快速磁微珠法高效纯化低密度中性粒细胞

Summary

低密度中性粒细胞 （LDN） 在多种疾病中显着增加。LDN 通常通过细胞分选分离。我们提出了一种获得纯净且可行的LDN的实用方法。外周血密度梯度离心后，将细胞与磁性微珠一起孵育，然后通过磁柱分离LDN。

Abstract

中性粒细胞是先天免疫的重要白细胞，传统上被认为是同质细胞群。然而，最近的证据表明中性粒细胞存在于几个亚群中。低密度中性粒细胞 （LDN） 就是这样的亚群之一。LDN 在健康个体的血液中含量很少，但在系统性红斑狼疮、自身免疫性疾病、癌症和感染等疾病中，其数量显着增加。在这些情况下，LDN 可能参与疾病的发病机制。分离LDN的唯一方法是通过外周血的密度梯度离心。然而，离心后，LDN与单核细胞共纯化。因此，研究这种中性粒细胞亚群具有挑战性。没有将 LDN 与单核细胞分离的标准方法。通常，LDN 通过流式细胞仪中的细胞分选来分离。然而，这种方法需要较长的分选时间（小时）才能获得足够的纯细胞以进行进一步的功能研究。这严重影响了细胞的活力和功能。在这里，我们提出了一种在短时间内获得大量纯净且可行的LDN的实用方法。密度梯度离心后，将单核细胞组分与抗CD66b磁性微珠一起孵育，然后在<30分钟内通过磁柱分离LDN。纯化的LDN（CD66b⁺ 细胞）用针对CD10，CD11b，CD14，CD15，CD16b，CD33，CD62L，CD66b和CD98的单克隆抗体标记，并通过流式细胞术进行分析以进行确认。纯化的LDN具有完全的功能性，其产生活性氧和形成中性粒细胞细胞外陷阱的能力表明了这一点。这种新的纯化方法可在短时间内产生高纯度（超过 90%）和活力（超过 96%）的 LDN。该方法可以很容易地放大以获得大量纯LDN，通过生化或其他组学分析来评估不同疾病中的LDN功能。

Introduction

中性粒细胞是人类血液中的主要白细胞¹，是先天免疫系统的关键参与者。它们大量到达有炎症或感染的组织².在那里，中性粒细胞激活多种效应功能，例如吞噬作用^3,4，^脱颗粒^5,6和中性粒细胞细胞外陷阱（^NET）的形成7。此外，中性粒细胞还参与适应性免疫反应⁸。中性粒细胞的经典观点认为它们是在骨髓中产生的具有预定反应的均质细胞^9,10。然而，最近的研究表明，中性粒细胞是异质细胞，在健康和疾病状态下具有多种表型和功能状态 11,12,13,14,15。

在几个中性粒细胞亚群中，低密度中性粒细胞（LDN）因其内在特性以及它们在多种疾病中的数量增加而引起了人们的极大兴趣16,17,18。1986 年，在系统性红斑狼疮 （SLE） 患者的血液中发现了 LDN¹⁹。它们是在密度梯度^20,21分离白细胞的过程之后检测到的。在密度培养基（例如 Ficoll-Paque）上离心血液或富含白细胞的血浆后，单核细胞和淋巴细胞（称为外周血单核细胞 [PBMC]）在管的上部（低密度）部分形成一条带。中性粒细胞沉淀在管底部。在PBMC中，还发现了一些中性粒细胞;它们是LDN（图1）。健康个体的血液中存在少量 LDN²².然而，LDN 数量在多种免疫抑制和慢性炎症条件下显着增加，包括 SLE^23,24、败血症²⁵、牛皮癣²⁶、哮喘²⁷、幼年特发性关节炎²⁸、抗中性粒细胞胞浆抗体 （ANCA） 相关血管炎²⁹、HIV 感染³⁰、疟疾³¹ 和结核病³².尽管所有提到的病理中的 LDN 数量都有所增加，但 LDN 主要在 SLE¹⁷ 的背景下进行研究。SLE 患者血液中的 LDN 似乎具有更强的形成 NET^{的能力 33}、分泌大量促炎介质³⁴ 和激活 T 细胞²⁴。然而，据报道，在其他情况下，例如癌症，LDN由成熟和未成熟的中性粒细胞³⁵组成，具有T细胞抑制特性36,37,38。同样，在 COVID-19 患者中，据报道 LDN 也会抑制 T 细胞增殖³⁹，但与 SLE 相反，LDN 似乎产生的 NET^{较少 39}。因此，LDN的起源、组成和功能特性仍存在争议。

由于 LDN 与 PBMC 一起发现，因此研究它们在技术上很复杂。为了充分探索不同病理中的 LDN 特性，有必要对其进行纯化。LDN分离的常见程序是荧光细胞分选22,40,41,42,43,44,45。然而，细胞分选需要很长时间才能分离细胞。如果分选时间不够，这可能会导致细胞丢失或回收率低。此外，细胞承受过大的压力，在研究这些细胞的功能时导致不同的结果。分拣时间长也增加了实验程序的成本，需要专业人员。

在这里，我们提出了一种在很短的时间内获得大量纯且有活力的人 LDN 的快速有效的方法。密度梯度离心后，LDN通过磁细胞分选（MACS; 图 1）。这种纯化方法的主要优点是LDN的分离纯度高（90%以上）和活力（96%以上）。此外，纯化的LDN具有完全的功能，如其产生活性氧（ROS）和释放NET的能力所示。该协议可以在任何对中性粒细胞生物学感兴趣的实验室中轻松实施，以快速从患有多种疾病的人的血液中分离LDN，以便进一步研究这些细胞。

Protocol

本协议中的所有程序均遵循墨西哥国立自治大学 （UNAM） 生物医学研究所人类研究生物伦理委员会的指导方针。所有参与者都提供了知情同意书。

1. 从人血液中分离外周血单核细胞 （PBMC） 和中性粒细胞

1. 通过静脉穿刺从健康的成年志愿者那里获取约 10 mL 血液。添加 10 U/mL 肝素作为抗凝剂。
   注意：将针头丢弃到生物危害针头处理容器中。注射器和其他与血液接触的材料应放入袋子中并在处理前进行高压灭菌。
2. 在15mL锥形离心管中，在PBS中加入2mL的6%葡聚糖T500。然后通过将 10 mL 血液从管侧排出来添加。将管子倒置几次以混合血液和葡聚糖。
3. 让试管静置 45 分钟，同时红细胞沉淀。富含白细胞的血浆出现在红细胞层上方。
4. 在另一个 15 mL 离心管中，加入 5 mL 密度梯度培养基。小心地移液血浆，不要接触红细胞，并将其分层在培养基上。必须形成两个独立的阶段。
5. 将试管在 4°C 下以 516 x g 离心 20 分钟。 单核细胞 （PBMC） 在血浆层和培养基层之间形成一条带。中性粒细胞在底部形成沉淀（图1）。
6. PBMC的分离
   1. 通过抽吸消除PBMC顶部的血浆，而不接触细胞。从血浆和培养基之间的条带中收集细胞。确保吸出尽可能少的培养基。
   2. 将细胞放入 50 mL 锥形离心管中。加入 20 mL PBS。将试管在4°C下以400 x g 离心5分钟。
   3. 小心地吸出上清液并刮擦管子以分离细胞。加入 10 mL 冷 PBS 以重悬细胞。使用 Neubauer 室计算 PBMC。
      注意：请勿使用移液器重悬细胞，因为这可能会损坏细胞。
7. 中性粒细胞的分离
   1. 去除密度梯度介质。通过刮擦管分离细胞并加入 10 mL 冷 PBS。
   2. 将细胞放入新鲜的 50 mL 离心管中，并在 4°C 下以 400 x g 离心 5 分钟。 吸出上清液并分离细胞，如步骤1.6.3中所述。
8. 为了消除残留的红细胞，加入 10 mL 冷低渗溶液（0.2% NaCl，1% BSA，20 mM Hepes，pH = 7.4），并轻轻混合 1 分钟。
9. 快速加入10mL冷高渗溶液（1.6%NaCl，1%BSA，20mM HEPES，pH = 7.4）使溶液等渗。
10. 使用Neubauer室（纯度>95%）计数中性粒细胞。如步骤1.6.2中通过离心沉淀细胞。并将它们重悬于冷PBS中。将管子放在冰上。
    注意：据报道，中性粒细胞在体外的半衰期为8-12小时46,47,48。根据我们使用该方案的经验，中性粒细胞维持其功能约 6 至 8 小时。

2. 低密度中性粒细胞（LDN）的纯化

1. 在4°C下以400 x g 离心PBMC5分钟。 除去上清液并将细胞重悬于 120 μL 冷洗缓冲液（PBS 中的 1% BSA）中。
2. 加入 35 μL CD66b 磁性微珠。将混合物在4°C的黑暗中孵育30分钟。每 10 分钟轻轻混合一次，以防止细胞聚集。
3. 加入 1 mL 冷洗缓冲液。将细胞放入微量离心机中，以 400 x g 旋转 3 分钟。
4. 除去上清液，通过刮管分离细胞沉淀，并将细胞重悬于 1 mL 洗涤缓冲液中。
5. 将磁分离柱放在磁铁上。向色谱柱中加入 0.5 mL 洗涤缓冲液，让它通过色谱柱。
6. 将细胞 （1 mL） 转移到色谱柱上。让缓冲液一滴一滴地穿过色谱柱。
7. 将 0.5 mL 洗涤缓冲液加入色谱柱中，让其通过。将另外 0.5 mL 洗涤缓冲液加入色谱柱中。
8. 从磁铁上取下色谱柱并将其放入微量离心管中。向色谱柱中加入 1 mL 洗涤缓冲液。
9. 将柱塞插入色谱柱顶部，轻轻施加压力以洗脱细胞。取下柱塞，将色谱柱放在新的微量离心管顶部。
10. 再加入 1 mL 洗涤缓冲液。将柱塞插入色谱柱顶部，轻轻施加压力以洗脱细胞。
11. 将两个试管放入微量离心机中，并以 800 x g 旋转 3 分钟。最后，将两个管中的细胞（LDN）重悬于1mL冷PBS中。保持冰上。
    注意：前 2 mL 流通包含其余的 PBMC。这些细胞可用于其他研究。

3. 多色流式细胞术

1. 将纯化的细胞以 1 x 10⁶ 细胞/mL 重悬于标记缓冲液（PBS 中的 1% FBS）中。将 250 μL 细胞加入 1.5 mL 微量离心管中。
2. 添加相应的中性粒细胞膜分子抗体（有关详细信息，请参阅 材料表）。将细胞在4°C下孵育30分钟，保护它们免受光照。
3. 加入 1 mL PBS。将试管放入微量离心机中，以 800 x g 旋转 3 分钟。
4. 吸出上清液，通过敲击管子打破细胞沉淀，并将细胞重悬于 0.5 mL 1% 多聚甲醛中。
5. 将细胞保持在4°C避光，直到通过流式细胞术进行分析。通过流式细胞术分析细胞，每个样品捕获 10,000 个事件。如前所述进行细胞分选²².
   注意：多聚甲醛对皮肤和呼吸道有刺激性。确保你没有吸入蒸气。

4. 活性氧（ROS）的检测

1. 在 1.5 mL 微量离心管中，加入 2.5 x 10⁵ 个细胞。将试管放入微量离心机中，以800× g 旋转3分钟。
2. 吸出上清液，刮管分离细胞，并将细胞重悬于PBS中的100μL 15μM二氢罗丹明123中。
3. 将避光细胞在37°C下孵育20分钟。加入 1 mL PBS。
4. 将试管放入微量离心机中，以800× g 旋转3分钟。吸出上清液，刮管以分离细胞，并将它们重悬于 PBS 中的 100 μL 50 nM 佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯 （PMA） 中。
5. 将避光细胞在37°C下孵育45分钟。加入 1 mL PBS。
6. 将试管放入微量离心机中，以 800 x g 旋转 3 分钟。吸出上清液，刮管分离细胞，并将它们重悬于 PBS 中的 0.5 mL 1% 多聚甲醛中。
7. 将细胞保持在4°C避光，直到通过流式细胞术进行分析。通过流式细胞术分析细胞，每个样品捕获 10,000 个事件。

5. 中性粒细胞细胞外陷阱 （NET） 的可视化

1. 将盖玻片放入 12 孔板的孔中，并用 10 μg/mL 聚-L-赖氨酸覆盖。将板在4°C下轻轻搅拌孵育过夜。
2. 除去聚-L-赖氨酸，并用PBS洗涤盖玻片，在室温下轻轻搅拌将板孵育5分钟。用 PBS 再清洗盖玻片两次。
3. 取出PBS，将板放入层流罩内2小时，让盖玻片干燥。
4. 将 LDN 以 1 x 10⁶ 细胞/mL 重悬于含有 5% FBS 的 RPMI-1640 培养基中。取 350 μL（3.5 x 10⁵ 个细胞）细胞悬液，并将它们放入含有盖玻片的 12 孔板的孔中。
5. 将板在37°C的5%CO₂ 培养箱中保持30分钟。 向每个孔中加入 3.5 μL 用 PBS 稀释的 5 μM PMA（PMA 的终浓度为 50 nM）。
6. 将板在37°C的5%CO₂ 培养箱中保持4小时。 在PBS中加入350μL8%多聚甲醛，并将板在37°C的5%CO₂ 培养箱中过夜。
7. 如前所述⁴⁹，在试管架上放置透明薄膜，以便在管孔上形成孔。
8. 用各种溶液填充每个孔，以清洗或染色盖玻片，形成大液滴。取下盖玻片，将它们倒置在一滴水上 5 分钟。以同样的方式，用水再清洗盖玻片三次。
9. 将盖玻片倒置在一滴封闭缓冲液（PBS 中的 5% BSA）上，并在室温下孵育 20 分钟。
10. 将盖玻片转移到封闭缓冲液中的一滴相应一抗（例如，抗弹性蛋白酶或抗瓜氨酸）中，并在室温下孵育 60 分钟。
11. 在 PBS 中的 0.01% 吐温-20 中洗涤盖玻片 2 次。将盖玻片转移到含有 150 nM DAPI 的封闭缓冲液中的一滴相应二抗中，并在室温下避光孵育 60 分钟。
12. 在 PBS 中的 0.01% 吐温-20 中洗涤盖玻片 2 次。将一滴抗淬灭封片介质滴在载玻片上，然后将盖玻片倒置。
13. 用指甲油密封周边的盖玻片。将安装的载玻片储存在 4 °C 下，避光。使用荧光显微镜可视化 NET。

6. 检测中性粒细胞细胞外陷阱 （NET）

1. 将细胞以 5 x 10⁵ 细胞/mL 重悬于 500 nM Sytox Green 中，在用 5% FBS 稀释的 RPMI-1640 培养基中。
2. 取 100 μL（5 x 10⁴ 个细胞）细胞悬液，并将它们放入 96 孔组织培养板的孔中。
3. 将板在37°C的5%CO₂ 培养箱中保持20分钟。 向每个孔中加入20μL在RPMI-1640培养基中稀释的300nM PMA（PMA的终浓度为50nM）。
4. 将板转移到预热的酶标仪上。将板在35°C下孵育4小时，每5分钟从板底部进行荧光测量（使用485nm激发和528nm发射滤光片）。

Results

健康个体中的低密度中性粒细胞（LDN）约占PBMC的5%（图2A）。此处描述的协议通常提供纯 （> 90%） LDN。细胞还可以高效回收（产量约为 98%），活力高（> 95%;图2B）。为了进行比较，LDN也通过荧光激活细胞分选纯化，如前所述²²。简而言之，PBMC用抗CD16b抗体标记，并在荧光激活细胞分选仪中进行分选。将LDN分选3小时，并在热灭活FBS中回收（图2）。磁性 （MACS） 纯化的 LDN 是显示与中性粒细胞相似的膜分子（标记物）的成熟细胞。中性粒细胞表达膜标志物CD10，CD11b，CD15，CD62L和CD66b（图3A）。类似地，通过磁分离纯化的LDN对相同分子的表达呈阳性（图3B）。中性粒细...

Discussion

一般来说，中性粒细胞被认为是同质细胞。然而，最近的证据表明，中性粒细胞可以作为具有不同激活状态和/或多种表型的细胞存在。因此，可能存在各种中性粒细胞亚群 13,14,15。中性粒细胞亚群，即低密度中性粒细胞（LDN），由于其特殊的内在特性以及它们在多种疾病中增加而引起了极大的兴趣16,17,18。LDN 与 PBMC²² 一起从血液中分离出来。因此，研究它们在技术上很复杂。为了充分探索不同病理中的LDN特性，有必要对其进行纯化。现在，我们描述了一种简单、快速和高效的方案，用于获得大量纯净和可行的LDN。密度梯度离心后，LDN通过磁性细胞分选分离。

...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗瓜氨酸兔多克隆抗体	AbCam	AB100932	1/50稀释
96孔组织培养板	《Costar》;康宁公司	3596
Alexa Fluor 488抗人类CD11b小鼠IgG1抗体	生物传说	301317	0.25 & mu;克/毫升
Alexa Fluor 647 抗人类CD66b小鼠IgM抗体	生物传说	305109	0.05 & mu;克/毫升
抗小鼠IgG（H+L）山羊抗体，Alexa Fluor 488	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-11001	1/50稀释
抗中性粒细胞弹性蛋白酶小鼠单克隆IgG1抗体	圣克鲁斯生物技术	SC-55549	10 & micro;克/毫升
抗兔IgG（H+L）驴抗体，Alexa Fluor 555	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-31572	1/50稀释
APC抗人类CD62L小鼠IgG1抗体	生物传说	304809	0.03 & mu;克/毫升
APC/Cyanine7抗人类CD14小鼠IgG1抗体	生物传说	367107	0.25 & mu;克/毫升
Attune NxT 流式细胞仪	赛莫飞世尔科学公司	（蓝/红激光）
牛血清白蛋白（BSA）第五组分	MP生物医学	810025
Brilliant Violet 510 抗人类CD33小鼠IgG1抗体	生物传说	366609	0.30 & mu;克/毫升
达皮	Calbiochem/EMD Milllipore	268298
Dextran T500	Pharmacosmos空调	5.51005E+11
二氢罗达胺-123	Anaspec公司	AS-85711
FACS单元分选机	贝克顿·迪金森	FACSAria模型
胎儿牛血清（FBS）	吉布科	16000-044
菲科尔-帕克	默克集团	GE 17-1440-03
FITC 抗人类CD98小鼠IgG1抗体	生物传说	315603	0.30 & mu;克/毫升
FlowJo 软件	贝克顿·迪金森	版本10,2019年
荧光倒置显微镜	奥林匹斯	IX-70型
肝素	Inhepar - PiSA Farmaceutica	3660149	5000 UI/mL
赫佩斯	西格玛·奥尔德里奇	H7006
MACSprep 嵌合体 CD66b 微珠	米尔滕尼生物技术	130-111-552
磁铁	米尔滕尼生物技术	130-042-102
磁分离柱	米尔滕尼生物技术	130-042-201
微离心机	埃彭多夫	5415C型
微板读器	生物泰克仪器	模型协同 HT
对甲醛	西格玛·奥尔德里奇	158127
PE抗人类CD10小鼠IgG1抗体	生物传说	312203	0.05 & mu;克/毫升
PE抗人类CD16b小鼠IgG2a抗体	BD 法明根	550868	1/40稀释
PE/Cyanine5抗人类CD15小鼠IgG1抗体	生物传说	323013	0.25 & mu;克/毫升
福博尔12-肉桂酸酯13-醋酸酯（PMA）	西格玛·奥尔德里奇	P8139
聚L-赖氨酸	西格玛·奥尔德里奇	P2658
冷藏离心机	埃彭多夫	5702R型号
RPMI-1640组织培养基	吉布科	23400-021
赛托克斯·格林	分子探针公司	S-7020
Tween-20	西格玛·奥尔德里奇	P2287
维克塔盾	向量实验室	H-1000