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方法文章

快速磁珠法高效纯化低密度中性粒细胞

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DOI：

10.3791/69407

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2025年11月11日

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México

本文内容

摘要

低密度中性粒细胞（LDN）在多种疾病中显著增加。通常通过细胞分选来分离LDN。本文介绍一种获取高纯度且具有活性的LDN的实用方法。外周血经密度梯度离心后，细胞与磁性微珠孵育，随后通过磁性柱分离LDN。

摘要

中性粒细胞是先天免疫系统中重要的白细胞，传统上被认为是一个同质的细胞群体。然而，近期证据表明，中性粒细胞存在多个亚群。其中一种亚群为低密度中性粒细胞（LDN）。LDN 是 在健康个体的血液中数量较少，但其 数量在系统性红斑狼疮、自身免疫性疾病、癌症和感染等疾病中显著增加。在这些情况下，低密度中性粒细胞（LDN）可能参与疾病的发病机制。分离LDN的唯一方法是通过外周血密度梯度离心。然而，离心后，LDN会共同纯化 与单个核细胞混杂，因此研究这一中性粒细胞亚群具有挑战性。目前尚无标准方法用于将低密度中性粒细胞（LDN）与单个核细胞分离。通常，LDN 通过流式细胞仪进行细胞分选来分离。然而，该方法需要较长的分选时间（数小时），才能获得足够数量的高纯度细胞用于后续功能研究，这会严重影响细胞的活力和功能。本文提出一种快速获取大量高纯度且具活性的低密度中性粒细胞（LDN）的实用方法。在密度梯度离心后，单个核细胞组分与抗-CD66b磁性微珠孵育，随后通过磁性柱分离LDN < 30 分钟。纯化的低密度中性粒细胞（CD66b+ 细胞使用针对 CD10、CD11b、CD14、CD15、CD16b、CD33、CD62L、CD66b 和 CD98 的单克隆抗体进行标记，并通过流式细胞术分析以确认。纯化的低密度中性粒细胞（LDN） 具有完全功能，表现为能够产生活性氧并形成中性粒细胞胞外诱捕网。该新纯化方法可在短时间内获得高纯度（超过90%）和高活性（超过96%）的低密度中性粒细胞。该方法易于扩增，可大量获取高纯度低密度中性粒细胞，用于通过生物化学或其他组学分析评估其在不同疾病中的功能。

引言

中性粒细胞是人体血液中最主要的白细胞1，在先天免疫系统中发挥关键作用。在发生炎症或感染的组织中，大量中性粒细胞会迁移至该部位2。在这些部位，中性粒细胞可激活多种效应功能，例如吞噬作用3,4、脱颗粒5,6以及形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）7。此外，中性粒细胞也参与适应性免疫应答8。传统观点认为中性粒细胞是一类在骨髓中生成、具有预设反应模式的同质性细胞9,10。然而，近期研究表明，在健康状态和疾病状态下，中性粒细胞均为具有多种表型和功能状态的异质性细胞11,12,13,14,15。

在多种中性粒细胞亚群中，低密度中性粒细胞（LDN）因其内在特性以及在多种疾病中数量增加而受到广泛关注16,17,181986年，在系统性红斑狼疮（SLE）患者的血液中发现了LDN19通过密度梯度分离白细胞的步骤进行检测20,21离心血液或富含白细胞的血浆与密度介质（如 Ficoll-Paque）后，单核细胞和淋巴细胞（称为外周血单个核细胞 [PBMC]）会形成一条带状层，位于试管上部（低密度区域），而中性粒细胞则沉降于试管底部。在 PBMC 层中亦可发现少量中性粒细胞，这些即为低密度中性粒细胞（LDN）图1健康个体血液中含有少量低密度中性粒细胞（LDN）22然而，在多种免疫抑制和慢性炎症情况下，LDN数量会显著增加，包括系统性红斑狼疮（SLE）23,24，脓毒症25，银屑病26哮喘27幼年特发性关节炎28抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA）相关性血管炎29，HIV感染30疟疾31 和结核病32尽管在所有上述病理情况下LDN数量均有所增加，LDN 主要在系统性红斑狼疮（SLE）的背景下被研究17系统性红斑狼疮（SLE）患者血液中的低密度中性粒细胞（LDN）似乎具有更强的形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的能力33，以分泌大量促炎介质34以及激活T细胞24然而，在其他情况下，例如癌症，LDN 据报道由成熟和未成熟的中性粒细胞组成35，具有T细胞抑制特性36,37,38同样，在 COVID-19 患者中，LDN 也被报道可抑制T细胞增殖39，但与系统性红斑狼疮（SLE）相反，低密度中性粒细胞（LDN）似乎产生的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）较少39因此，低密度中性粒细胞的来源、组成及其功能特性仍存在争议。

由于低密度中性粒细胞（LDN）与外周血单个核细胞（PBMC）共存，对其进行研究在技术上较为复杂。为了全面探究LDN在不同病理状态下的特性，有必要对其进行纯化。分离LDN的常用方法是荧光细胞分选22,40,41,42,43,44,45。然而，细胞分选需要较长的分离时间。如果分选时间不足，可能导致细胞丢失或回收率低。此外，细胞会经历过度的应激，从而在研究这些细胞功能时产生可变的结果。较长的分选时间还会增加实验操作的成本，并需要专业人员操作。

在此，我们介绍一种快速高效的方法，可在极短时间内获得大量纯度高且具有活性的人类LDN。经过密度梯度离心后，LDN 通过磁性细胞分选（MACS； 图1）。该纯化方法的主要优势在于LDN 以高纯度（超过90%）和高活性（超过96%）分离。此外，纯化的LDN 功能完全正常，如其表现所示 产生活性氧（ROS）以及释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的能力。该方案可被任何关注中性粒细胞生物学的实验室快速采用，以从多种疾病患者的血液中分离低密度中性粒细胞（LDN），进而对这些细胞进行深入研究。

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方案

本方案中的所有操作均遵循墨西哥国立自治大学（UNAM）生物医学研究机构人类研究生物伦理委员会的指南。所有参与者均签署了知情同意书。

1. 从人血液中分离外周血单个核细胞（PBMC）和中性粒细胞

  1. 从健康成年志愿者体内通过静脉穿刺采集约10 mL血液，加入10 U/mL肝素作为抗凝剂。
    ​警告：将针头弃置于生物危害针头废弃容器中。接触过血液的注射器及其他材料应装入专用袋中，经高压灭菌后方可处理。
  2. 在15 mL圆锥形离心管中，加入2 mL含6%葡聚糖T500的PBS溶液。然后沿管壁缓慢加入10 mL血液。轻轻倒置管子数次，以混匀血液与葡聚糖溶液。
  3. 将试管静置45分钟，使红细胞沉降。富含白细胞的血浆层将出现在红细胞层上方。
  4. 在另一个15 mL离心管中，加入5 mL密度梯度介质。小心吸取血浆，避免接触红细胞，将其缓慢铺加在介质上方。应形成两个分离的液相。
  5. 将试管在 516 x g 4 °C 下离心 20 分钟。单个核细胞（PBMC）位于血浆层与介质层之间形成一条带状层。中性粒细胞则在底部形成沉淀。图1).
  6. 外周血单个核细胞的分离
    1. 吸除位于PBMC上层的血浆，注意不要触碰细胞层。从血浆与培养基之间的条带中收集细胞，确保尽可能少地吸除培养基。
    2. 将细胞放入一个50 mL锥形离心管中。加入20 mL PBS。以400 x g离心该管 g 4 °C下离心5分钟。
    3. 小心吸除上清液，并刮擦管壁以分离细胞。加入10 mL冷的PBS重悬细胞。使用血细胞计数板对PBMC进行计数。
      注意：不要使用移液器重悬细胞，因为这可能会损伤细胞。
  7. 中性粒细胞的分离
    1. 移除密度梯度介质。用刮棒刮下细胞，加入10 mL冷的PBS。
    2. 将细胞转入一个新的50 mL离心管中，于400 x g离心 g 4 °C下离心5分钟。吸除上清液，并按照步骤1.6.3所述分离细胞。
  8. 为去除残留的红细胞，加入10 mL冷的低渗溶液（0.2% NaCl，1% BSA，20 mM Hepes，pH = 7.4），轻轻混匀， precisely 混合1分钟。
  9. 迅速加入10 mL冷的高渗溶液（1.6% NaCl，1% BSA，20 mM HEPES，pH = 7.4），使溶液变为等渗。
  10. 使用血细胞计数板对中性粒细胞进行计数（纯度 > 95%）。按照步骤1.6.2的方法离心收集细胞，用预冷的PBS重悬细胞，将离心管置于冰上保存。
    注意：据报道，中性粒细胞的半衰期 体外 8 - 12 小时46,47,48根据我们对该方案的经验，中性粒细胞的功能可维持约6至8小时。

2. 低密度中性粒细胞（LDN）的纯化

  1. 在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 PBMC 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 120 µL 冷洗涤缓冲液（含 1% BSA 的 PBS）中。
  2. 加入 35 µL CD66b 磁性微珠。在 4 °C 黑暗条件下孵育 30 分钟，每 10 分钟轻柔混匀一次，以防止细胞聚集。
  3. 加入 1 mL 冷洗涤缓冲液。将细胞置于微量离心机中，以 400 × g 离心 3 分钟。
  4. 弃去上清液，通过轻刮管壁分离细胞沉淀，并将细胞重悬于 1 mL 洗涤缓冲液中。
  5. 将磁性分离柱置于磁铁上。向柱中加入 0.5 mL 洗涤缓冲液，使其自然流过柱体。
  6. 将细胞（1 mL）转移至柱中，让缓冲液逐滴流过柱体。
  7. 向柱中加入 0.5 mL 洗涤缓冲液，使其流过柱体。再向柱中加入另外 0.5 mL 洗涤缓冲液。
  8. 将柱子从磁铁上取下，放入一个微量离心管中。向柱中加入 1 mL 洗涤缓冲液。
  9. 将推杆插入柱子顶部，轻轻施加压力以洗脱细胞。取出推杆，将柱子置于一个新的微量离心管上方。
  10. 再加入 1 mL 洗涤缓冲液。将推杆插入柱子顶部，轻轻施加压力以洗脱细胞。
  11. 将两个离心管放入微量离心机，以 800 × g 离心 3 分钟。最后，将两个管中的细胞（LDN）重悬于 1 mL 冷 PBS 中，并置于冰上保存。
    注意：前 2 mL 流穿液中含有剩余的 PBMC，这些细胞可用于其他研究。

3. 多色流式细胞术

  1. 用标记缓冲液（含1% FBS的PBS）将纯化的细胞重悬至1 × 106 个细胞/mL。取250 µL细胞悬液加入1.5 mL微量离心管中。
  2. 加入针对中性粒细胞膜分子的相应抗体（详见材料表）。4 °C避光孵育30分钟。
  3. 加入1 mL PBS。将离心管放入微量离心机，以800 × g 离心3分钟。
  4. 吸除上清液，轻敲管壁使细胞沉淀重悬，再将细胞重悬于0.5 mL的1%多聚甲醛中。
  5. 4 °C避光保存细胞，直至进行流式细胞术分析。进行流式细胞术分析时，每样本采集10,000个事件。细胞分选操作按先前所述方法进行22。
    注意：多聚甲醛对皮肤和呼吸道具有刺激性，切勿吸入其蒸气。

4. 活性氧（ROS）的检测

  1. 在1.5 mL微量离心管中加入2.5 × 105个细胞。将离心管放入微量离心机，以800 × g离心3分钟。
  2. 吸除上清液，刮擦管壁以分散细胞，然后将细胞重悬于100 µL含15 µM二氢罗丹明123的PBS溶液中。
  3. 在37 °C避光孵育20分钟。加入1 mL PBS。
  4. 将离心管放入微量离心机，以800 × g离心3分钟。吸除上清液，刮擦管壁以分散细胞，然后将细胞重悬于100 µL含50 nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）的PBS溶液中。
  5. 在37 °C避光孵育45分钟。加入1 mL PBS。
  6. 将离心管放入微量离心机，以800 × g离心3分钟。吸除上清液，刮擦管壁以分散细胞，然后将细胞重悬于0.5 mL含1%多聚甲醛的PBS溶液中。
  7. 将细胞置于4 °C避光保存，直至进行流式细胞术分析。通过流式细胞术分析细胞，每样本采集10,000个事件。

5. 中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的可视化

  1. 将盖玻片放入12孔板的孔中，并加入10 µg/mL多聚-L-赖氨酸覆盖。在4 °C下轻轻振荡孵育过夜。
  2. 去除多聚-L-赖氨酸，用PBS洗涤盖玻片，在室温下轻轻振荡孵育5分钟。再用PBS洗涤盖玻片两次。
  3. 去除PBS，将12孔板置于超净工作台内干燥2小时。
  4. 在含5% FBS的RPMI-1640培养基中重悬LDN，使其浓度为1 × 106 个细胞/mL。取350 µL细胞悬液（含3.5 × 105 个细胞）加入含盖玻片的12孔板孔中。
  5. 将12孔板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育30分钟。向每孔加入3.5 µL用PBS稀释的5 µM PMA（PMA终浓度为50 nM）。
  6. 将12孔板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育4小时。向每孔加入350 µL含8%多聚甲醛的PBS溶液，并在37 °C、5% CO2培养箱中继续孵育过夜。
  7. 如前所述49，将透明薄膜覆盖在试管架上，使管孔处形成小室。
  8. 在各小室中加入不同的溶液以洗涤或染色盖玻片，形成较大的液滴。取出盖玻片，倒置在水滴上孵育5分钟。以同样方式再用清水洗涤盖玻片三次。
  9. 将盖玻片倒置在封闭缓冲液（含5% BSA的PBS）液滴上，在室温下孵育20分钟。
  10. 将盖玻片转移至含相应一抗（如抗弹性蛋白酶抗体或抗瓜氨酸化蛋白抗体）的封闭缓冲液液滴中，在室温下孵育60分钟。
  11. 用含0.01% Tween-20的PBS洗涤盖玻片两次。将盖玻片转移至含相应二抗及150 nM DAPI的封闭缓冲液液滴中，在避光条件下室温孵育60分钟。
  12. 用含0.01% Tween-20的PBS洗涤盖玻片两次。在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭封片剂，将盖玻片倒置覆盖其上。
  13. 用指甲油沿盖玻片边缘密封。将封片后的载玻片置于4 °C避光保存。使用荧光显微镜观察中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。

6. 中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的检测

  1. 用含5% FBS的RPMI-1640培养基将细胞重悬至5 × 105 个细胞/mL，并加入500 nM Sytox Green。
  2. 取100 µL细胞悬液（含5 × 104 个细胞）加入96孔组织培养板的孔中。
  3. 将培养板置于37 °C、5% CO2 培养箱中孵育20分钟，然后每孔加入20 µL用RPMI-1640培养基稀释的300 nM PMA （PMA的终浓度为50 nM）。
  4. 将培养板转移至预热的酶标仪中，在35 °C孵育4小时，每隔5分钟从培养板底部检测一次荧光信号（激发波长485 nm，发射波长528 nm）。

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结果

健康个体中的低密度中性粒细胞（LDN）约占外周血单个核细胞（PBMC）的5%（图2A）。本方案通常可获得纯度高（> 90%）的LDN。细胞回收效率也较高（回收率约98%），且细胞活力良好（> 95%；图2B）。作为对照，LDN也通过荧光激活细胞分选法进行纯化，方法如前所述22。简言之，使用抗CD16b抗体标记PBMC，并在荧光激活细胞分选仪中进行分选。LDN分选持续3小时，并回收至热灭活的胎牛血清（FBS）中（图2）。通过磁珠分选法（MACS）纯化的LDN为成熟细胞，其膜分子（标志物）表达谱与中性粒细胞相似。中性粒细胞表达膜标志物CD10、CD11b、CD15、CD62L和CD66b（图3A）。同样，经磁珠分离纯化的LDN也表达上述相同分子（

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讨论

传统上，中性粒细胞被认为是一类同质性的细胞。然而，近年来的研究证据表明，中性粒细胞可能以不同的活化状态和/或多种表型的形式存在。因此，可能存在多种中性粒细胞亚群13,14,15。其中一类中性粒细胞亚群——低密度中性粒细胞（LDN），因其特有的内在特性以及在多种疾病中数量增加的现象而受到广泛关注16,17,18。LDN 与外周血单个核细胞（PBMC）共同从血液中分离获得22，因此对其研究在技术上较为复杂。为了全面探究 LDN 在不同病理状态下的特性，有必要对其进行纯化。本文描述了一种简便、快速且高效的方案，可用于获得大量纯度高且具有活性的 LDN。经过密度梯度离心后，采用磁性细胞分选法对 LDN 进行分离。

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披露

作者声明本研究的实施过程中不存在任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系。

致谢

作者感谢墨西哥国立自治大学生物医学研究所（Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM）的 César Díaz-Godínez 在使用荧光显微镜观察中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）方面提供的帮助。本研究得到了墨西哥国立自治大学学术人事总署（Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México, UNAM）资助项目 PAPIIT IN205523 以及墨西哥科学、人文、技术与创新秘书处（Secretaría de Ciencias, Humanidades, Tecnología e Inovación, Secihti）资助项目 CF-2023-I-610 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
 抗瓜氨酸化蛋白兔多克隆抗体AbCamab1009321/50 稀释
96孔组织培养板Costar; Corning, Inc.3596
Alexa Fluor 488 标记抗人 CD11b 小鼠 IgG1 抗体BioLegend3013170.25 μg/mL
Alexa Fluor 647 标记抗人 CD66b 小鼠 IgM 抗体BioLegend3051090.05 μg/mL
抗小鼠 IgG (H+L) 山羊抗体，Alexa Fluor 488 标记Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-110011/50 稀释
抗中性粒细胞弹性蛋白酶小鼠单克隆 IgG1 抗体Santa Cruz Biotechnologysc-5554910 µg/mL
抗兔 IgG (H+L) 驴抗体，Alexa Fluor 555 标记Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-315721/50 稀释
APC 标记抗人 CD62L 小鼠 IgG1 抗体BioLegend3048090.03 μg/mL
APC/Cyanine7 标记抗人 CD14 小鼠 IgG1 抗体BioLegend3671070.25 μg/mL
Attune NxT 流式细胞仪 Thermo Fisher Scientific, Inc.（蓝光/红光激光器）
牛血清白蛋白 (BSA) 第五组分MP Biomedicals810025
Brilliant Violet 510 标记抗人 CD33 小鼠 IgG1 抗体BioLegend3666090.30 μg/mL
DAPICalbiochem/EMD Millipore268298
葡聚糖 T500Pharmacosmos A/C5.51005E+11
二氢罗丹明-123Anaspec, Inc.AS-85711
FACS 细胞分选仪Becton Dickinson 型号 FACSAria
胎牛血清 (FBS)Gibco16000-044
Ficoll-PaqueMerck KGGE 17-1440-03
FITC 标记抗人 CD98 小鼠 IgG1 抗体BioLegend3156030.30 μg/mL
FlowJo 软件Becton Dickinson版本 10, 2019
荧光倒置显微镜Olympus型号 IX-70
肝素Inhepar - PiSA Farmaceutica36601495000 UI/mL
HEPESSigma AldrichH7006
MACSprep 嵌合体分析 CD66b 磁珠Miltenyi Biotec130-111-552
磁铁Miltenyi Biotec130-042-102
磁性分离柱Miltenyi Biotec130-042-201
微量离心机Eppendorf型号 5415C
酶标仪BioTek Instruments型号 Synergy HT
多聚甲醛Sigma Aldrich158127
PE 标记抗人 CD10 小鼠 IgG1 抗体BioLegend3122030.05 μg/mL
PE 标记抗人 CD16b 小鼠 IgG2a 抗体BD Pharmingen5508681/40 稀释
PE/Cyanine5 标记抗人 CD15 小鼠 IgG1 抗体BioLegend3230130.25 μg/mL
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯 (PMA)Sigma AldrichP8139
聚-L-赖氨酸Sigma AldrichP2658
冷冻离心机Eppendorf型号 5702R
RPMI-1640 组织培养基Gibco23400-021
SYTOX GreenMolecular Probes, Inc.S-7020
Tween-20 Sigma AldrichP2287
VectashieldVector LaboratoriesH-1000

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