一种利用血管紧张素II构建小鼠高血压心肌纤维化模型的实验方案

摘要

血管紧张素II（Ang II）的持续输注 通过 渗透泵法是构建高血压心肌纤维化动物模型的经典方法之一。本方案系统优化了该模型的构建流程，并详细阐述了渗透泵植入、定位及血管紧张素Ⅱ（Ang II）浓度设置的关键要点。

摘要

血管紧张素II（Ang II）的持续输注 通过 渗透泵是建立高血压心肌纤维化动物模型的常用方法。然而，现有文献报道中该技术存在某些局限性，例如不稳定性 血管紧张素II（Ang II）使用不当、泵植入位置不准确以及缺乏标准化操作流程。目前关于该模型建立方法的报道仍相对有限。本方案系统优化了通过Ang II渗透泵诱导小鼠高血压性心肌纤维化模型的建立过程，包括Ang II溶液的标准化配制、剂量校准、渗透泵皮下精准植入以及模型评价指标的定量标准。实验结果表明，采用Ang II渗透泵诱导的小鼠高血压性心肌纤维化模型具有较高的存活率。皮下植入后7天，收缩压（SBP）稳定在160 mmHg。模型小鼠左心室射血分数显著降低，左心室舒张末期内径增大。与假手术组相比，高血压心肌间质及血管周围区域的胶原沉积明显增加。本研究基于小样本量（n = 6）初步验证了采用Ang II联合渗透泵构建小鼠高血压性心肌纤维化模型的可行性，并建立了定量的表型验证体系。

引言

心肌纤维化（MF）是高血压的主要病理结局之一，其特征是在受损或受压的心肌中过度沉积胶原纤维。它是高血压介导的靶器官损害最重要的形式之一，并导致进行性心脏功能障碍^1,2。建立合适的动物模型对于深入研究高血压性心肌纤维化的发病机制以及开发新的治疗策略至关重要。血管紧张素II（Ang II）是肾素-血管紧张素系统的核心效应分子，在高血压的发生发展中起关键作用³。因此，基于Ang II诱导的方法已成为建立小鼠高血压模型的常用手段。

目前构建高血压动物模型的主要方法包括手术诱导、药物诱导和转基因自发性模型。手术诱导通常采用肾动脉缩窄、升主动脉缩窄或主动脉弓缩窄等技术，人为增加血流阻力，从而诱发血压升高⁴。尽管这些方法可快速建立适用于研究应激负荷相关心肌重塑过程的高血压状态，但操作复杂，且术后并发症较多。药物诱导一般通过腹腔注射或口服给药方式使实验动物血压升高⁵。该技术相对简便，但模型稳定性易受药物剂量、给药频率及动物应激反应等因素干扰。自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats）和BPH/2J高血压小鼠等转基因模型具有稳定的高血压表型，广泛应用于遗传性高血压研究。然而，其单一的致病机制限制了对多因素诱导的临床高血压的模拟能力。

最近，基于持续血管紧张素 II（Ang II）输注的高血压模型 通过 皮下渗透泵已得到广泛应用。该方法能够以恒定速率持续释放血管紧张素II（Ang II），在较长时间内维持稳定的血液浓度，从而紧密模拟病理过程，复制小鼠高血压性心肌纤维化^6,7,8然而，该方法仍存在一些重要局限性，尤其是在实验方案的标准化以及纤维化结果的一致性方面。这些局限性可能受到多种因素的影响，例如泵植入技术以及动物个体特异性的反应差异。⁹为弥补上述不足，本研究优化了基于血管紧张素II渗透压泵的小鼠模型，标准化了关键实验步骤，并提供了可视化操作流程。这些改进显著提高了实验的可重复性和实用性，为今后研究高血压性心肌纤维化提供了有价值的参考依据。

方案

所有实验操作均按照美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）《实验动物护理和使用指南》进行，实验方案已获西南医科大学动物研究委员会批准（批准编号：SWMU2020317）。

1. 血管紧张素II溶液的制备及渗透泵的填充

1. 选择12只SPF级雄性C57BL/6J小鼠（参见材料表），通过选取8周龄动物以确保发育一致性，从而控制年龄相关混杂因素，体重为20 ± 1 g。采用简单随机化方法将小鼠分为假手术组和模型组，每组6只。
2. 测量小鼠初始体重，并确定血管紧张素II（Ang II）（参见材料表）的剂量为1.46 mg/kg/d。
   注：根据预实验结果，1.46 mg/kg/d为Ang II的最佳剂量。该剂量可稳定维持收缩压在约160 mmHg，有效诱导病理性心肌纤维化，同时确保动物在为期4周的研究期间存活。
3. 向10 mg冻干的Ang II粉末中加入2.45 mL预冷至4 °C的0.9%无菌生理盐水。充分混匀后置于冰上，立即使用。
4. 在冰上操作，用注射器吸取Ang II溶液，随后依次向6个渗透泵（参见材料表）腔内各注入200 µL（浓度为3.91 mmol/L）。
5. 将渗透泵浸入37 °C无菌生理盐水中48小时，以激活渗透压驱动装置。
   注：假手术组的渗透泵中注入等体积的生理盐水。由于Ang II具有光敏感性，整个操作过程必须在完全避光条件下进行。

2. 渗透泵的植入及模型构建 ⁶

1. 动物准备与麻醉
   1. 禁食小鼠4小时，可自由饮水。随后称量每只小鼠的体重，并计算相应的麻醉剂量（戊巴比妥钠80 mg/kg）¹⁰.
   2. 麻醉小鼠 通过 腹腔注射计算剂量的戊巴比妥钠。
      注意：处理戊巴比妥钠必须遵守相关法规，在通风橱中操作，佩戴防护装备，并对残留液体进行标识后单独处理。
2. 使用剃须刀或脱毛膏去除从尾基部至背部中段区域的背侧皮肤上的毛发。
3. 用70%乙醇对剃毛区域进行三次彻底消毒¹¹.
4. 使用手术刀在消毒区域皮下做一个0.5 cm的切口。
5. 通过切口，用镊子钝性分离皮下组织至后颈部，形成一个皮下囊袋。
6. 将泵体调整至导管尖端朝向小鼠头部方向，随后用止血钳夹住尖端，并沿该方向将泵皮下植入。
7. 泵植入后，使用间断的6-0可吸收缝线缝合皮下组织，并用外科缝线关闭皮肤切口。随后将小鼠置于预热至37 °C的保温垫上，直至其完全从麻醉中恢复（约5–10分钟）。
8. 以预定剂量（1.46 mg/kg/d）持续输注配制好的 Ang II 溶液 通过 28天的渗透泵
9. 在28天输注期结束后，收集所有实验数据。然后以与之前麻醉相同的方式对小鼠进行麻醉，即按照步骤2.1.1–2.1.2中所述程序操作，并通过颈椎脱臼法处死小鼠。

3. 血压测量

1. 设备（参见材料表）预热：将加热平台设置为 37–38 °C，以确保小鼠尾部血管充分扩张。
2. 轻柔抓握小鼠并将其放入固定装置中，确保尾巴从后方孔洞自然伸出。随后，用浸有酒精的棉球彻底清洁暴露的尾部。
3. 在尾巴根部放置一个可充气袖带。将脉搏传感器置于袖带远端约 5–10 mm 处，位于尾部中下段区域。
4. 启动设备，待脉搏波形稳定后继续下一步操作。
5. 开始测量循环。系统将自动充气使袖带压力超过 200 mmHg，以阻断血流，随后以每秒 2–3 mmHg 的速度缓慢放气。当血流恢复时，传感器检测到脉搏波重新出现，由此确定收缩压。
6. 建模后每隔 7 天测量一次收缩压（SBP），共进行五次测量。每只小鼠在每个时间点记录连续三次读数，每次测量之间间隔 2 分钟。
7. 测量结束后，将小鼠放回笼中，并提供食物和饮水。清洁固定装置及尾套，防止交叉污染。

4. 心脏功能测量

1. 在建模第28天，使用戊巴比妥钠（80 mg/kg 戊巴比妥钠）对所有实验小鼠进行麻醉。
2. 将小鼠置于恒温平台上，保持仰卧位。
3. 使用超声系统进行经胸超声心动图检查（参见 材料表将小鼠的四肢连接至平台上的电极，以监测心电图（ECG）信号。
4. 在胸肌水平获取短轴成像 通过 利用M型超声观察心脏并分析心功能。每只小鼠采集三幅图像，对数据进行平均处理，用于后续左心室舒张末期内径（LVIDd）、左心室收缩末期内径（LVIDs）、左心室短轴缩短率（LVFS）和左心室射血分数（LVEF）的分析。
   注意：保持探头与胸壁接触，但避免压迫胸腔；确保M型取样线垂直于室间隔；持续测量至少3个心动周期，以获取平均值。

5. 马松染色

1. 心脏取样与固定
   1. 用戊巴比妥钠（80 mg/kg 戊巴比妥钠）麻醉小鼠。然后，用剪刀在胸腔做长约1.5 cm的纵向切口，结扎主要的心脏血管，并迅速切除心脏，以避免牵拉损伤¹².
   2. 立即用预冷的PBS冲洗切除的心脏以去除血液，并用干净的滤纸轻轻吸去多余水分。随后，沿乳头肌进行横向切片，获得厚度为3 mm的组织切片。
   3. 固定时，将心脏样本浸入4%多聚甲醛中超过48小时，确保组织与固定液体积比至少为1:10。
2. 将心脏组织从4%多聚甲醛固定液中取出。然后在通风橱内，使用手术刀将组织切成4 µm厚的薄片，并将切片转移至脱水盒中¹³.
3. 将组织切片放入脱水机中，并按以下步骤操作：70% 乙醇、80% 乙醇、95% 乙醇各 1 小时；100% 乙醇 I & II 各 45 分钟；二甲苯 I & II 各 30 分钟。
4. 将组织包埋于石蜡中，随后在预冷至 -20 °C 的冷台上固化蜡块。
5. 使用石蜡切片机从石蜡包埋的组织块中切取4 µm厚的纵切片。随后将切片依次浸入以下溶液中，每种溶液各5分钟，以脱蜡并水化：二甲苯I、二甲苯II、无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，最后为蒸馏水。
6. 将组织浸入配制好的Weigert铁苏木精染色液中染色8分钟。随后用蒸馏水反复冲洗，以去除多余的染色液。在酸性乙醇分化液中分化5秒，接着在Masson蓝化液中蓝化5分钟。最后用蒸馏水冲洗。¹⁴.
7. 用胭脂红染色液对切片染色10分钟，每张切片加入约200–300 µL，确保组织完全且均匀覆盖。随后将切片置于0.2%冰醋酸溶液中漂洗1分钟。
8. 用磷钼酸溶液处理切片约 5 分钟，或直至肌纤维变为红色。然后，加入足量的酸性品红溶液（通常每张切片 200–300 µL）完全覆盖组织，染色 5 分钟。最后，用 0.2% 冰醋酸溶液冲洗切片。¹⁵.
9. 通过梯度乙醇系列对切片进行脱水。随后使用二甲苯清除组织，共浸入三次，每次1-2分钟。
10. 用中性树胶封片，滴加少量中性树胶后盖上盖玻片。
11. 显微镜下（参见 材料表显微镜检查：在40×、20×和10×放大倍数下观察Masson染色组织，拍摄每张切片以保存代表性图像。
    注意：所有废弃物的处理均需遵循机构安全规程。酸性分化液和冰醋酸应收集于耐腐蚀桶中，高浓度废液需中和至pH 6–8，切勿与碱性溶液混合。乙醇应储存于防爆桶内，置于阴凉处，远离火源。二甲苯应盛于棕色桶中，在通风橱内操作并佩戴防护装备，切勿将酸类（物质）与乙醇混合。动物组织应放入贴有标签的容器中，密封后于冷冻条件下保存。¹⁶最后，将所有废弃物转移至有资质的专业机构进行处理；严禁混合废弃物或随意处置。

6. 统计分析

1. 收集所有数值数据，并使用 GraphPad Prism 9.0 进行分析。
2. 采用独立样本 t 检验分析组间差异。
3. 设定统计学显著性水平：**P < 0.01 表示极显著，*P < 0.05 表示显著。

结果

12只小鼠皮下植入渗透压泵后均存活。模型组全部成功诱导出高血压（n = 6）。术后第7天，模型组平均收缩压超过160 mmHg（图1A）。在第14、21和28天，模型组的收缩压持续高于160 mmHg。相比之下，假手术组在整个实验期间收缩压维持在正常水平（约90–110 mmHg），无明显升高。

在植入渗透压泵28天后，超声心动图显示，与假手术组相比，模型组小鼠出现心室壁变薄、后壁代偿性增厚以及前壁运动减弱（图1B）。左心室射血分数（LVEF）和左心室缩短分数（LVFS）显著降低（P < 0.01），而左心室舒张末期内径（LVIDd）和收缩末期内径（LVIDs）显著增加（P < 0.01）（图1C-F）。结果表明，模型组小鼠出现了心脏结构改变，表现为左心室肥厚及心功能受损。相反，假手术组小鼠的心室大小（LVIDd、LVIDs）、室壁厚度及心功能参数（LVEF、LVFS）均保持正常，未...

讨论

本方案优化了使用渗透压泵持续输注血管紧张素II（Ang II）以诱导高血压性心肌纤维化的关键步骤，并详细阐述了渗透压泵的植入位置和Ang II浓度设置等关键环节。选择2004型泵是因为其可维持4周的输注时间，Ang II剂量则根据标称输注速率计算，并考虑了批次间极小的变异性。该模型的有效性通过收缩压（SBP）监测、心脏彩色多普勒超声和Masson染色得以验证。本方案采用8周龄雄性C57BL/6J小鼠，以确保实验对象发育阶段的一致性，从而最大限度地减少年龄对实验结果的混杂影响¹⁹。

在植入血管紧张素II（Ang II）缓释渗透泵后的第7天，模型组小鼠的收缩压（SBP）显著升高，随后稳定在160 mmHg左右，并持续维持该水平达三周。这一动态变化与Ang II的双相升压机制相一致：急性期（1周内）主要由Ang II直接激活血管平滑肌上的AT1受体，引起强烈血管收缩并迅速释放醛固酮；慢性期（2–4周）则涉及持续暴露于Ang II所导致的血管重塑、心肌肥厚及交感神经激活，反映了其神经体液调节特性²⁰

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
血管紧张素 II	Sigma-Aldrich Corporation	Sigma, A9525
动物麻醉机	深圳瑞沃德生命科技有限公司	R530
动物呼吸机	深圳瑞沃德生命科技有限公司	R415
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc.	Version 9.0
智能无创血压监测仪	日本Soft Dragon公司	Softron, BP-98A
光学显微镜	易景通光学技术（上海）有限公司	OLYMPUS, SZ61TR
Masson三色染色液及试剂盒	北京索莱宝科技有限公司	Solarbio, G1340
小鼠	成都达硕实验动物有限公司	C57BL/6J
渗透压泵	ALZA Corporation	Alzet, Model 2004
超声成像系统	FUJIFILM VisualSonics Corporation, Canada	FUJIFILM, Vevo 3100