使用血管紧张素 II 构建高血压心肌纤维化小鼠模型的方案

Summary

通过渗透泵 连续 输注血管紧张素II（Ang II）是构建高血压心肌纤维化动物模型的经典方法之一。该协议系统地优化了该模型的构建过程，并详细阐述了渗透泵植入、定位和Ang II浓度设置的要点。

Abstract

通过渗透泵 连续 输注血管紧张素 II （Ang II） 是建立高血压心肌纤维化动物模型的广泛使用的方法。然而，该技术在当前的报告中表现出一定的局限性，例如 Ang II 的不稳定性、泵放置不准确以及缺乏标准化程序。目前关于设立方法的报告仍然相对有限。该方案系统优化了Ang II渗透泵诱导的小鼠高血压心肌纤维化模型的建立，包括Ang II溶液的标准化制备、剂量的校准、渗透泵的精准皮下植入以及模型评价指标的定量标准。实验结果表明，Ang II渗透泵诱导的小鼠高血压心肌纤维化，存活率较高。皮下植入 7 天后，收缩压 （SBP） 水平稳定在 160 mmHg。模型小鼠左心室射血分数显着降低，左心室舒张末期尺寸增加。与假手术组相比，高血压心肌间质组织和血管周围区域胶原沉积增加。本研究基于小样本量（n = 6），初步验证了使用Ang II联合渗透泵建立高血压心肌纤维化小鼠模型的可行性，并建立了定量表型验证系统。

Introduction

心肌纤维化 （MF） 是高血压的主要病理结果，其特征是受损或受压的心肌内胶原纤维沉积过多。它是高血压介导的靶器官损伤的最重要形式之一，并导致进行性心功能障碍 ^1,2。建立合适的动物模型对于推进高血压心肌纤维化的机制研究和开发新的治疗策略至关重要。血管紧张素 II （Ang II） 是肾素-血管紧张素系统的中枢效应子，在高血压发病机制中起关键作用³.因此，基于Ang II的诱导已成为建立小鼠高血压模型的广泛使用的方法。

目前构建高血压动物模型的方法主要包括手术诱导、药理学诱导和转基因自发模型。手术诱导通常采用肾动脉收缩、升主动脉收缩或主动脉弓收缩等技术，人为地增加血流阻力，从而诱发血压升高⁴。虽然这些方法可以快速建立适合研究压力负荷相关心脏重塑过程的高血压状态，但它们涉及复杂的程序和许多术后并发症。药物诱导通常利用腹腔注射或口服给药来升高实验动物的血压⁵。虽然该技术相对简单，但模型稳定性仍然容易受到药物剂量、给药频率和动物应激反应的干扰。自发性高血压大鼠和BPH/2J高血压小鼠等转基因模型表现出稳定的高血压表型，被广泛应用于遗传性高血压研究。然而，它们独特的致病机制限制了它们模拟多因素诱发的临床高血压的能力。

最近，基于通过皮下渗透泵连续输注 Ang II 的高血压模型越来越受欢迎。该方法能够以恒定速率持续释放Ang II，在较长时间内保持稳定的血液浓度，以密切模拟病理过程并复制小鼠高血压心肌纤维化^6,7,8。尽管如此，仍然存在重要的局限性，特别是在方案的标准化和不一致的纤维化结果方面，这可能受到泵植入技术和动物特异性反应等因素的影响⁹。为了解决这些差距，本研究改进了基于 Ang II 渗透泵的模型，标准化了关键步骤，并提供了可视化协议。这些改进增强了可重复性和实际适用性，为未来高血压心肌纤维化的研究提供了有价值的参考。

Protocol

所有实验程序均按照美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》进行，实验方案经西南医科大学动物研究委员会批准（批准号SWMU2020317）。

1、Ang II溶液的制备和渗透泵的填充

1. 通过选择8周龄的动物来选择12只体重为20±1g的SPF级雄性C57BL / 6J小鼠（参见 材料表），以控制与年龄相关的混杂因素。采用简单的随机化方法将小鼠分为假手术组和模型组，每组6只小鼠。
2. 测量小鼠的初始体重并确定Ang II的剂量（见 材料表）为1.46mg / kg / d。
   注意：根据初步实验，1.46 mg/kg/d 是 Ang II 的最佳剂量。该剂量可靠地将收缩压维持在约 160 mmHg，有效诱导病理性心肌纤维化，同时确保动物在整个 4 周研究中的存活。
3. 将 2.45 mL 预冷至 4°C 的 0.9% 无菌盐水加入 10 mg Ang II 冻干粉中。将溶液彻底混合并放在冰上以便立即使用。
4. 使用注射器抽取Ang II溶液，然后依次将200μL（3.91mmol / L浓度）按顺序注入六个渗透泵（参见 材料表）室中的每一个，在冰上执行该程序。
5. 通过将泵浸入37°C无菌盐水中48小时来激活渗透压驱动。
   注意：用等体积的生理盐水填充假手术组的渗透泵。由于 Ang II 是光敏的，因此该程序必须在完全的光保护下进行。

2. 渗透泵的植入和模型 ⁶ 的构建

1. 动物准备和麻醉
   1. 让小鼠禁食 4 小时，自由取水。然后，称重每只小鼠并计算适当的麻醉剂量（80mg / kg戊巴比妥钠）¹⁰。
   2. 通过腹腔注射计算剂量的戊巴比妥钠 麻醉 小鼠。
      注意：处理戊巴比妥需要遵守法规、在通风橱中作、穿戴防护设备并在残留液体上贴上标签以便单独处理。
2. 使用剃须刀或脱毛膏从尾根延伸到中背区域的区域去除背侧皮肤上的毛发。
3. 用70%乙醇彻底消毒剃须区域3次¹¹。
4. 使用手术刀在消毒区域内做一个 0.5 厘米的皮下切口。
5. 通过切口，用镊子将皮下组织钝性地向颈后部分离，形成一个口袋。
6. 使泵体的导管尖端指向鼠标头部。然后，用止血钳夹住尖端，并将泵沿该方向皮下插入。
7. 泵植入后，用间断的 6-0 可吸收缝合线缝合皮下组织，并用手术缝合线闭合皮肤切口。然后，将小鼠置于预热的37°C热垫中，直到其从麻醉中完全恢复（约5-10分钟）。
8. 通过渗透泵 以 预定剂量（1.46 mg / kg / d）连续输注制备的Ang II溶液28天。
9. 完成 28 天的输注期后，收集所有实验数据。然后，以与先前麻醉相同的方式麻醉小鼠，即遵循步骤2.1.1-2.1.2中描述的程序，并通过颈脱位对它们实施安乐死。

3. 血压测量

1. 设备（见 材料表）预热：将加热平台设置为37-38°C，以确保小鼠尾部血管中的血管舒张。
2. 轻轻抓住鼠标并将其放入约束架中，确保尾巴从后孔中自由伸出。然后，用加了酒精的棉球彻底清洁裸露的尾巴。
3. 在尾巴根部放置一个充气袖口。将脉搏传感器放置在袖带远端约 5-10 毫米处的中下尾部。
4. 激活设备并等待脉冲波形稳定后再继续。
5. 启动测量周期。系统会自动将袖带充气至超过 200 mmHg 的压力以阻塞血流，然后以每秒 2-3 mmHg 的速度缓慢放气。传感器检测到血流恢复时脉搏波的再次出现，确定收缩压。
6. 建模后每隔 7 天测量一次收缩压 （SBP），总共测量 5 次。对于每个时间点的每只小鼠，记录三个连续读数，在连续测量之间留出 2 分钟的休息时间。
7. 测量后，将小鼠与食物和水一起放回笼子中。清洁支架和尾套以防止交叉污染。

4. 心功能测量

1. 在建模的第28天，用戊巴比妥钠（80mg / kg戊巴比妥钠）麻醉所有实验小鼠。
2. 将鼠标置于恒温平台上的仰卧位。
3. 使用超声系统进行经胸超声心动图（参见 材料表）。将小鼠的四肢连接到平台上的电极以监测心电图 （ECG） 信号。
4. 通过 M 模式超声 获得 乳肌水平的短轴成像，以可视化心脏并分析心脏功能。每只小鼠捕获三张图像，并对数据进行平均，以便随后分析左心室舒张内径 （LVIDd）、左心室内径收缩压 （LVID）、左心室缩短分数 （LVFS） 和左心室射血分数 （LVEF）。
   注意：保持探头与胸壁的接触，不要压迫胸腔;确保 M 型采样线垂直于室间隔;连续测量≥ 3 个心动周期以获得平均值。

5. 马尾苋染色

1. 心脏取样和固定
   1. 用戊巴比妥钠（80mg/kg戊巴比妥钠）麻醉小鼠。然后，用剪刀在胸腔内纵向切开约1.5厘米的切口，结扎主要心血管，并迅速切除心脏，以避免牵引损伤¹²。
   2. 立即用预冷的 PBS 冲洗切除的心脏以去除血液，并使用干净的滤纸轻轻吸干多余的水分。随后，沿肌进行横切片，以获得3毫米厚的组织切片。
   3. 固定时，将心脏样品浸入4%多聚甲醛中48小时以上，确保最小组织与固定剂体积比为1：10。
2. 从4%多聚甲醛固定剂中去除心脏组织。然后，在通风橱下，用手术刀将组织切成4μm厚的薄片，并将切片转移到脱水盒¹³中。
3. 将组织切片装入脱水机中并执行以下步骤：70%乙醇，80%乙醇，95%乙醇，各1小时;100% 乙醇 I 和 II 各 45 分钟;二甲苯 I 和 II 各 30 分钟。
4. 将组织包埋在石蜡中，然后在预冷的-20°C冷板上固化块。
5. 使用石蜡切片机从石蜡包埋的组织块中获得 4 μm 厚的纵向切片。然后，依次将切片浸入以下溶液中5分钟，以脱蜡并再水化：二甲苯I，二甲苯II，无水乙醇，95%乙醇，80%乙醇，70%乙醇，最后蒸馏水。
6. 将组织浸入制备的Weigert铁苏木精染色液中8分钟。然后，用蒸馏水反复冲洗以去除多余的染色溶液。在酸性乙醇分化溶液中分化5秒，然后在马森蓝溶液中发蓝5分钟。最后，用蒸馏水冲洗¹⁴.
7. 用胭脂红染色切片10分钟，每张载玻片涂抹约200-300μL，以确保组织完全均匀覆盖。然后，用0.2%冰醋酸冲洗切片1分钟。
8. 用磷钼酸溶液处理切片约 5 分钟，或直到肌纤维变红。然后，用足够体积的苯胺蓝溶液对切片进行染色，以完全覆盖组织（通常每张载玻片 200-300 μL）5 分钟。最后，用0.2%冰醋酸溶液¹⁵冲洗切片。
9. 通过分级乙醇系列对切片进行脱水。继续用二甲苯清除组织，每次浸泡三次，每次1-2分钟。
10. 通过涂抹少量中性树脂并用盖玻片覆盖来安装这些部分。
11. 显微镜（见 材料表）检查：以 40×、20× 和 10× 放大倍率观察马森染色组织。拍摄每张幻灯片以保留代表性图像。
    注意：根据机构安全协议处理所有废物。在耐腐蚀桶中收集酸性分异液和冰醋酸，将高浓度废物中和至pH 6-8，不与碱性溶液混合。乙醇贮存于防爆桶中，置于阴凉处，远离火源。将二甲苯盛在棕色桶中，在通风橱中作并佩戴防护设备，不要将酸（物质）与乙醇混合。将动物组织放入贴有标签的容器中，密封，并在冷冻条件下储存¹⁶.最后，将所有废弃物转交有资质的专业机构进行处置;严禁混杂废弃物或随便处理。

6. 统计分析

1. 收集所有数值数据并使用 GraphPad Prism 9.0 进行分析。
2. 使用独立样本 t 检验来分析组间的差异。
3. 将统计显着性设置为**P < 0.01表示高度显著性，*P < 0.05表示显著性。

Results

12 只小鼠用渗透泵皮下植入并存活下来。模型组均出现高血压（n = 6）。植入后7天，模型组的平均收缩压超过160mmHg（图1A）。在第 14、21 和 28 天，模型组的 SBP 始终保持在 160 mmHg 以上。相比之下，假手术组在整个实验过程中保持正常的收缩压水平（约 90-110 mmHg），没有显着升高。

植入渗透泵后28天，超声心动图显示，与假手术组相比，模型组表现出心室壁变薄，后壁代偿性增厚，前壁运动减少（图1B）。观察到 LVEF 和 LVFS 显着下降 （P < 0.01），而 LVIDd 和 LVID 显着增加 （P < 0.01）（图 1C-F）。研究结果表明，模型组小鼠经历了心脏结构的变化，左心室肥大和心脏功能受损证明了这一点。相反，假手术组小鼠保留了正常的心室尺寸（LVIDd，LVIDs），壁厚和心脏功能参数（LVEF，LVFS），没有表现出这种异常变化...

Discussion

该方案优化了使用渗透泵连续输注Ang II诱导高血压心肌纤维化的关键步骤，并详细介绍了关键方面，例如渗透泵的植入定位和Ang II浓度的设置。选择 2004 型泵的持续时间为 4 周，Ang II 剂量根据标称输注速率计算，考虑了最小的批次间变异性。通过SBP监测、心脏彩色多普勒超声和Masson染色证实了该模型的疗效。在该方案中，使用8周龄雄性C57BL / 6J小鼠来确保实验对象发育阶段的均匀性，从而最大限度地减少年龄对实验结果的混杂影响¹⁹。

在植入Ang II负载渗透泵后的第7天，模型组小鼠的SBP表现出显着的升高，随后保持在160 mmHg，并连续三周维持在该水平附近。这种动态反应与Ang II的双相升压机制一致：急性期（1周内）主要由Ang II直接激活血管平滑肌AT1受体驱动，诱导强烈的血管收缩和醛固酮快速释放;慢性期（2-4 周）涉及血管重塑、心肌肥大和由持续 Ang II 暴露引起的交感神经激活，反映了其神经体液调节特性

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
安二世	西格玛-奥尔德里奇公司	西格玛，A9525
动物麻醉机	深圳奖赏生命科学有限公司	R530
动物呼吸机	深圳奖赏生命科学有限公司	R415
GraphPad 棱镜及nbsp;	GraphPad 软件公司	版本 9.0
智能非侵入式血压监测仪	日本软龙株式会社	Softron，BP-98A
光学显微镜	一景通光学技术（上海）有限公司	奥林匹斯，SZ61TR
马森三色染色溶液及套件	北京索莱宝科技有限公司	索拉比奥，G1340
小 鼠	成都多西动物保护有限公司	C57BL/6J
渗透泵	ALZA公司	Alzet，2004年型
超声成像系统	富士电影视觉声波公司，加拿大	富士胶片，Vevo 3100