Diopatra claparedii 前部再生的形态学表征

摘要

本方案提供了一个专注于表征Diopatra claparedii前部再生过程的框架，为未来的再生研究奠定了关键基础。

摘要

多毛类动物在受伤或自体截肢后具有再生前后体节的能力，为研究伤口修复和组织模式形成提供了一个易于操作的体系。为了支持环节动物再生的比较研究和机制研究，本研究提出了一种诱导和表征多毛类动物头部再生的方案 Diopatra claparediiD. claparedii)该方案概述了样本处理、固定和精确截肢的步骤，随后设定观察时间点，以记录再生过程中形态学变化的进展。 D. claparedii 使用钝端棒轻轻将样本从试管中取出，并置于4%氯化镁溶液中固定以诱导其放松。在4处进行前部截肢手术。^th 在体视显微镜下观察刚节，于截断后第1、6、15、30和60天监测再生过程。该方法可稳定诱导前端再生，并记录从早期伤口闭合、芽基形成到体节重新建立等关键形态学特征。通过提供可重复的操作流程和形态学参考 D. claparedii该方案为未来研究提供了实用基础，有助于将环节动物再生过程中的形态学观察与潜在的细胞或分子机制相关联。

引言

多毛类动物约占已描述的环节动物物种的65%，使其成为海洋无脊椎动物中多样性最高的类群之一¹最近一份多毛类动物（环节动物门）物种的更新清单记录了来自马来西亚沿海水域的共计57个物种，隶属于30个科的47个属，其中绝大多数物种（53种）来自马来半岛。²其中 Diopatra claparedii (D. claparedii Grube，1878，或当地称为 ruat sarung是马来西亚 commercially exploited 的一种多毛类物种，主要分布于马来半岛西海岸的潮间带泥滩，包括雪兰莪州的Jeram Beach等地。^2,3.

D. claparedii 属于龙介虫科（Onuphidae），是一种营固着生活、栖居于管状结构中的多毛类环节动物，以其能够再生前部和后部体节而闻名。这包括中枢神经系统和外周神经系统的组成部分⁴。其清晰的分节体轴结构以及显著的再生能力，使 D. claparedii 成为研究相对复杂生物系统中组织再生的一个具有潜力且易于操作的无脊椎动物模型。选择 D. claparedii 作为再生研究的模式生物，是基于其生态相关性、区域重要性，以及当前科学界对其再生能力认知尚存的空白。该物种在马来西亚被商业化采捕，并广泛用作钓鱼饵料，表明其在当地社区中广为人知，且不属于稀有物种^2,3。因此，对 D. claparedii 再生能力的研究具有实际和经济价值，研究成果不仅有助于向当地利益相关者传播科学知识，还可能通过加深对再生机制的理解，为支持其种群可持续性的策略提供依据。

此外， D. claparedii 在东南亚具有特定的地理分布，尤其在马来西亚沿海生态系统中分布尤为广泛^2,3然而，大多数关于多毛类及其他环节动物的再生研究主要集中在美洲或其他非亚洲地区的物种^5,6例如，已被深入研究的 Diopatra neapolitanaD. neapolitana)，常被用作再生生物标志物物种，广泛分布于红海、印度洋、地中海和大西洋⁷因此，针对东南亚本土环节动物的再生研究，包括 D. claparedii，仍然有限。

关于多毛类动物的既往研究表明，其再生过程具有明确且可重复的阶段，包括伤口闭合、胚基形成以及体节组织的分化^7,8。尽管已有针对 D. claparedii 的分子水平研究报道，但专门聚焦于再生过程的研究仍较为匮乏。此外，现有研究主要侧重于分子特征分析，而非实验性再生方案的建立。同时，D. claparedii 表现出去分化与再分化过程，反映出与高等生物更为相似的再生机制⁹。这种复杂的再生反应凸显了多毛类动物作为有价值中间模型日益受到重视的地位，能够在再生研究中有效填补简单无脊椎动物与复杂脊椎动物之间的空白。

本研究通过建立并优化D. claparedii的再生实验方案，填补了这一空白，为今后对该地区重要多毛类物种的再生功能、发育过程及分子机制研究提供了坚实的基础。该方案为系统研究多毛类动物再生的连续阶段及其内在机制提供了可靠方法，能够实现对再生关键过程（包括伤口愈合、芽基形成和体节分化）的系统性观察与特征描述。

方案

伦理声明

本研究已获得马来西亚登嘉楼大学研究伦理委员会的批准，批准编号为 UMT/JKEPH/2026/173

1. D. claparedii 的采集与适应驯化

1. 在河口潮间带的泥滩区域（中潮位，中细砂环境）寻找 D. claparedii，该区域为其自然栖息地。
2. 使用铲子轻轻挖掘沉积物，挖出多毛类虫管的上部，注意避免损坏虫管。
3. 通过轻轻捏压虫管并观察是否有活动或阻力，确认虫体是否存在于管内。
4. 仅选择体长（松弛状态）不小于 5 cm 的个体。
   注意：根据体长选择多毛类个体，以减少操作损伤，避免称重过程中发生断裂。
5. 使用铲子从同一采集点收集沉积物，以在实验室中保持环境条件的一致性。
6. 将采集的样本置于便携式保温箱中，于室温下运回实验室。用经海水润湿的毛巾覆盖虫管，以维持湿度并减少运输过程中的应激反应。
7. 在实验室中，人工清除沉积物中的杂物，随后在阳光下自然风干，直至完全干燥且无残留水分。
8. 清除或剔除其他生物（如小型螃蟹、贝壳或其他异物），确保沉积物无污染物。
9. 用人工海水（ASW）冲洗多毛类虫管，去除表面附着的碎屑及其他生物。
   注意：配制人工海水时，将 1/4 杯 Instant Ocean 海盐溶于 1.9 L 去氯纯化水中。
10. 使用塑料水族箱，加入采样地的沉积物，并注入调节至盐度 23–25 ppt 的人工海水（ASW）（图 1）。在整个驯化期间，保持水温恒定在 28 °C。
    注意：人工海水体积为 58 L，根据水族箱尺寸确定：61.5 cm（长）× 32 cm（宽）× 33.5 cm（高）。
11. 将 D. claparedii 转移至圆柱形塑料容器（直径 7 cm，高 15 cm）中，容器内填充一半沉积物，每容器放养一条多毛类，密度为每容器一条。
12. 将容器完全浸没于充气人工海水（ASW）的水族箱中，使多毛类能够钻入沉积物并重新建立栖息结构。
13. 以沉性鱼类饲料喂养多毛类，每周投喂 2–3 次，确保驯化期间持续营养供给。定期清除残余饲料，防止积累、真菌生长及污染。
14. 通过行为观察评估驯化状态，若个体表现出活跃探索（身体移动）和觅食行为（对刺激的反应），则表明其已恢复至正常生理状态。
    注意：在开始任何实验操作前，应给予两周的驯化期，使虫体从采集过程中可能遭受的应激或意外截肢中恢复。

2. 再生

1. 选择第4刚节作为标准的截肢位点，以确保再生结果的一致性和成功率^7,9.
   注意： 截肢部位的选择在4处^th 基于初步研究结果。仅在必要时使用第10段，因其再生速度较慢。
2. 用4%（质量/体积）的六水合氯化镁（MgCl₂·6H₂O）溶于人工海水（ASW）中配制麻醉溶液（即每1 L ASW中加入4 g MgCl₂·6H₂O）。
3. 使用钝头棒从多毛类动物的前端开口插入，轻轻将其从管状结构中推出。
   注意： 避免在取出过程中损伤机体。
4. 然后将多毛类动物浸入麻醉溶液中，直至其完全放松并被固定（约15分钟）。
5. 在体视显微镜下使用无菌手术刀于第4刚节处进行截断，确保操作精确并尽量减少组织损伤（图1).
   注意： 操作手术刀时，务必穿戴适当个人防护装备，并注意避免割伤。
6. 用镊子将蠕虫的后部放回原来的管中，先插入前端，以促进其自然重新钻入。
7. 按照此操作步骤，每天观察线虫的行为变化和身体状况，包括感染迹象、组织退化或死亡情况。
   注意： 表现出异常行为、可见坏死或进行性恶化的个体被视为复苏失败，将被排除在进一步分析之外。
8. 在此阶段，由于前部截断导致口部区域缺失，需暂停喂食，直至再生进展至口部形成。待口部发育完成后，约截断后60天（p.a.），恢复正常的摄食行为。
   注意： 在整个再生过程中保持相同的环境条件（水体盐度范围为23–25 ppt，水温恒定为28 °C）。
9. 使用体视显微镜在再生后的特定时间点（再生后第1、6、15、30和60天）拍摄成功再生的多毛类动物图像。
10. 60 p.a. 后的完全再生监测

结果

对 D. claparedii 的再生过程进行连续监测，直至头部完全再生。整体再生模式与文献报道的 D. neapolitana 相似（图2）。截断部位的伤口闭合在截断后1天内（p.a.）完成。截断后第6天（p.a.），存活个体中已观察到界限清晰的胚基，表明组织再生活跃进行。在此阶段，约90%的个体表现出成功的形态学再生（Table 1）。大约在截断后第14至15天（p.a.），开始出现早期头部结构及新的体节雏形，此时85%的个体被归类为成功再生。再生过程随时间逐步推进，在截断后第30天和第60天，成功再生的个体比例分别约为85%和81%（Table 1）。口器结构在截断后第30天起在体表可见，但此阶段尚未观察到摄食行为。摄食行为首次记录于截断后第50天起，此时再生个体开始摄取粉末状食物。新再生的体节颜色明显较原始体节浅。定量再生结果基于存活率和形态学再生成功率（而非精确的体节数量统计）进行总结，详见表1，并包...

讨论

环节动物包含栖息于海洋、淡水和陆地环境的分节蠕虫，具有跨越多个生物学组织层次的惊人再生能力。这些能力包括细胞修复、生殖细胞更新、结构再生，以及在某些情况下，从小片段体节完全再生出整个身体^8,10。本实验方案重点研究 D. claparedii 的头部再生。

在多毛类动物研究中，通常采用体重、体长和体宽等指标来评估个体大小。然而，由于多毛类组织较为脆弱，在操作和样品处理过程中常发生身体断裂，因此基于个体大小的选择可能具有挑战性¹¹。本研究中，多毛类个体的选择依据为体长（5 cm），而非湿重，因为体长能更稳定且无创地反映个体大小。体长受短期生理波动的影响较小，且可在不引起额外应激或组织损伤的情况下快速测量，从而保持动物的存活能力和实验的完整性¹¹。相比之下，基于湿重的选择通常更适用于生长或生物量评估研究，且易受环境条件的显著影响

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人工海水	Instant Ocean
数字手持式盐度计	Scionix
MgCl2·6H2O	Sigma	M2670
手术刀
体视显微镜	Leica Microsystem
TeraBits 完整鱼粮	Tetra
镊子