therapy. Cancer Biol Med. 21 (2), 132-138 (2023).
  27. Hochstadt, J., Martinez Pacheco, S., Casanova-Acebes, M. Embracing diversity: Macrophage complexity in cancer. Trends Cancer. 11 (4), 351-364 (2025).
  28. Xu, J., et al. Dual roles and therapeutic targeting of tumor-associated macrophages in tumor microenvironments. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 268(2025).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

巨噬细胞极化体外建模单核细胞分化条件培养基肿瘤-巨噬细胞相互作用巨噬细胞重编程肿瘤免疫学
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。