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建立脑转移模型：通过立体定向皮层内注射对转移性定植及组织学生长模式进行标准化分析

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DOI：

10.3791/69415

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2026年1月16日

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1Department of Internal Medicine III, Hematology and Medical Oncology, University Hospital Regensburg, 2Bavarian Cancer Research Center (BZKF), 3Center for Translational Oncology, University Hospital Regensburg, 4Fraunhofer Institute for Toxicology and Experimental Medicine ITEM-R

本文内容

摘要

立体定向颅内注射技术可实现将肿瘤细胞精确且局部地植入小鼠大脑皮层，是研究脑转移定植的有力模型。

摘要

脑转移是晚期实体瘤常见且严重的并发症，常伴随不良预后、神经系统功能下降以及生活质量降低。中枢神经系统（CNS）功能障碍和神经源性死亡的发生率正在迅速上升，然而驱动脑转移终末阶段的机制，例如继发性播散、再定植，以及组织学生长模式（HGP）作为潜在替代参数的作用，目前仍不明确。

标准化的立体定位皮层内注射模型可实现肿瘤细胞或包含基质成分或免疫成分的混合细胞群向小鼠大脑皮层的精确定植和可重复植入。该方案还支持建立临床前组织样本库，为研究中枢神经系统定植的关键方面提供了一个可靠的平台，例如：转移性生长、HGP特异性生长动力学以及导致神经系统功能障碍的病理生理机制。此外，该模型可在可重复且具有临床相关性的背景下支持药理学测试。

与全身注射方法（例如尾静脉注射或心脏内注射）不同，立体定位模型可确保稳定且特异性的脑转移性生长，从而能够研究中枢神经系统转移的晚期阶段；全身注射方法虽适用于研究早期转移步骤，但导致脑部定植率不稳定且通常较低。与类器官或脑切片培养等ex vivo（离体）系统相比，in vivo（体内）立体定位模型保留了血管化、全身信号传导以及脑内免疫微环境的完整复杂性，因而支持对肿瘤进展及治疗反应进行长期研究。

通过提供一个可重复且具有临床相关性的研究平台，我们的模型推动了该领域在识别预后标志物、探索治疗策略以及理解晚期脑转移机制方面的能力。

引言

脑转移是实体瘤患者中常见且严重的并发症，常与不良预后、显著的神经功能衰退以及生活质量下降相关1,2,3。特别是对于肺癌、乳腺癌和黑色素瘤等癌症，中枢神经系统（CNS）功能障碍及神经性死亡已成为日益常见的结局4,5,6,7。脑转移背景下的中枢神经系统功能障碍可由多种机制引起，包括局部占位效应、瘤周水肿、颅内出血以及脑膜播散，这些因素可能独立作用或协同作用，最终导致神经性死亡8。

尽管中枢神经系统功能障碍在临床上具有重要意义，但其背后的病理生理机制以及转移进展终末阶段的过程仍远未被充分阐明。诸如替代性播散、二次播散和再定植等过程很少成为专门研究的重点8。临床和临床前研究通常仅将分析局限于脑转移灶数量、大小或总生存期（OS）等终点指标，从而忽略了对神经功能恶化及死亡真正原因的关键机制性认识。

在此背景下，我们及其他研究者已鉴定出脑转移瘤中与临床预后相关的不同组织学生长模式（HGPs）9,10,11。目前已描述三种主要的HGP：i) 非浸润性，其特征为边界清晰的肿瘤边缘，常被一层反应性星形胶质细胞环所包绕；ii) 上皮样浸润性，表现为肿瘤细胞簇侵入邻近脑实质，且无星形胶质细胞包绕限制；iii) 弥漫性浸润性，其特点为单个肿瘤细胞或小细胞簇广泛浸润，导致广泛的星形胶质细胞增生10,12。

临床上，浸润性HGP与非浸润性模式相比，预后显著更差9,10,11。此外，HGP似乎反映了肿瘤生长动态及导致神经系统死亡的关键机制。非浸润性转移灶通常以单一病灶形式扩张，并压迫脑内重要结构；而浸润性病灶则在中枢神经系统（CNS）内表现出继发性播散（起始于已有病灶，而非原发肿瘤），导致广泛性损伤和器官完全破坏（未发表数据）。浸润性病灶还可能重新定植于脑膜，导致脑膜转移，进一步加重疾病进程10,13。尽管HGP具有重要临床意义，但脑转移瘤的HGP特征以及中枢神经系统定植的终末阶段（包括同一器官内的继发性播散和再定植）仍研究不足，主要原因在于缺乏合适的实验模型。

为弥补这一空白，我们提出了一种立体定向颅内注射模型，可实现将肿瘤细胞或包含肿瘤细胞及一种以上非肿瘤细胞的细胞混合物精确且可重复地植入实验小鼠的大脑皮层。该模型克服了全身性转移模型的关键局限性，为研究中枢神经系统定植的关键方面提供了可靠平台，例如：定植过程中的肿瘤-免疫细胞相互作用14、经预处理的细胞混合物的影响15、转移性生长16、HGP特异性生长动力学以及导致神经系统功能障碍的病理生理机制（未发表数据）。此外，该模型还可在可重复且具有临床相关性的背景下支持药理学测试14,15。

本方案提供了一种详细的实验方法框架，用于实施立体定向注射模型以研究脑转移中的人类胶质瘤细胞（HGPs）。该方法还可支持建立结构化的临床前样本库和数字化组织库，以系统性地研究中枢神经系统晚期定植生物学。我们的目标是识别出具有预后价值且可能具有预测意义的生物标志物，推动更优治疗策略的开发，并提高我们对脑实质及免疫系统急性和慢性反应的预测能力。通过这一方法，我们力求为中枢神经系统定植及转移进展的系统性研究提供一个标准化平台。

方案

本方案中描述的所有动物操作均按照机构指南进行，并已获得下弗兰肯行政区政府批准（许可证号：RUF-55.2.2-2532-2-1678）。本方案旨在通过立体定位法向同源成年小鼠（10–12 周龄）大脑皮层内注射肿瘤细胞，建立脑转移定植模型。对本方案的任何修改均应与指定的动物福利负责人进行讨论。

1. 术前操作

  1. 动物的适应性驯化
    注意：小鼠在开始实验操作前必须至少适应环境7天。
    1. 在标准实验室条件下（22 ± 2 °C，相对湿度50–60%，12小时光照/黑暗循环）以群养方式饲养实验动物，并提供 随意摄取 食物和水的获取
    2. 为促进动物福利并减少应激，需提供环境丰富化措施，包括筑巢材料、庇护所和啃咬块。
    3. 在适应期期间，每天对动物进行一次操作（每次持续3-5分钟），使其熟悉与人类的接触。此外，实施模拟操作，模拟即将进行的手术关键环节，包括称重和暴露于麻醉装置，但不实施任何侵入性干预。这些操作旨在使动物适应实验流程环境，减少与应激相关的变异。
  2. 体格检查（术前健康检查）
    注意：在肿瘤细胞注射前，所有动物必须接受全面的体格和神经系统检查，以排除与本研究无关的任何预先存在的异常。出现功能缺陷或异常的动物应被排除在研究之外。体格检查可在注射前一天进行。
    1. 进行全面的体格检查，评估整体健康状况，包括毛发状态、姿势、呼吸、步态、体重和一般行为。
    2. 使用悬线试验评估神经功能，以检测抓握力和协调性。进行悬线试验时，将一根水平金属丝（直径约2 mm）固定在两个支撑物之间，两端设有逃生平台，平台距离下方软垫表面约30 cm。将小鼠置于金属丝中央，使其前肢抓住金属丝。松开小鼠并立即开始计时。当小鼠到达任一平台或掉落时，终止试验。若小鼠在60 s内成功到达平台，则视为通过；若小鼠在此时间内掉落或未能到达平台，则记为失败。
  3. 工作站的准备
    1. 手术当天（第0天），按照下述要求设置四个专用工作台，以确保手术过程中流程高效并维持无菌操作技术。
      注意：使用无菌外科材料（垫巾、纱布敷料、缝线等）和经高压灭菌的外科器械（手术刀、镊子、剪刀、刮匙等）。
      1. 工作站 #1 — 术前动物准备：使用该工作站对小鼠进行称重、配制麻醉剂溶液并实施麻醉。准备一个清洁的操作台面，放置电子天平、两个带垫料的笼子（其中一个专门用于存放麻醉后的小鼠）、一支装有麻醉剂溶液的1 mL注射器以及眼用软膏。
      2. 工作站 #2 — 术前与术后设置：使用此工作站进行头皮切口、颅骨封闭和伤口缝合。准备一个清洁的操作台，台上放置手术刀、含0.9% NaCl的10 mL注射器、骨蜡、刮勺、缝合材料、镊子和剪刀、棉签、消毒剂（70%乙醇）、含镇痛药的1 mL注射器，以及加热垫或类似的保温平台。
      3. 3号工作站——肿瘤细胞制备：在接种前使用此工作站制备肿瘤细胞悬液。准备一个洁净的操作台面，放置一个冰盒，内含一支10 µL Hamilton注射器，一支装有细胞悬液的Eppendorf管（细胞悬浮于细胞外基质（ECM）培养基中），一支配有100 µL吸头的移液器用于重悬细胞，以及三个用于接种后清洗Hamilton注射器的容器，分别装有蒸馏水、70%乙醇和0.9% NaCl。
      4. 工作站 #4 — 立体定位注射：使用此工作站将肿瘤细胞立体定位注射至大脑皮层。准备一个洁净的操作区域，配备小动物立体定位仪、精密牙科钻、大号镊子和棉签。
  4. 肿瘤细胞悬液的制备
    注意：所有肿瘤细胞悬液的制备步骤均须在经认证的二级生物安全柜内进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、手套和眼部防护装置，以确保无菌操作并保护操作人员免受潜在生物危害暴露。
    1. 使用1 mL胰蛋白酶1x EDTA消化细胞。
      注意：建议使用处于对数生长期的肿瘤细胞。
    2. 使用适当的计数方法（如血细胞计数板或自动细胞计数仪）准确测定细胞数量。
    3. 制备含有 1 x 103 每只动物使用 3 µL ECM 培养基中的细胞悬液。采用 ECM 与含 10% FCS 及其他适当补充物的标准培养基按 2:1 比例混合。根据动物数量按比例扩大悬浮液体积和细胞数量（例如，对于 10 只小鼠，制备 10 × 10）3 30 µL ECM培养基中的细胞）
      注意：每种细胞系的注射细胞数量应仔细进行滴定。
    4. 将细胞悬液置于冰上直至注射，最长不超过2小时。

2. 术中操作

  1. 小鼠麻醉
    1. 使用精密天平称量每只小鼠的体重，并根据体重计算所需麻醉剂的体积。
    2. 通过腹腔注射给予计算好的麻醉剂体积。
      注：应使用能够覆盖整个手术过程（约2小时）的麻醉方案。例如：10%氯胺酮（盐酸氯胺酮，100 mg/mL；100 mg/kg体重）联合多咪静（盐酸美托咪啶，1 mg/mL；0.25 mg/kg体重），或等效方案。
    3. 确认达到充分麻醉深度后，将小鼠置于预热的加热垫上（维持在37–38 °C），以支持体温调节，并涂抹眼膏以防止角膜干燥。
      注：通过镊子轻轻夹捏后肢足垫来确认麻醉深度是否足够。只有在未观察到回缩反射时，方可进行手术。
  2. 头皮准备与切口
    1. 术前注射利多卡因，以在切口部位提供局部麻醉。使用1%利多卡因溶液（5 mg/mL），沿预定切口线皮下注射约0.05–0.1 mL。在进行头皮切口前，至少等待2–3分钟，以确保麻醉起效。
    2. 使用含碘消毒液彻底消毒头皮。
      注：根据批准的动物使用方案，手术前不剃除动物毛发；小鼠术前准备应遵循当地动物伦理委员会的建议。
    3. 拉紧皮肤，使用无菌手术刀沿颅骨中线做约3–4 mm的切口。
    4. 使用同一把手术刀轻轻刮除骨膜，以暴露颅骨表面。
  3. 立体定位仪设置、坐标定位与颅骨开窗
    1. 使用耳杆将小鼠头部固定在立体定位仪上。
    2. 利用立体定位臂定位前囟（冠状缝与矢状缝的交点），然后将立体定位臂移动至前囟前方2 mm、外侧1 mm（右侧）的目标注射位点（如图1B所示），并用外科标记笔标记该位置。
      注：若目标注射位点处有血管经过，可将位置调整不超过0.5 mm，以避免出血。
    3. 使用精密牙科钻小心钻穿颅骨，注意不要穿透硬脑膜。
    4. 用无菌镊子轻轻探查开孔区域，确认已穿透颅骨。
  4. 肿瘤细胞注射
    注：此步骤应迅速操作，因为细胞外基质（ECM）在室温下会开始凝固，可能影响注射的准确性和一致性。
    1. 通过反复吹打充分重悬肿瘤细胞悬液，确保细胞均匀分布。
      注：避免使用涡旋振荡，以防产生气泡。
    2. 将3 µL细胞悬液装入10 µL Hamilton注射器中，并使用合适的固定架将其安装在立体定位仪上。
    3. 小心将注射针头对准颅骨钻孔位置。
      注：确保针头斜面朝向左侧，以提高注射的可重复性。
    4. 将针头垂直插入脑组织至3.5 mm深度。到达该深度后，缓慢回撤针头0.5 mm，以帮助防止注射过程中及注射后细胞悬液反流。
    5. 在1分钟内缓慢注射3 µL肿瘤细胞悬液。注射完成后，保持针头原位静置2分钟，使细胞和细胞外基质充分沉降，最大限度减少反流风险。
    6. 小心撤出注射器，并将小鼠从立体定位仪上取下。
  5. 缝合与麻醉恢复
    1. 用无菌0.9% NaCl溶液轻轻冲洗颅骨。
    2. 干燥后使用骨蜡封闭颅骨钻孔。
    3. 使用3至4针缝合头皮切口，确保每针均打三个紧密的结，且结应靠近伤口边缘，以促进正常愈合。
    4. 根据指定的编号，使用相应的耳孔模式对小鼠耳朵进行标记。
    5. 如需要，再次涂抹眼膏以防止恢复期间角膜干燥。随后立即将小鼠放回预热的加热垫上（维持在37–38 °C），以支持体温调节并促进平稳的麻醉恢复。
      注：建议在恢复期间将小鼠单独饲养短暂时间（最长1小时），以防止清醒动物与恢复中动物相互作用造成伤害。
    6. 通过依次用蒸馏水、70%乙醇和无菌0.9% NaCl溶液各冲洗三次，彻底清洁并消毒Hamilton注射器的针头和针筒。
    7. 清洁后，将Hamilton注射器置于冰上保存，直至下次使用。

3. 术后操作

  1. 术后镇痛
    1. 在小鼠仍处于麻醉状态时，通过皮下注射给予镇痛药，以确保术后立即发挥镇痛作用。
      注意：使用适用于此类手术的镇痛剂。例如，卡洛芬按每公斤体重10 mg给药。 
    2. 待小鼠完全清醒并恢复正常的运动功能后，将其转移至铺有新鲜垫料的清洁笼具中。短暂观察动物的行为和呼吸模式是否正常。
    3. 完全恢复后，给予镇痛处理 通过 术后至少24小时内提供饮用水（例如，按200 mg/kg体重给予安乃近）。
      ​注意：为促进饮水，可在饮水中加入0.5%蔗糖以增加甜度。用铝箔纸包裹饮水瓶以避光，并每日更换。对每瓶饮水进行标记，以追踪镇痛药物摄入情况。若镇痛药物未被摄入 通过 若出现饮水减少或疼痛症状，应皮下注射卡洛芬（Carprofen，10 mg/kg 体重），每 12 小时一次，直至完全恢复。
  2. 小鼠监测
    1. 术后前48小时内，每24小时密切观察所有小鼠一次，评估其运动功能和行为。从第3天开始，至少每3天监测小鼠一次，包括测量体重。
    2. 若观察到小鼠出现痛苦迹象或异常行为（如运动能力受损、行为异常），则按照前述方法进行悬挂 wire 测试。若小鼠通过该测试，继续监测，并每隔一天重复测试一次。
    3. 当小鼠出现预定义的人道终点之一时，立即实施安乐死（见第3.4节）：体重减轻 > 初始体重下降20%（第0天）、悬挂丝线试验失败，或持续中度痛苦达48小时。
  3. 治疗性处理（可选）
    1. 在动物完全从术后恢复后，可根据实验设计开始治疗方案。若如此，应在研究方案中明确定义治疗开始的时间，并调整监测计划，以反映治疗干预的预期效果及潜在副作用。
      ​注意：在动物表现出正常行为、体重稳定且无术后不适迹象之前，不应开始治疗。
  4. 安乐死与组织采集
    注意：根据特定研究目标的要求，小鼠一旦达到预设的人道终点或指定的实验时间点，必须立即实施安乐死。
    1. 使用适当方法对小鼠进行麻醉（参见步骤 2.1.2）。
    2. 打开胸腔，用10–20 mL冰冻的无菌0.9% NaCl进行心脏灌注，随后用10–20 mL冰冻的4%多聚甲醛（PFA）灌注。
      注意：如果下游应用需要新鲜组织（例如 RNA 提取或 FACS），则省略 PFA 灌注步骤。
    3. 采集大脑及其他目标器官。
      注意：器官可置于液氮中速冻，或用福尔马林固定以进行FFPE处理，也可直接用于后续分析。
  5. 系统性尸体解剖分析
    注意：为了确认转移性生长并表征相关的组织病理学特征，应使用新鲜冷冻样本和固定样本（FFPE）对脑组织进行尸检分析。
    1. 组织解剖
      1. 根据提供的示意图，在注射位点水平解剖脑组织 图1C.
      2. 保留前部用于新鲜冷冻（FF）处理。将该部分分为注射侧（i.）和非注射侧（n.i.）半球。
      3. 保留中央部分用于福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）。
      4. 弃去后部组织，包括小脑和脑干。
    2. 样品处理
      1. 将前部组织在液氮中快速冷冻，并将FF样品储存在-80 °C，直至后续使用。
      2. 在室温下用 5-7 mL 4% 多聚甲醛固定中心部位 48 小时，然后进行石蜡包埋处理。
        注意：必须在化学通风橱中进行PFA固定，并佩戴适当的个人防护装备（PPE） 以避免接触有毒烟雾。
    3. 转移负荷定量（FF 样本
      1. 使用适用于脑组织的总RNA提取试剂盒或优化方案提取总RNA。
        注意：RNA 提取必须在生物安全柜中进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），以防止污染和接触有害试剂。
      2. 使用肿瘤细胞特异性标志物（如）进行定量 PCR（qPCR） Ck8.
        注意：可通过选择适当的基因标记物来评估其他靶标（如免疫细胞或基质细胞标记物）。RNA测序（RNA-seq）可作为全转录组分析的替代方法。
      3. 通过将目的基因（GOI，例如）的表达量进行归一化处理，计算相对肿瘤负荷 Ck8) 与一个持家基因（HK）进行比较。
    4. 组织学分析（FFPE 样本）
      1. 将福尔马林固定组织包埋于石蜡中。
      2. 使用切片机将组织样本切成3 µm厚的切片。
        注意：切片机的使用必须由经过培训的人员佩戴适当的个人防护装备（PPE）进行操作，不切割时应使用刀片护罩，并将刀片弃置于锐器容器中，以确保安全。
      3. 进行标准的苏木精和伊红（H&E）染色&E) 染色以及使用相关抗体进行免疫组织化学（IHC）检测，如 Ck8（肿瘤细胞）、Cd3（T细胞）、Iba1（小胶质细胞/巨噬细胞）和 Gfap（星形胶质细胞）。
        注意：H&E 和 IHC 操作必须在通风良好的区域或通风橱中进行，以确保安全并防止接触化学试剂。
      4. 使用高分辨率切片扫描仪对所有染色切片进行数字扫描，以构建数字组织库。
      5. 根据已发表的方案评估脑转移瘤的组织学生长模式（HGP）10,12.

结果

立体定向注射方案（图1）可用于同系移植和异种移植小鼠模型，包括野生型或基因修饰品系，具体选择取决于科学问题。任何能够在脑内生长的合适细胞系均可使用。可定植于脑内的小鼠肿瘤细胞系示例包括但不限于乳腺肿瘤细胞4T1和410.4、结直肠癌细胞CMT93以及黑色素瘤细胞系B16-F10。肿瘤细胞在脑内形成转移灶所需的时间因细胞系而异，从数天至数周不等，且外显率也存在差异。我们建议使用外显率约为70%的模型，即在最长20周的实验周期内，至少10只动物中有7只形成转移灶（图2A）。每个细胞系均应单独优化，并仔细滴定注射的细胞数量。

例如，我们比较了两种亲缘关系密切的同系乳腺癌脑转移模型：410.4 及其衍生细胞系 4T1。尽管它们具有高度相似的遗传背景17，但这些细胞系在脑内的转移行为和生长模式表现出显著差异16。虽然两者的转移负荷相似（图 2B），但它们各自具有独特的时间进程（图 2C）以及明显不同的高增殖模式（HGPs）（图 2D）。为了系统性地评估并比较不同细胞系之间的定植效率，我们开发了定植指数（Colonization Index），这是一种结合注射细胞数量、中位生存时间及定植成功率的数学公式（图 2E-G）。

首次进行立体定向注射或测试新的细胞系时，必须仔细评估细胞生长模式，并比较不同动物、手术操作及实验人员之间的结果，以确保实验的可重复性。其中一个关键步骤是肿瘤细胞的注射，此过程中可能发生细胞悬液的泄漏。这会导致肿瘤定位出现误导性结果，尤其是医源性地将肿瘤细胞接种至颅骨和/或脑膜，可能引发假阳性的脑膜转移，而该情况并不代表真正的脑内定植后继发的脑膜播散。这些情况如图3所示。

临床前癌症研究时间线；立体定位手术；RNA提取、qPCR、组织学分析。
图1：小鼠皮层内立体定位肿瘤细胞注射的术前、术中和术后操作流程。该流程的示意图概述。（A）术前阶段包括动物适应、健康评估、手术区域准备以及肿瘤细胞悬液的制备。（B）术中阶段包括麻醉诱导、头皮切口、固定于立体定位仪、精确开颅、利用立体定位坐标将肿瘤细胞注射至大脑皮层、伤口缝合及麻醉后恢复。（C）术后阶段包括给予镇痛剂、常规监测以评估术后恢复情况、一般健康状况以及神经症状的发展（悬丝实验），随后实施安乐死并采集器官。结构化的死后分析包括通过qPCR在新鲜冷冻（FF）组织中评估转移负荷，并利用数字切片库中的FFPE样本评估组织学生长模式。关键操作步骤按顺序展示，以强调时间节点和手术工作流程。图像使用BioRender创建。请点击此处查看该图的放大版本。

肿瘤转移研究；生存曲线、组织学图像、数据图表；癌症进展分析。
图 2：立体定位注射 4T1 和 410.4 乳腺癌细胞后，小鼠脑转移模型中转移性生长的代表性结果。（A）宏观图像显示，注射细胞外基质（ECM）的对照 Balb/C 小鼠（对照组）中无肿瘤生长，而注射肿瘤细胞-ECM 悬液的小鼠（Met）中可见转移性病灶。（B）通过 qPCR 使用 Ck8 作为肿瘤标志物，Gapdh 和 Pgk1 作为看家基因（HK），对注射 ECM 的对照组小鼠（CTRL）以及来源于 4T1 和 410.4 乳腺癌细胞的脑转移小鼠的转移负荷进行定量分析。数据以均值加单个数据点表示。统计分析采用单因素方差分析，随后进行 Dunnett 多重比较检验（n = 5；****P < 0.0001）。（C）Kaplan-Meier 生存曲线比较单独注射 ECM（对照组，黑色）、4T1（橙色）或 410.4（蓝色）肿瘤细胞的小鼠的总体生存期（OS）。统计分析采用 Log-rank（Mantel-Cox）检验（4T1 与 410.4 比较；n = 10；***P < 0.001）。（D）来源于 4T1 和 410.4 细胞的脑转移灶的代表性组织学图像，显示不同的生长模式，分别为团块状和条索样浸润性上皮性高分级胶质瘤样结构（HGPs）。组织切片使用抗细胞角蛋白 8 抗体染色。（E）使用定植指数（CI）对定植效率进行比较分析。显示了 4T1（橙色）和 410.4（蓝色）的 CI 值。（F）用于计算 CI 的公式。（G）总结两种模型中 CI 所包含参数的表格。请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠脑解剖；脑膜与实质；组织学比较；放大组织切片。
图3：立体定位注射成功与不理想结果的代表性示例。（A,C）宏观图像显示不同位置的转移性生长：（A）由于注射位置错误及肿瘤细胞泄漏导致颅骨和脑膜中的肿瘤生长，（C）经正确皮层内注射后形成的实质内转移灶。（B,D）相应的组织学切片证实（B）肿瘤在脑膜内生长并继发浸润至脑实质，以及（D）由已建立的实质内转移灶向脑膜的继发性播散。组织切片使用抗细胞角蛋白8抗体进行染色。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

立体定向颅内注射技术能够将肿瘤细胞或细胞混合物精确且局部地递送至实验小鼠的大脑皮层。当结合系统化的死后分析时，该模型对于研究脑转移的晚期阶段特别有价值，包括转移灶的生长、器官内的二次播散以及潜在的致死原因。相比之下，全身性注射方法（如尾静脉注射或心脏内注射）更适合研究转移级联反应的早期步骤，例如肿瘤细胞在循环系统中的存活、血管外渗以及在远端器官的定植。然而，这些方法并不特异于脑部，通常导致脑部定植率较低且不稳定18,19,20。

全身性模型也表现出较高的生物学变异性，特别是在受影响的脑区方面，这使得治疗研究具有挑战性，并需要较大的动物群体。此外，动物常出现颅外转移，可能导致试验早期终止19。这些局限性显著降低了它们在研究晚期脑转移中的实用性。而且，继发性播散和再定植在全身性模型中尤其难以研究，因为几乎无法区分原发性播散（源自原发肿瘤）与继发性播散（源自已建立的转移灶）。此外，在这些模型中，对脑转移灶的大转移性生长及组织生长模式（HGP）进行系统性的死后分析也受到限制。

与患者来源类器官（PDOs）和脑组织切片（共）培养等ex vivo系统相比21,22,23,24，立体定向注射具有多项关键优势。尽管ex vivo模型能够保留部分天然脑组织结构，并可能包含来自患者或供体的常驻及浸润性免疫细胞，但其缺乏血管化、系统性信号传导以及in vivo肿瘤微环境的完整复杂性，尤其是T细胞或其他来源于血液或骨髓的免疫细胞的进一步浸润23。这些局限性限制了其应用范围，仅适用于短期研究和简化条件下的实验，例如药物筛选或基本的转移性细胞-脑相互作用检测。相比之下，立体定向方法可在活体、完整的生物体内支持对肿瘤进展、免疫反应及治疗干预的长期研究。尤为重要的是，以神经系统症状评估作为人道终点，可提供一种具有临床相关性的宏观转移发生指标。这使得该模型更能反映人类疾病的自然进程，在转化研究中尤为宝贵。尽管该模型涉及动物使用，需遵循“3R原则”（替代、减少和优化）以应对伦理考量，但目前尚无法被ex vivo替代方法完全取代。其能够复制脑转移的完整生理环境，因而在深入理解转移动力学和中枢神经系统特异性病理生理机制方面不可或缺。

尽管立体定向注射模型具有诸多优势，但也存在一些需要考虑的局限性。一个关键问题是注射过程中肿瘤细胞悬液可能发生泄漏，从而导致生长模式出现误导性结果。特别是肿瘤细胞意外黏附于脑膜，可能引发医源性脑膜转移8，而这并不能准确反映该特定细胞系自然状态下的转移扩散过程。为确保数据的可靠性，应持续在不同动物、手术操作及实验人员之间对特定肿瘤细胞系的生长模式进行一致性比较。为减少肿瘤细胞泄漏，我们建议使用细胞外基质（ECM），因其具有凝胶状质地且能在体温下固化，是一种有效的辅助工具。然而，ECM也带来一定挑战，例如在注射过程中需快速操作以防止其过早固化。本实验方案中的另一个考虑因素是，肿瘤细胞被注射于ECM与含血清培养基的混合液中。虽然胎牛血清（FBS）可通过提供脑内通常受限的营养物质来增强肿瘤细胞的植入，但也可能促进炎症反应。若对此存在顾虑，可使用无血清培养基或平衡盐溶液（如HBSS或PBS）作为替代方案。

此外，立体定位注射在技术上比其他方法（如静脉注射）更具挑战性。该操作需要经过专门培训以确保可重复性，且耗时显著更长，通常每只动物需要15至30分钟，而静脉注射仅需3至5分钟。较长的操作时间限制了每次实验可处理的动物数量，对于需要大样本量以达到统计学效力的治疗研究而言，这可能构成挑战。然而，这一局限性可通过将注射操作分散在多天内完成而有效解决，这种方法不仅提高了实验的灵活性和可行性，还能引入有价值的生物学变异，更真实地反映肿瘤细胞行为和宿主反应中的个体间差异。

最后，需要指出的是，如前所述，该模型绕过了转移级联反应的早期步骤。应根据研究问题及所关注的转移特定阶段，选择合适的实验模型。对于晚期脑定植的研究，立体定位皮层内注射仍是金标准。

披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

J.A.L. 和 R.B. 获得了德国研究基金会（DFG）（TRR305-B03）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物耳缘打孔钳实验室艺术
Bepanthen® 眼鼻软膏Bayer Vital GmbH1578675
骨蜡B.Braun210434
棉签Hartmann143213
Cultrex 基底膜（ECM）提取物B&研发3432-005-01
消毒剂B.Braun 107190
钻头Bilaney Consultants GmbHD #76
眼科剪赫尔姆勒501
汉密尔顿注射器（10µL 体积）VWR5491135
加热垫 Intergastro258122
小鼠鼻/牙槽杆实验（900/1430）Bilaney Consultants GmbHDKI 926-B
诺伊斯眼科剪刀赫尔姆勒545
Paur 60° 小鼠耳杆尖端非诺卡氏菌Bilaney Consultants GmbHDKI 922
手术刀PFM Medical AG17027
塞姆金标准持针钳赫尔姆勒710
Seralon 聚酰胺缝合线（DR-009，USP 7/0，EP 0.5）Serag-Wiessner GmbH V0053491
立体定位钻 - Jacobs 夹头-18000转/分钟Bilaney Consultants GmbHDKI 1471-200-CE-A
无大鼠适配器的立体定位仪Bilaney Consultants GmbHDKI 963 % 920
5毫升注射器头&10µl HamiltonBilaney Consultants GmbHDKI 1772-F1
TC持针器 Mayo-Heear 160mm赫尔姆勒6425

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立体定向注射肿瘤细胞植入小鼠脑模型神经功能衰退转移性生长治疗反应
建立脑转移模型：通过立体定向皮层内注射对转移性定植及组织学生长模式进行标准化分析
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