本文介绍了一种 体外 通过将人单核细胞暴露于肿瘤细胞系的条件培养基来生成类似肿瘤相关巨噬细胞的实验方案。
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本文介绍了一种 体外 通过将人单核细胞暴露于肿瘤细胞系的条件培养基来生成类似肿瘤相关巨噬细胞的实验方案。
巨噬细胞具有显著的可塑性，能够根据多种环境信号获得不同的功能状态。在实体瘤中，巨噬细胞通常是肿瘤微环境中最丰富的免疫细胞群体，被称为肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）。TAMs 与恶性细胞密切相互作用，积极促进肿瘤进展、血管生成及免疫逃逸。肿瘤细胞可通过直接的细胞间接触以及多种分泌因子对巨噬细胞进行重编程，诱导其极化为促肿瘤表型。为研究这些 TAM 极化机制 体外我们提出一种方法，将人单核细胞暴露于肿瘤细胞系条件培养基中存在的可溶性因子。该方案可在受控条件下生成类似肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的巨噬细胞，便于分析肿瘤来源信号诱导的表型与功能变化。本方法提供了一种可重复且具有生理相关性的模型，用于研究肿瘤细胞与巨噬细胞之间的相互作用，加深对巨噬细胞重编程机制的理解，并支持癌症免疫学与免疫治疗领域中新型治疗策略的研究。
巨噬细胞是具有多种功能的天然免疫细胞，其显著的可塑性使其能够根据环境信号采用不同的表型1。在实体瘤中，巨噬细胞常成为最丰富的免疫细胞群体，并分化为肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）2。这些细胞被肿瘤微环境主动重编程，以支持肿瘤生长、促进血管生成、协助转移，并抑制有效的抗肿瘤免疫应答。肿瘤细胞通过直接的细胞间相互作用以及一系列复杂的分泌因子（包括细胞因子、趋化因子和生长因子）驱动这种极化过程，从而重塑巨噬细胞的转录和功能程序3。这种动态的相互作用构成了TAMs在癌症生物学中的核心作用，同时也凸显了巨噬细胞可塑性在治疗干预中既是挑战也是机遇2。
肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的临床意义正日益受到重视：其在肿瘤中的丰度通常与不良预后及治疗耐药性相关4,5。因此，TAMs6 已成为有前景的治疗靶点。目前正在进行多种策略的研究，旨在阻断其招募、抑制其存活，或将其重编程为促炎性和杀瘤表型6。因此，阐明肿瘤来源因子将巨噬细胞极化为 TAMs 的机制，对于开发有效的免疫疗法至关重要。尽管免疫检查点阻断....
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在符合《赫尔辛基宣言》的要求并获得知情同意后，从健康供者处采集外周血样本。本方案已获得布宜诺斯艾利斯大学机构伦理委员会的批准。有关本方案中使用的所有材料和试剂的详细信息，请参见材料表。
注意：整个实验过程中需保持无菌条件，在生物安全二级（BSL-2）生物安全柜中操作，并确保细胞活力 >90%。所有生物废弃物必须先浸泡于10%次氯酸钠溶液中至少30分钟进行去污处理，然后放入指定的生物危害废弃物容器中处置。
1. 肿瘤细胞系培养及条件培养基制备
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我们通过使用来自 MDA-MB-231 细胞系的 50% 条件培养基（CM）处理单核细胞来源的巨噬细胞，生成了三阴性乳腺癌肿瘤相关巨噬细胞（TAM）样细胞。单核细胞来自六位独立健康供体的外周血单个核细胞（PBMC），并按照我们的方案进行分化。CM 的制备采用处于 90% 汇合度的 MDA-MB-231 细胞图1). 第5天将CM加入巨噬细胞培养物中，第7天收获细胞。 图2 显示了第7天有无CM条件下细胞的形态，其中梭形细胞比例较高表明CM处理组细胞的分化和极化程度增加。通过流式细胞术及一组表面标志物CD206、HLA-DR、CD64和CD163对极化状态进行了明确的定量分析。 图3 展示了对照组（DMEM培养基）与CM处理组之间这些标志物的代表性比较。对全部六名健康供体数据的分析结果（图4)证实该方案具.......
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本文所述方案提供了一种可重复且实用的方法，通过将人单核细胞来源的巨噬细胞暴露于肿瘤细胞系条件培养基中，以研究肿瘤相关巨噬细胞样极化。该系统能够捕捉肿瘤细胞分泌的可溶性因子的影响，这些因子已知在肿瘤微环境中巨噬细胞的重编程过程中发挥关键作用7,9,10,15,19,20。通过将直接的细胞间接触从分析中分离，该方法可专注于研究调节巨噬细胞表型和功能的可溶性组分。
为确保本实验方案的成功与可重复性，必须严格控制多个关键步骤。高活力的CD14+单核细胞的分离至关重要，因为纯度或活力低下会影响分化效率。供体间的差异是导致实验异质性的常见原因，因为不同来源的原代单核细胞在基础活化状态和反应性方面存在差异.......
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作者声明无利益冲突。
我们感谢国家科学技术促进局（ANPCyT-FONCYT）通过以下项目提供的资金支持：PICT 2021 I-INVI-00034（授予 DR）、PICT 2021-I-A-00807（授予 E.A.C.S.）和 PICT 2021-I-A-00716（授予 A.E.E.）。我们还感谢国家科学技术研究委员会（CONICET）为 A.E.E. 提供的 PIP 2022-0763 项目资助，以及布宜诺斯艾利斯大学提供的 PIDAE 2022 项目资助。
M.C.L. 获得了布宜诺斯艾利斯大学医学院 Legado Peruilh 奖学金，并获得了 ANPCyT-FONCYT 博士研究生奖学金。D.R.、E.A.C.S. 和 A.E.E. 是 CONICET 的职业研究员。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 小鼠抗人 CD206 抗体，克隆号 15-2 | BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 货号# 321113；RRID:AB_571874 | |
| Alexa Fluor 647 小鼠抗人 CD64 抗体，克隆号 10.1 | BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 货号# 305012；RRID:AB_528867 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences，美国新泽西州圣何塞 | 货号# 554714 | 固定/透化试剂盒 |
| DMEM 高糖培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基） | Gibco Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号# 11965092 | |
| EasySep 人 CD14 阳性选择试剂盒；EasySep 阳性选择混合液；EasySep 磁性纳米颗粒；EasySep 磁力架 | STEMCELL Technologies，加拿大温哥华 | 货号# 18058 | |
| FACS Canto 流式细胞仪 | Becton Dickinson，美国新泽西州富兰克林湖 | ||
| 胎牛血清，经鉴定，新西兰来源 | Gibco™ Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号# 10091148 | |
| Ficoll-Paque PLUS Cytiva | GE Healthcare - Life Sciences，美国 | 货号# 17144003 | |
| FlowJo | FlowJo LLC. | RRID:SCR_008520 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software Inc. | RRID:SCR_002798 | |
| Partec CyFlow space 流式细胞仪 | Sysmex Partec，德国 | ||
| PE 标记抗人 HLA-DR 抗体，克隆号 L243 | BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 货号# 307605；RRID:AB_314683 | |
| PE/Cy7 标记大鼠抗小鼠/人 CD11b 抗体，克隆号 M1/70 | BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 货号# 101216；RRID:AB_312799 | |
| PerCP/Cy5.5 标记小鼠抗人 CD163 抗体，克隆号 GHI/61 | BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 货号# 333607；RRID:AB_1134006 | |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号# 11875119 | |
| 丙酮酸钠溶液 | Sigma-Aldrich Merck，美国密苏里州圣路易斯 | 货号# S8636 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红 | Gibco Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号# 25200056 | |
| Zombie Violet 可固定活力检测试剂盒 | BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 货号# 423113 |
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