脑转移建模：通过立体定向皮层注射对转移定植和组织学生长模式的标准化分析

摘要

立体定向颅内注射技术能够精确且局部地将肿瘤细胞植入小鼠皮层，使其成为研究脑转移定植的强大模型。

摘要

脑转移是晚期实体肿瘤常见且毁灭性的并发症，常伴有预后不良、神经功能衰退和生活质量下降。中枢神经系统（CNS）衰竭和神经系统死亡的发生率正在迅速上升，但驱动脑转移末期的机制，如二次传播、再定殖，以及组织生长模式（HGP）作为潜在替代参数的贡献，仍鲜为人知。

标准化立体定位皮层内注射模型能够精确且可重复地将肿瘤细胞或包括基质或免疫成分在内的混合群体直接植入小鼠大脑皮层。该方案还支持建立临床前组织档案，为研究中枢神经系统定植的关键方面提供坚实平台，如转移性生长、HGP特异性生长动态及促成神经功能衰竭的病理生理机制。此外，该模型支持在可重复的临床相关语境下进行药理学检测。

与系统注射方法（如尾静脉注射或心内注射）不同，后者优化于早期转移步骤，但导致脑部定植率变化且通常较低，立体定向模型确保稳定且针对大脑特异的转移生长，并支持中枢神经系统转移晚期的调查。与体 外 系统如类器官或脑切片培养相比， 体内 立体定向模型保留了血管形成、系统信号传导以及大脑免疫景观的全部复杂性，支持肿瘤进展和治疗反应的长期研究。

通过提供一个可重复且临床相关的平台，我们的模型推动了该领域识别预后标志物、探索治疗策略以及理解晚期脑转移机制的能力。

引言

脑转移是实体肿瘤患者中常见且毁灭性的并发症，常伴有预后不佳、显著神经功能衰退^{和生活质量}下降^1,2,3。特别是中枢神经系统（CNS）衰竭和神经系统死亡在肺癌、乳腺癌和黑色素瘤中日益常见的结局（4,5,6,7）。脑转移中的中枢神经系统功能衰竭可能由多种机制引起，包括局部质块效应、肿瘤周围水肿、颅内出血和脑膜传播，这些机制可能独立或协同作用，最终导致神经系统^死亡8。

尽管具有临床意义，但中枢神经系统功能衰竭及转移末期进展的病理生理机制仍不充分。替代传播、次级传播和再殖民等过程很少成为专门研究^的重点。临床和临床前研究常常将分析限制在脑转移数量、大小或总体生存率（OS）等终点，从而忽视了关键的机制见解以及神经衰退和死亡的真实原因。

在此背景下，我们和其他研究者鉴定出脑转移中不同的组织学生长模式（HGPs），这些模式与临床结局^9、10、11相关。已描述三种主要的HGP：i）非浸润性，具有明显的肿瘤边界，常被反应性星形胶质细胞边缘包围;ii）上皮浸润，肿瘤细胞簇无星形胶质包围而侵入邻近脑实质;iii）弥漫性浸润，表现为单一肿瘤细胞或小簇广泛浸润，导致广泛的星形胶质菌感染^10,12。

临床上，浸润性HGP与显著较差的预后相较非浸^润型模式相关，9^、10、11。此外，HGPs似乎反映了肿瘤生长动态和导致神经死亡的关键机制。非浸润性转移通常以单一病灶形式扩散并限制大脑重要结构，而浸润性病变则在中枢神经系统内表现出次级扩散（从现有病灶开始，而非原发肿瘤），导致广泛损伤和器官完全毁坏（数据未发表）。浸润性病变也可能重新定殖于脑膜，促进脑膜转移，进一步复杂化疾病进程^10,13。尽管具有临床意义，脑转移的HGPs以及中枢神经系统的最终定植阶段，包括同一器官的二次传播和再定殖，仍因缺乏合适的实验模型而研究不足。

为弥补这一空白，我们提出了一种立体定向颅内注射模型，能够精确且可重复地将肿瘤细胞或由肿瘤细胞和一种或多种非肿瘤细胞类型组成的细胞混合物植入实验小鼠的大脑皮层。该模型克服了系统性转移模型的关键局限，为研究中枢神经系统定植的关键方面提供了坚实的平台，如：定植过程中的肿瘤-免疫细胞相互作用¹⁴、预处理细胞混合物的影响¹⁵、转移性生长¹⁶、HGP特异性生长动态及促成神经功能衰竭的病理生理机制（未发表数据）。此外，该模型支持在可重复且临床相关的环境中进行药理学检测^14,15。

本方案为实施立体定向注射模型以研究脑转移中的HGP提供了详细的方法论框架。它还支持构建结构化的临床前样本档案和数字组织库，以系统性研究晚期中枢神经系统定植生物学。我们的目标是实现预后及潜在预测生物标志物的识别，促进改进治疗策略的发展，并增强预测脑实质及免疫系统急性和慢性反应的能力。通过这种方法，我们希望为中枢神经系统的定植和转移进展提供一个标准化的平台。

方案

本方案中描述的所有动物作均按照机构指南进行，并经下弗兰肯政府批准（许可证号：RUF-55.2.2-2532-2-1678）。该方案旨在通过立体定向注射肿瘤细胞，在10-12周龄的同基因成年小鼠中进行肿瘤细胞注射，作为脑部转移定植的模型。任何对协议的修改应与指定的动物福利官员讨论。

1. 术前程序

1. 动物的适应
   注意：小鼠必须在实验程序开始前至少适应7天。
   1. 在标准实验室条件下（22±2°C，相对湿度50-60%，光暗循环12小时）分组饲养实验动物，并 可自由 获取食物和水。
   2. 为了促进福利并减轻压力，提供筑巢材料、庇护所和啃食块等环境丰富。
   3. 在适应期内每天触摸动物一次（每次3-5分钟），让它们熟悉人类接触。此外，还要进行模拟手术，模拟即将进行的手术的关键环节，包括称重和麻醉设备暴露，且不进行任何侵入性干预。这些课程旨在让动物适应程序性环境，并最大限度地减少与压力相关的变异性。
2. 体格检查（术前健康检查）
   注意：在肿瘤细胞注射前，所有动物必须接受全面的身体和神经学检查，以排除与研究无关的既存异常。表现出缺陷或异常的动物应被排除在研究之外。体格检查可以在注射前一天进行。
   1. 进行全面的体检，评估整体健康状况，包括毛发状况、姿势、呼吸、步态、体重及整体行为。
   2. 使用吊线测试评估神经功能，以评估握力和协调能力。进行悬挂钢丝测试时，将一根直径约2毫米的水平钢丝悬挂在两个支撑之间，逃生平台位于两端约30厘米高的软垫表面上方。把鼠标放在电线的中心，让它用前爪抓住电线。松开鼠标，立即开始计时。当鼠标到达某个平台或掉落时，试炼结束。如果鼠标在60秒内到达平台，则视为成功;如果在时间限制内落下或未能到达平台，则记录为失败。
3. 工作站的准备
   1. 手术当天（第0天），设置四个专用工作站，确保工作流程高效，并在整个手术过程中保持无菌技术。
      注意：使用无菌手术材料（衬垫、纱布压缩包、缝线等）和高压灭菌手术器械（手术刀、产钳、剪刀、铲子等）。
      1. 工作站#1 - 术前动物准备：使用该工作站称重小鼠，准备麻醉液并施用麻醉剂。准备一个干净的表面，内含称重秤、两个带垫料的笼子（其中一个专门用于麻醉小鼠）、一根装满麻醉液的1毫升注射器和眼膏。
      2. 工作站#2 - 术前术后设置：使用此工作站进行头皮切口、封闭颅骨并缝合伤口。准备一个干净的表面，内含手术刀、10毫升注射器（含0.9%氯化钠）、骨蜡、铲子、缝线材料、镊子和剪刀、棉签、消毒剂（70%乙醇）、1毫升注射器（含止痛剂）和加热垫或类似的加热平台。
      3. 工作站#3 - 肿瘤细胞制备：在接种前使用该工作站准备肿瘤细胞溶液。准备一个干净的表面，包含一个装有10微升汉密尔顿注射器和一个带有细胞悬浮液的Eppendorf管，一个带有100微升细胞头用于细胞再悬浮的移液管，以及三个用于在肿瘤细胞接种后清洗汉密尔顿注射器的容器，内含蒸馏水、70%乙醇和0.9%氯化钠。
      4. 工作站#4 - 立体定向注射：使用此工作站对大脑皮层进行立体定向肿瘤细胞注射。准备一个干净的表面，内含小型动物的立体定位框架、精密牙科钻、大型镊子和棉签。
4. 肿瘤细胞悬浮液的制备
   注意：所有肿瘤细胞悬浮液的准备程序必须在经过认证的生物安全柜（II类罩）内进行，并配备适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、手套和护目镜，以确保无菌并保护人员免受潜在的生物危害暴露。
   1. 用1毫升胰蛋白酶1倍EDTA进行胰蛋白酶化细胞。
      注意：建议在指数生长阶段使用肿瘤细胞。
   2. 使用适当的计数方法（如血细胞计或自动计数器）准确测定细胞计数。
   3. 准备一个细胞悬浮液，每只动物含有1×10个³ 个细胞，装在3微升ECM培养基中。使用含有10% FCS及其他补充剂的2：1混合ECM和标准培养基。根据动物数量增加悬浮液体积和细胞数（例如，对于10只小鼠，在30微升ECM培养基中准备10×10个³ 细胞）。
      注意：每个细胞系的注射细胞数量应仔细滴定。
   4. 注射前将细胞悬浮液冰藏保存，最多2小时。

2. 术中作

1. 小鼠麻醉
   1. 用精确秤称每只老鼠，并根据体重计算所需麻醉剂的体积。
   2. 将计算好的麻醉剂量腹腔内注射。
      注意：使用覆盖整个过程（约2小时）的麻醉方案。例如：氯胺酮10%（氯胺酮，100 mg/mL;100 mg/kg体重）与Domitor（美托咪定盐酸盐，1 mg/mL;0.25 mg/kg体重）联合使用，或采用等效方案。
   3. 确认麻醉深度充足后，将小鼠放在预热加热垫上（保持37-38°C）以支持体温调节，并涂抹眼药膏保护角膜不干燥。
      注意：用镊子轻轻捏住后爪，确认麻醉深度充足。只有在未观察到戒断反射时才进行手术。
2. 头皮准备与切口
   1. 术前给予利多卡因，以在切口部位提供局部麻醉。使用1%利多卡因溶液（5 mg/mL），沿计划切口线皮下注射约0.05-0.1毫升。至少让麻醉药发挥作用，等待2-3分钟后再进行头皮切开。
   2. 使用含碘的溶液彻底消毒头皮。
   3. 拉伸皮肤，用无菌手术刀沿颅骨做一个约3-4毫米的中线切口。
   4. 用同一把手术刀轻轻刮除骨膜，露出颅骨表面。
3. 立体定位框架的设置、坐标识别与开颅术
   1. 用耳杆将鼠标头部固定在立体定向框架中。
   2. 使用立体定向臂，定位Bregma（冠状线与矢状状颅骨缝线的交汇处），然后将立体定向臂向前移2毫米、右侧1毫米，向额叶皮层的目标注射点移动，如 图1B 所示，并用手术标记标记。
      注意：如果注射部位有血管，可调整位置最多0.5毫米以防止出血。
   3. 用精密的牙科钻头小心钻孔，注意不要穿透硬脑膜。
   4. 用无菌产钳轻轻探查以确认开口，以感受是否有突破。
4. 肿瘤细胞注射
   注意：此步骤需迅速处理，因为ECM在室温下开始凝固，这会影响注射的准确性和一致性。
   1. 通过移液法上下彻底重新休浮肿瘤细胞，以确保均匀分布。
      注意：避免涡旋，以防止气泡形成。
   2. 将3微升细胞悬浮液装入10微升汉密尔顿注射器，并使用相应的支架放入立体定位框架中。
   3. 小心地将注射针放在毛刺孔上方。
      注意：确保针头斜面朝左，以提高注射时的重复性。
   4. 将针垂直插入脑组织，深度为3.5毫米。达到此深度后，缓慢抽出针头0.5毫米，以帮助防止注射期间及注射后细胞悬浮液反流。
   5. 将3微升肿瘤细胞悬浮液缓慢注射，持续1分钟。注射完毕后，针头再保持2分钟，让细胞和ECM稳定，最大限度减少反流风险。
   6. 小心地取出注射器，并将鼠标从立体定向框架中取出。
5. 缝合与麻醉恢复
   1. 用无菌的0.9%氯化钠溶液轻轻冲洗头骨。
   2. 用骨蜡干燥并封闭毛刺孔。
   3. 用3到4针缝合头皮切口，确保每条缝线都紧紧绑好三个紧密结，靠近伤口边缘，以便正确愈合。
   4. 用对应指定识别号的耳朵打孔标记老鼠的耳朵。
   5. 如有需要，请重新涂抹眼膏以防止恢复期间角膜干燥。紧接着将小鼠放回预热加热垫（保持在37-38°C），以支持体温调节并促进麻醉平稳恢复。
      注意：建议在恢复期间单独饲养老鼠，以防止清醒与恢复动物之间因接触而受伤。
   6. 彻底清洁和消毒汉密尔顿注射器，先用蒸馏水冲洗针头和桶管三次：先用蒸馏水，再用70%乙醇，最后用无菌0.9%氯化钠溶液冲洗。
   7. 清洗后，将汉密尔顿注射器冰封保存，等待下一次使用。

3. 术后作

1. 术后镇痛
   1. 在小鼠仍在麻醉状态下皮下注射止痛药，以确保术后疼痛立即缓解。
      注意：使用适合此类手术的止痛药。比如，卡普罗芬剂量为10毫克/公斤体重。
   2. 当老鼠完全清醒并恢复正常运动功能后，将它转移到干净的笼子里，并更换新的垫料。简短监测动物的正常行为和呼吸模式。
   3. 完全康复后， 通过饮用 水（例如200毫克/公斤体重的美他咪唑）进行镇痛，至少持续24小时。
      注意：为鼓励饮用水，请用0.5%蔗糖进行饮用水甜味。用铝箔包住饮用水瓶，保护溶液免受光照，并每天更换。给每瓶瓶贴标签以记录止痛药的摄入量。如果未 通过饮用 水服用止痛药或出现疼痛迹象，应每12小时皮下注射卡洛芬（10毫克/体重体重），直到完全康复。
2. 鼠标监控
   1. 在手术后前48小时内，每24小时密切监测所有小鼠，评估其运动功能和行为。从第3天开始，至少每3天监测一次小鼠，包括体重测量。
   2. 如果观察到有痛苦或异常行为的迹象（例如运动活动受损、异常行为），就如前所述进行吊线测试。如果老鼠通过测试，继续监测并每隔一天重复测试。
   3. 满足预定人道终点之一后，立即安乐死（见第3.4节）：体重比初始体重（第0天）减重20%>、未通过悬挂钢丝测试，或持续中度痛苦长达48小时。
3. 治疗性治疗（可选）
   1. 术后完全康复后，根据实验设计可启动治疗方案。如属此，应在研究方案中明确定义治疗启动时间，并调整监测计划以反映治疗干预的预期效果和潜在副作用。
      注意：治疗应在动物表现出正常行为、体重稳定且无术后不适迹象后开始。
4. 安乐死与组织采集
   注意：小鼠必须在达到预定的人道终点或指定实验时间点（根据具体研究目标）立即实施安乐死。
   1. 使用适当的方法麻醉小鼠（见步骤2.1.2）。
   2. 打开胸腔，先用10-20毫升冰冷无菌0.9%氯化钠进行心腔灌注，随后注入10-20毫升冰冷4%对甲醛（PFA）。
      注意：如果下游应用需要新鲜组织（如RNA分离或FACS），则省略PFA灌注步骤。
   3. 收集大脑和其他感兴趣的器官。
      注意：这些器官可以用液氮速冻，固定在福马林中进行FFPE处理，或直接用于下游分析。
5. 结构化尸检分析
   注意：为确认转移性生长并表征相关组织病理特征，死后分析应使用天然（新鲜冷冻）和固定（FFPE）样本进行脑组织分析。
   1. 组织剥离
      1. 按照 图1C所示的示范，在注射部位的水平进行大脑解剖。
      2. 保留前端部分以供新鲜冷冻（FF）加工。将这部分分为注入半球和非注射半球（n.i.）。
      3. 保留中央部分用于福尔马林固定和石蜡嵌合（FFPE）。
      4. 去除后部部分，包括小脑和脑干。
   2. 采样处理
      1. 将前部用液氮速冻，并将FF样品在-80°C下保存，等待进一步使用。
      2. 将中间部分固定在5-7毫升4%PFA中，室温下48小时后再进行FFPE处理。
         注意：PFA固定必须在化学排气柜内进行，同时佩戴适当的个人防护装备，以避免暴露于有毒气体。
   3. 转移负荷定量（FF样本）
      1. 使用针对脑组织优化的适当提取套件或方案分离总RNA。
         注意：RNA分离必须在生物安全柜内进行，并使用适当的个人防护装备，以防止污染和暴露于有害试剂。
      2. 使用肿瘤细胞特异性标记（如 Ck8）进行定量PCR（qPCR）。
         注意：通过选择合适的基因标记，可能会评估其他靶点（如免疫或基质细胞标志物）。RNA测序（RNA-seq）可作为全转录组分析的替代方案。
      3. 通过将目标基因（GOI，如 Ck8）归一化为管理基因（HK）来计算相对肿瘤负荷。
   4. 组织学分析（FFPE样本）
      1. 将福马林固定组织嵌入石蜡中。
      2. 使用切片机将样本切片成3微米厚的片。
         注意：切片机使用必须由经过培训、配备适当个人防护装备的人员进行，切割时使用护刃，刀刃则用锐器容器处理以确保安全。
      3. 使用相关抗体如Ck8（肿瘤细胞）、Cd3（T细胞）、Iba1（微胶质/巨噬细胞）和Gfap（星形胶质细胞）进行标准的血液木质和嗜红（H&E）染色及免疫组化（IHC）。
         注意：H&E和IHC程序必须在通风良好的区域或排气罩内进行，以确保安全并防止化学品暴露。
      4. 使用高分辨率切片扫描仪数字扫描所有染色切片，建立数字组织库。
      5. 按照已发布的^10,12方案评估脑转移的组织生长模式（HGP）。

结果

立体定向注射方案（图1）可应用于同基因和异种移植小鼠模型，包括野生型或转基因品系，具体取决于科学问题。任何能够在大脑中生长的合适细胞系都可以被使用。能够定植大脑的小鼠肿瘤细胞系包括但不限于乳腺肿瘤细胞4T1和410.4、结直肠癌细胞CMT93以及黑色素瘤细胞系B16-F10。肿瘤细胞在脑部建立转移所需的时间因细胞系而异，从几天到数周不等，且渗透率也存在差异。我们建议使用穿透率为~70%的模型，这意味着至少10个动物中有7个在最大20周的实验周期内发生转移（见图2A）。每个细胞系应单独优化，注射细胞数量也要仔细滴定。

举例来说，我们比较了两个密切相关的同基因乳腺癌脑转移模型：410.4及其衍生型4T1。尽管基因相似，^这些细胞系在脑中表现出显著不同的转移行为和生长模式¹⁶。虽然两者转移负重相似（图2B），但各自表现出独特的时间路径（图2C）和明显不同的HGP（图2D）。为了系统评估和比较不同细胞系间的定植效率，我们开发了定殖指数，这是一个整合注射细胞数、中位存活时间和定殖成功率的数学公式（见图2E-G）。

首次进行立体定向注射或测试新细胞系时，必须仔细评估生长模式，并比较动物、手术和实验者的效果，以确保可重复性。一个关键步骤是肿瘤细胞注射，此过程中可能发生细胞悬浮液泄漏。这可能导致肿瘤定位误导，尤其是肿瘤细胞在颅骨和/或脑膜上的医源性播种，可能导致假阳性脑膜转移，这并不代表真正的脑内定植及随后的继发性脑膜传播。这些情景如 图3所示。

图1：小鼠立体定向皮层肿瘤细胞注射的术前、术中及术后程序。手术的示意概述。 （A）术前阶段包括动物适应、健康评估、手术部位准备及肿瘤细胞悬浮。（B）术中阶段包括麻醉诱导、头皮切开、置入立体定向框架、精确开颅术、利用立体定向坐标向大脑皮层注射肿瘤细胞、伤口闭合及麻醉恢复。（C）术后阶段包括使用止痛药、常规监测以评估术后恢复情况、整体健康状况及神经症状的发展（吊线测试），随后进行安乐死和器官摘取。还包括结构化尸检分析，通过qPCR评估新鲜冷冻（FF）组织中的转移负荷，并评估数字切片库中FFPE样本的组织生长模式。按顺序展示关键手术阶段，强调时间安排和手术流程。图片用BioRender制作。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：4T1和410.4乳腺癌细胞立体定向注射后脑转移小鼠模型中转移生长的代表性结果。 （A）宏观图像显示注射ECM对照Balb/C小鼠无肿瘤生长（对照组），注射肿瘤细胞ECM悬浮液小鼠（Met）中存在可见转移病灶。（B）定量ECM注射对照小鼠（CTRL）及脑转移小鼠（源自4T1和410.4乳腺癌细胞）的转移负荷。转移负荷通过qPCR评估，使用 Ck8 作为肿瘤标志物， Gapdh 和 Pgk1 作为管理基因（HK）。数据以平均值和单个数据点的形式呈现。统计分析采用单向方差分析，随后进行Dunnett多重比较检验（n = 5;****P < 0.0001）。（C） Kaplan-Meier生存曲线，比较仅以ECM注射（对照组黑色）、4T1（橙色）或410.4（蓝色）肿瘤细胞的总体生存率（OS）。统计分析采用对数秩（Mantel-Cox）检验（4T1 对 410.4;n = 10;***P < 0.001）。（D）来自4T1和410.4细胞的脑转移代表性组织学图像，分别展示了生长模式的差异，包括队列状和类股状浸润上皮性HGP。组织切片用抗细胞角蛋白8抗体染色。（E）利用定殖指数（CI）对定殖效率进行比较分析。CI值为4T1（橙色）和410.4（蓝色）。（F）用于计算置信区间的公式。（G） 总结两种模型配置区间（CI）中参数的表格。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：成功与次优立体定位注射结果的代表性示例。 （A，C）宏观图像显示不同部位的转移性生长：（A）由于肿瘤细胞注射和漏出导致颅骨和脑膜肿瘤生长，（C）皮层内注射后成功转移实质。（B，D）相应的组织学切片确认：（B）脑膜内肿瘤生长并随后浸润至脑实质，（D）由既有实质转移引起的继发性扩散至脑膜。组织切片用抗细胞角蛋白8抗体染色。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

立体定向颅内注射技术能够精确且局部地将肿瘤细胞或细胞混合物直接输送到实验小鼠的大脑皮层。结合结构化尸检分析，该模型对于研究脑转移晚期阶段尤为有价值，包括转移性生长、继发器官内扩散及潜在死亡原因。相比之下，全身注射方法（如尾静脉注射或心内注射）更适合研究转移级联的早期阶段，如肿瘤细胞在循环中的存活、渗出和远处器官的播种。然而，这些方法并非针对大脑特异性，通常导致脑定殖率低且不一致（18,19,20）。

系统模型也显示出高度的生物学变异性，尤其是在受影响的大脑区域方面，这使得治疗性研究具有挑战性，需要大型动物队列。此外，动物常常出现颅外转移，可能导致早期试验终止¹⁹。这些限制显著降低了它们在研究晚期脑转移方面的效用。此外，次级传播和再定殖尤其难以通过全身模型研究，因为区分原发扩散（起源于原发肿瘤）和继发扩散（源自已建立的转移）几乎不可能。此外，结构化的死后分析，尤其是用于评估宏转移生长和脑转移HGPs的分析，在这些情境下是有限的。

与体外系统（如患者来源类器官（PDO）和器官型脑切片（共）培养^21,22,23,24相比，立体定向注射具有若干关键优势。虽然体外模型保留了大脑结构的部分特征，并可能包括患者或供体的常驻和浸润免疫细胞，但它们缺乏血管化、系统信号传导以及体内肿瘤微环境的全部复杂性，尤其是进一步浸润T细胞或其他血骨来源免疫细胞²³.这些限制限制了其应用于短期研究和简化环境，如药物筛查或基础转移性细胞-脑相互作用检测。相比之下，立体定向方法支持对活体完整个体肿瘤进展、免疫反应及治疗干预的长期研究。重要的是，将神经症状作为人道终点的评估，可以作为宏观转移发生率的临床相关测量。这使得模型更加贴近人类疾病进程，这在转化研究中尤为宝贵。虽然它涉及动物的使用，提出了遵循3R（替代、减少和精炼）的伦理问题，但目前该模式尚无法被体外替代方案完全替代。其复制脑转移完整生理背景的能力，使其成为推进我们对转移动力学和中枢神经系统特异性病理生理理解不可或缺的。

尽管立体定向注射模型有诸多优势，但仍存在一些局限性，需加以考虑。一个关键问题是注射过程中肿瘤细胞悬浮液可能泄漏，可能导致误导性的生长模式。特别是肿瘤细胞意外附着于脑膜，可能导致医源性脑膜转移8^，但这并不能准确反映该细胞系的自然转移传播过程。为确保数据可靠性，应在动物、手术和实验者间一致比较特定肿瘤细胞系的生长模式。为了减少肿瘤细胞渗漏，我们建议使用细胞外基质（ECM），因其凝胶状质地和在体温下凝固的能力使其成为有用的工具。然而，ECM也存在挑战，包括注入过程中需要快速处理以防止过早凝固。我们方案中的另一个考虑是肿瘤细胞注射在ECM和含血清培养基的混合物中。虽然FBS通过提供大脑中通常有限的营养物质来增强肿瘤细胞的植入，但它也可能促进炎症。如果有这个问题，可以使用无血清培养基或平衡盐溶液（如HBSS或PBS）作为替代。

此外，立体定向注射在技术上比静脉注射（IV）等方法更具挑战性。这需要专门的培训以确保复现性，且过程耗时显著增加，通常每只动物需15-30分钟，而静脉注射则需3-5分钟。更长的时长限制了每次可处理的动物数量，这对需要大量队列以实现统计功效的治疗性研究可能构成挑战。然而，这一限制可以通过多天注射有效解决，这不仅提高了实验的灵活性和可行性，还引入了宝贵的生物学变异性，反映了肿瘤细胞行为和宿主反应中更真实的个体间差异。

最后，需要注意的是，该模型绕过了前述转移级联的前几步。应根据研究问题和所研究转移的具体阶段选择合适的实验模型。在研究晚期脑定植方面，立体定向皮层注射仍是金标准。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物穿孔钳	实验室艺术
Bepanthen®眼鼻软膏	拜耳维塔有限公司	1578675
骨蜡	B·布劳恩	210434
棉签	哈特曼	143213
Cultrex基底膜（ECM）提取物	B&D	3432-005-01
消毒剂	B·布劳恩	107190
钻头	比拉尼顾问有限公司	D #76
眼剪刀	赫尔姆勒	501
汉密尔顿注射器（10µL 体积）	VWR	5491135
加热垫及nbsp;	Intergastro	258122
鼠尾/齿棒测定（900/1430）	比拉尼顾问有限公司	DKI 926-B
诺伊斯眼剪	赫尔姆勒	545
保尔60°提示 non noptore 鼠标耳栏	比拉尼顾问有限公司	DKI 922
手术刀	PFM医疗股份公司	17027
Semkin标准产钳	赫尔姆勒	710
Seralon聚酰胺缝线（DR-009，USP 7/0，EP 0.5）	Serag-Wiessner有限公司及nbsp;	V0053491
立体磁力钻机 - 雅各布斯·查克 - 18000rpm	比拉尼顾问有限公司	DKI 1471-200-CE-A
无鼠适配器的立体定向	比拉尼顾问有限公司	DKI 963 % 920
5&5 的注射器10µ汉密尔顿	比拉尼顾问有限公司	DKI 1772-F1
TC 针架 Mayo-Heear 160mm	赫尔姆勒	6425