使用经颅磁刺激对长期增强样皮质可塑性的标准化诱导和评估

近年来，经颅磁刺激 （TMS） 已成为一种非侵入性、经济高效且高效的技术，用于探测和调节人脑的神经活动¹。在各种刺激范式中，间歇性θ爆发刺激（iTBS）因其在人体运动皮层2中诱导长期增强（LTP）样可塑性的能力而受到广泛^关注。具体来说，iTBS 以 θ 间隔提供高频突发，模拟与突触可塑性相关的内源性 theta-gamma 耦合模式³。它通过激活N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）⁴诱导LTP样可塑性，从而缓解Mg²⁺阻滞并允许Ca²⁺进入突触后神经元⁵。这种 Ca²⁺ 流入触发下游信号级联反应，包括钙/钙调蛋白刺激蛋白激酶 II （CaMKII） 的激活，从而促进磷酸化⁶ 和 α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体 （AMPAR） 的插入，从而增强突触传递⁷。与其他非侵入性方法相比，例如重复经颅磁刺激 （rTMS） 或经颅直流电刺激 （tDCS），iTBS 可以以更短的刺激持续时间和更低的强度诱导 LTP 样皮质可塑性，使其成为受试者耐受性更好的选择 ^8,9,10.为了评估 iTBS 诱导的神经可塑性效应，研究人员通常测量通过肌电图 （EMG） 记录的运动诱发电位 （MEP） 幅度的变化，这反映了皮质脊髓兴奋性的增强¹¹。研究表明，这些MEP增强在刺激后可以持续长达60分钟，表明皮质兴奋性的瞬时但稳健的调节^10,12。由于其给药时间短且安全性良好，iTBS特别适合在实验和临床环境中重复应用¹⁰。具体来说，标准 iTBS 协议（600 个脉冲，192 秒）以及传统的 10 Hz rTMS 协议（1,200-1,500 个脉冲，15-20 分钟）可靠地诱导类似 LTP 样可塑性效应 ^8,13。因此，它越来越多地用于探测健康个体和患者群体的突触可塑性，为阿尔茨海默病 （AD）、中风和抑郁症等神经系统疾病中与可塑性相关的缺陷提供有价值的见解。

突触可塑性是神经可塑性的基本机制，是学习和记忆等关键过程的基础。它反映了大脑根据经验或环境刺激改变突触连接的强度和功效的能力¹⁴。在各种形式的突触可塑性中，LTP 是一种成熟的学习和记忆模型，通过增强突触传递¹⁵。越来越多的证据表明，LTP 样可塑性损伤与神经系统疾病（例如 AD¹⁶）的认知和行为缺陷密切相关。这些损伤可能反映了突触信号传导和可塑性相关分子途径的疾病特异性破坏，包括 LTP¹⁷ 诱导、表达或维持的改变。因此，理解和量化突触可塑性对于推进恢复认知功能、运动控制、感觉统合和情绪调节的治疗策略以及促进有效的神经康复至关重要。

虽然用于诱导 LTP 样可塑性的 iTBS 和用于评估皮质可塑性的单脉冲 TMS 等技术提供了令人兴奋的潜力，但它们的应用需要严格遵守标准化协议以确保准确性和可重复性。不一致的方法可能会导致可变性，从而可能影响研究结果的可靠性。此外，研究之间的方法学不一致，包括刺激强度、线圈定位和结果测量时间的差异，限制了 TMS 诱导的可塑性发现的可重复性。在实践中，iTBS通常在静息运动阈值（RMT）¹⁸的80%处给药，LTP样可塑性的可靠诱导进一步取决于精确的线圈定位，最常通过神经导航引导¹⁹实现。因此，本文旨在展示一种标准化的、神经导航引导的方案，用于通过 iTBS 诱导 LTP 样可塑性，然后使用单脉冲 TMS 评估皮质可塑性。本文的重点将放在实现皮质可塑性的精确可靠测量所需的基本技术程序和作注意事项上。

该方案由南京医科大学附属第一医院伦理委员会批准（编号：2023-SR-789），方案在中国临床试验注册中心注册（编号：ChiCTR2400082549）。所有程序均按照《赫尔辛基宣言》进行。在参加研究之前获得了书面知情同意书。

1. 同意程序

1. 在进行任何评估之前，请解释评估的目的、主要实验程序以及与研究相关的任何潜在风险因素。回答任何问题或疑虑。请求确认同意过程并在知情同意书上签名。
2. 不符合 TMS 安全标准构成排除的理由。提出以下问题并记录回答。对任何标准的回答是构成排除的理由：
   您是否有任何与 TMS 不兼容的金属植入物或设备（例如起搏器、人工耳蜗、动脉瘤夹）？
   您有癫痫或癫痫发作史，或有癫痫家族史吗？
   您目前正在服用任何可能诱发癫痫发作的药物吗？
   您是否有严重的认知或沟通缺陷，会妨碍参与研究？
   您是否患有严重的颈椎疾病（例如，颈椎狭窄或脊柱不稳定）？
   您在刺激区域是否有任何直接损伤或颅骨缺损？
   如果您是有生育能力的女性：您是否怀孕或可能怀孕？如果怀疑怀孕，请进行血液或尿液 HCG 检测并排除阳性病例。

2. 使用神经导航系统制备头部模型

1. 在整个协议中使用神经导航系统（版本 2.5.3.50294）来指导线圈定位、注册解剖标志、校准线圈，并在 RMT 确定和 iTBS 刺激期间保持一致的线圈放置。
2. 神经导航系统设置：使用该系统获得有关TMS线圈位置及其相对于解剖标志的对齐的实时视觉反馈，确保在功能识别对应于对侧目标肌肉的初级运动皮层（M1）中的运动热点时准确定位²⁰。
3. 建立三维 （3D） 头部模型：使用神经导航软件中提供的标准大脑模板或根据单个磁共振成像 （MRI） 扫描构建生成 3D 头部模型。通过选择单个 MRI 或标准模板模式，在轴向、矢状面和冠状面上记录解剖标志。进行头皮表面分割以生成三维头部模型。
4. 线圈校准
   1. 完成头部模型注册后，进行线圈校准，以确保神经导航系统内的精确实时跟踪。浏览TMS设置，单击 线圈选择>校准刀面。将配备反射标记的 TMS 线圈放在指定的校准块上。在软件引导下，将物理线圈上的基准点与校准块上的相应点对齐。
   2. 初始校准后，按照系统提示将线圈放置在校准块上以确认精度。单击校 准 以启动自动校准。仅接受空间误差低于 3 mm²¹ 的校准。否则，请执行重新校准。确保在整个 TMS 会话²² 中可以可靠地跟踪线圈的位置、方向和倾斜角度。

3、电机热点识别

1. 参与者定位：要求参与者坐在舒适的椅子上，并有背部和手臂支撑，以尽量减少头部和身体的运动。在手术过程中保持双手完全放松并静止。避免非目标手的移动，以免混淆测量结果。
2. 头部追踪设置：将红外反射标记连接到前额上，以便在训练期间实时跟踪头部位置。用粘性贴片固定标记，并确保它们被神经导航系统识别，由绿色标记表示（无法识别的标记显示为红色）。
3. 地标配准：使用跟踪指针依次标记头皮上的三个解剖标志：鼻侧、左侧上凹迹和右侧上悲上切迹。使神经导航系统能够在空间上与3D头部模型²³配准实际头部位置。
4. 头型取样：使用指针在头皮上收集大约 200 到 300 个额外的点，以提高配准准确性²⁴.允许软件基于这些点自动拟合个性化的头部形状模型，以优化MRI图像与实际坐标系²⁵之间的对齐。
5. 肌电图记录：将记录电极放在目标拇短展肌 （APB） 肌肉的腹部上，将参考电极放在拇指指间关节附近，相距约 2 厘米²⁶。以 100 kHz 的采样率记录 MEP，最小分辨率为 <0.2 μV，频率响应范围为 1-25 kHz，电极阻抗保持在 5 kΩ 以下。在继续之前，确保基线 EMG 信号显示最小噪声、稳定的波形并且没有明显的漂移或电干扰²⁷。
6. 确定电机热点
   1. 通过施用单脉冲 TMS（八字形线圈，70 毫米）相对于顶点²⁸ 横向约 5 厘米和前方 0-1 厘米来确定 M1 坐标，与目标肌肉相对，以引出最大 MEP 幅度，促进运动热点的精确定位。保持手完全放松，以避免可能干扰 MEP 测量的随意肌肉收缩。
   2. 将线圈的手柄向中线后方 45° 放置，以传输垂直于中央沟²⁹ 的电磁电流。以 1 秒的间隔围绕标记的 M1 区域在各个方向上系统地移动线圈，包括前部、后部、内侧和外侧³⁰，间隔^{5 秒 31}。将电机热点定义为在松弛的APB³²中产生最大MEP幅度的站点。
7. 电机热点标记：一旦识别出功能定义的电机热点，请立即在神经导航系统中进行标记。标记后，允许系统自动记录关键空间参数，包括线圈与目标点之间的距离、倾斜偏差和旋转偏差。使用这些指标来确保在整个刺激过程中精确且可重复的线圈放置³³。

4. RMT测定

1. 使用表面肌电图数据测量峰峰值幅度以获得 MEP，应用与步骤 3.5 中描述的相同的肌电图设置和参数。将 RMT 定义为在十次连续单脉冲 TMS 试验中至少有五次中引发峰峰值幅度大于 50 μV 的 MEP 的最小刺激强度²⁸。

5. 类似 LTP 的可塑性的评估

1. 基线评估：在运动热点以 5 秒的间隔记录 20 个连续的 TMS 诱发 MEP。将MEP的刺激强度设置为120% RMT，这会唤起大约1 mV³⁴的MEP。
2. 诱导 LTP 样可塑性：使用 TMS 设备（8 字形线圈，70 毫米）提供刺激。以 80% RMT 的强度在电机热点上应用 iTBS，以诱导类似 LTP 的可塑性。使用iTBS协议，该协议由以50 Hz的三个刺激爆发组成，以5 Hz重复。重复该脉冲刺激的2秒序列，然后休息8秒，总共200秒（600个脉冲）¹⁰。
3. 可塑性评估：在 iTBS 干预后 5 分钟、10 分钟、15 分钟和 30 分钟使用相同的刺激强度 （120% RMT） 记录 20 个 MEP 以评估可塑性³⁵。
4. 类似 LTP 的可塑性量化：计算在每个时间点（基线、iTBS 后 5 分钟、10 分钟、15 分钟和 30 分钟）记录的 20 个 MEP 的平均峰峰值幅度，以定量反映皮质兴奋性³⁶。刺激后 MEP 幅度表示为相对于基线的标准化比率，以标准化跨会话和个体的兴奋性测量。结果是iTBS后最终时间点的原始MEP振幅和归一化MEP振幅，代表治疗效果³⁷。
5. 计算每个时间点的归一化 MEP 幅度如下：
   
   将总体平均归一化 MEP 值 >1.1 为促进，<0.9 为抑制，0.9 至 1.1 在每个 iTBS 条件后均为不变的个体³⁸。

在演示过程中，使用神经导航系统来引导 TMS 线圈在电机热点上的准确定位，提供实时空间反馈并最大限度地减少线圈放置的可变性。TMS 设备（8 字形线圈，70 毫米）在整个疗程中提供刺激。为了说明该过程，下面给出了一位参与者的代表性结果。记录的 MEP 幅度在单脉冲试验中表现出稳定且一致的响应，反映了由神经导航引导的线圈放置提供的稳定性。iTBS 后 MEP 振幅随时间变化的增加表明 LTP 样可塑性。可以通过比较基线和刺激后的原始MEP振幅和归一化的MEP振幅，以及将个体反应分类为促进，抑制或不变来分析数据。总体而言，这些代表性结果表明，所描述的方案能够准确地定位运动热点，可重复的刺激，以及刺激诱导的LTP样可性变化的定量评估。

神经导航系统设置和定位

执行神经导航系统设置和定位程序，以识别和记录轴向、矢状面和冠状面的单个解剖标志，包括鼻部、左侧上切迹和右侧上侧切迹。这些地标可作为后续创建个性化 3D 头部模型的基准参考，确保解剖结构和刺激目标之间的准确共配准（图 1）。通过识别头皮上相同的三个解剖标志来初始化空间配准。该系统提供有关线圈位置及其相对于目标肌肉对侧 M1 内预定义刺激部位的对齐的实时视觉反馈，确保刺激准确地传递到目标皮质区域。

图 1：地标注册。 使用神经导航系统识别参与者颅骨上的解剖标志，以实现准确的空间配准。 请点击此处查看此图的大图。

建立3D头部模型

根据神经导航配准和头皮表面采样生成参与者头皮的个性化 3D 头部模型。解剖标志和头部形状对齐期间的平均配准误差低于 1.5 毫米，从而能够在整个刺激过程中精确放置线圈（图 2）。

图 2：3D 头部模型构建。 基于神经导航配准和头皮表面采样的重建 3D 头部模型的可视化，允许在刺激过程中进行精确的线圈跟踪和皮质映射。 请点击此处查看此图的大图。

识别电机热点

通过用 TMS 刺激大脑并记录 MEP，基于 TMS 诱发的 MEP 进行功能识别运动热点。产生最强响应的部位被定义为电机热点（图 3）。

图 3：电机热点定位。 实时显示与目标 APB 的运动热点相对的目标肌肉对侧 M1 上的刺激部位。 请点击此处查看此图的大图。

确定 RMT

RMT 是使用单脉冲 TMS 确定的。根据标准RMT定义28，RMT是最低刺激强度，在10次连续试验中至少有5次观察到峰峰值幅度为>50μV的MEP，确保TMS刺激高于有效运动激活的阈值（图4）。

图 4：RMT 测定。 在 RMT 评估期间从目标 APB 记录的代表性 MEP 波形。数字 1-10 表示连续 10 次单脉冲 TMS 试验。 请点击此处查看此图的大图。

基线测量

在 iTBS 之前，通过在已识别的运动热点上以 120% RMT 和 5 秒间隔提供 20 个单脉冲 TMS 刺激来评估皮质脊髓兴奋性（图 5）。

图 5：基线 MEP。 在松弛条件下，通过单脉冲TMS以120% RMT从目标APB中引出20个具有代表性的MEP。 请点击此处查看此图的大图。

LTP样可塑性的诱导

iTBS 协议以单个 RMT 的 80% 提供，使用 50 Hz 的三个脉冲突发以 5 Hz 重复（200 秒内 600 个脉冲）。刺激器模式日志证实，所有会话都不间断地提供了计划的脉冲计数，并且输出强度始终保持稳定。

类似 LTP 的塑性量化

应用iTBS协议后，在多个时间点（例如，5分钟，10分钟，15分钟和30分钟）记录MEP振幅，以观察皮质兴奋性随时间的变化（图6）。

图 6：iTBS 后 MEP。 在 iTBS 后 （A） 5 分钟、（B） 10 分钟、（C） 15 分钟和 （D） 30 分钟，以 120% RMT 从目标 APB 记录来自一名参与者的代表性 MEP。每个面板显示 20 个波形，说明幅度与时间相关的调制。 请点击此处查看此图的大图。

原始 MEP

为了量化兴奋性变化，在基线和每个刺激后时间点计算平均峰峰值MEP振幅（图7）。

图 7：平均 MEP 振幅。 在基线时以及代表参与者的 iTBS 后 5 分钟、10 分钟、15 分钟和 30 分钟记录平均 MEP 振幅。每个数据点代表 20 个单脉冲 TMS 刺激的平均值，误差线表示标准差 （SD）。 请点击此处查看此图的大图。

标准化 MEP

每个刺激后时间点的 MEP 振幅归一化为基线。MEP幅度随时间变化的增加和随后的下降反映了类似LTP可塑性的特征（图8）。

图 8：归一化平均 MEP 幅度。 在代表性参与者的 iTBS 后 5 分钟、10 分钟、15 分钟和 30 分钟，MEP 振幅归一化为基线值（后/基线比率）。 请点击此处查看此图的大图。

在刺激后的最初几分钟内观察到 MEP 振幅显着增加，反映出皮质脊髓兴奋性的短暂增强。随着时间的推移，这种增强逐渐下降。根据预定义的分类标准38 （归一化 MEP 值 >1.1 为促进，<0.9 为抑制，0.9 至 1.1 之间为不变），代表性参与者被归类为促进，所有刺激后时间点（5 分钟、10 分钟、15 分钟和 30 分钟）的平均归一化 MEP 值超过 1.1。这种时间依赖性调制通常被解释为类似 LTP 可塑性的表现。

根据这项工作，作者没有竞争的经济利益或其他利益冲突。