从猪肠道组织中，对窝穴和间充质间质细胞进行优化顺序分离

Summary

本研究提供了逐步分离猪空肠组织肠道隐窝和肠间充质间质细胞（iMSCs）的方案。该方法生成二维肠样单层和iMSCs，适合开发可重复且生理相关的上皮-基质共培养模型，以研究肠道稳态和再生过程中的细胞串扰。

Abstract

肠道上皮与下方的肠道间充质间质细胞（iMSCs）密切相互作用，调节发育、稳态和再生。然而，从猪组织中顺序分离上皮和基质分段的标准化方法有限。该协议描述了一种优化的分步过程，用于将同一无肠小猪段的crypt和iMSCs分离出来。该方法使用基于乙二胺四醋酸/二硫糖醇（EDTA/DTT）的解离缓冲液释放隐孔，随后通过胶原酶/分散酶消化细胞外基质以分离iMSCs。这种方法最大限度地减少了隔离单元的空间变化。分离的窝穴成功培养，形成了典型的扩展性二维（2D）肠单层，覆盖胶原水凝胶板。培养的iMSCs结合培养瓶，并通过免疫染色表达基质标志物如血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）和分化簇81（CD81）。总体而言，这一优化分离方案从同一小猪空肠段产出了上皮细胞和基质细胞，为未来涉及肠道类器官和iMSC共培养系统的研究提供了可重复的基础，旨在阐明猪上皮-基质相互作用的控制机制，成为复制人类生理学和推动动物科学发展的翻译相关模型。

Introduction

肠道上皮是一种动态组织，持续自我更新和分化，以维持肠道稳态并促进黏膜损伤后的再生 ^1,2。肠道上皮细胞起源于肠道干细胞（ISCs），它们与多种微^{环境因子3、4、5、6、7、8}相互作用。上皮下区室，主要是固有层和黏膜肌，由不同谱系的多样细胞群组成⁹.在这些细胞群体中，肠道间充质间质细胞（iMSCs），包括成纤维细胞和肌纤维母细胞，产生营养和生长因子，调节ISC干的生长、增殖和分化，以调节上皮稳态^和再生6,7,10,11。

为了研究这些细胞相互作用，近期研究开发了新方法，揭示驱动肠道上皮细胞与iMSC交互作用的可能机制。将类器官与基质细胞或免疫细胞结合的共培养系统，推动了我们对上皮-上皮下细胞在发育、再生、药物筛选及疾病建模过程中相互作用的理解，12,13,14,15,16,17。然而，大多数类器官共培养研究使用了小鼠组织，这些组织往往无法有效模拟人体生理和疾病表型，限制了其临床转化相关性¹⁸。

在大多数小鼠肠道分离方案中，上皮细胞和基质细胞分别取自不同的组织片段，这可能产生反映略微特征的样本，可能影响实验间的重复性^19,20。目前，尚无统一优化的方案用于从同一组织样本中分离猪肠道窝和iMSCs。此外，获取合适人肠样本的实际局限性使许多研究者依赖不同器官（如具有皮肤成细胞的人类肠）不匹配的细胞类型来评估上皮-间充质细胞交叉，这可能干扰数据解释（21,22,23）。

尽管最近发表的一项人类肠道活检方案通过残留上皮枯竭组织的生长分离出了窝穴并获得成纤维细胞，但猪中缺乏类似的标准化方法²⁴。由于猪在解剖和生理学上与人类相似，被用作转化研究的合适动物模型 2,18,25,26,27,28,29。因此，该方法采用了一种顺序分离协议，基于肠道的生理、解剖和形态结构，从同一猪空肠节段回收肠道隐窝和iMSCs^。该程序为分离未来猪肠道共培养研究的隐穴和iMSCs提供了可重复的框架。

Protocol

从马里兰大学学院公园分校猪舍中切除的21天大幼猪近端空肠中解剖了一段5厘米的片段。用于宰牲幼猪的程序（R-6月22日）遵循了大学机构动物护理与使用委员会批准的动物护理和使用政策指南。在进行分离步骤之前，协议概要见 图1，用于顺序分离猪肠道隐穴和iMSCs的试剂和设备列表见 材料表。

1. 隔离前准备阶段

1. 准备每5厘米组织段30毫升洗涤液，置于50毫升锥形管中。
2. 根据采集的组织样本数量调整体积。
   注意：请查看 表1 上的洗涤缓冲剂成分。所有组织制备和细胞分离步骤均在工作台上完成。

2. 肠道组织准备阶段

1. 将切除的肠组织放入30毫升的洗涤液中，置于50毫升锥形管中。
   注意：切除的组织可在使用前放入冷水冲洗缓冲液中一小时。
2. 用21克注射器用冷却洗涤液冲洗3×小时，去除腔内成分。
3. 将组织放置在消毒过的聚苯乙烯泡沫表面上，小心地将肠系膜和脂肪组织从浆膜中取出。
4. 用手术刀纵向解剖组织，打开腔内（图2A）。
5. 将部分清理后的解剖组织转移到新鲜的洗涤液中，洗涤两次，或直到缓冲液变透明。
6. 将组织放入100毫米培养皿的洗涤缓冲液中，用新的手术刀片切成10-15毫米的片（图2B，C）。这一步增加了暴露于消化缓冲液的表面积。
7. 将切碎的组织转移到新的50毫升锥形管中。
8. 用洗涤缓冲液轻轻清洗，让碎碎组织通过重力沉降约30秒（见图2D）。
9. 轻轻吸取上清液，只留足够的缓冲液覆盖锥形管内的组织碎片。
10. 上皮解离阶段
    1. 加入30毫升预热上皮解离缓冲液（见表2），在37°C的静态珠浴或约9× 克的摇晃水浴中孵育20-30分钟。
    2. 每15分钟轻轻摇晃管子，以增加窝穴从上皮膜的释放。
    3. 让组织沉降，并用血清学移液器轻轻吸取上清液，只留足够的缓冲液覆盖锥形管内的沉积组织。
    4. 向沉积组织加入30毫升新鲜洗涤液，用力摇晃以释放绒毛、窝穴和杂质（见图3A）。让组织残留物沉淀，然后轻柔地将含有隐穴段的洗涤缓冲液上清液通过100微米的细胞滤网，倒入一个新的50毫升锥形管中。
       1. 重复添加新鲜洗涤缓冲液到残留组织中并倒出三次（3×）。将含有隐穴的10微升洗涤缓冲液移入100毫米培养皿，在立体显微镜下检查隐窝密度。
          注意：每次洗涤后，每个洗刷缓冲区都包含地穴。
    5. 第三次洗涤后，包含墓穴的洗涤缓冲区应保持清澈，杂质极少（见图3B）。
       注意：将带有细胞外基质（ECM）的组织残余保存在锥形管内，以便后续的iMSC分离处理。
    6. 在室温下以150× 克 离心分离地穴悬浮液2分钟，以沉淀地窖碎片。
    7. 抽吸并重新悬浮于上皮培养基中。
    8. 再次以150× 克 离心分离，收集墓穴碎片颗粒。
    9. 加入上皮培养基以重新悬浮巢穴，并用1000微升移液器尖端移液5×。
    10. 将约100个重新悬浮的隐穴种子到预先制备的胶原蛋白1型水凝胶涂层6孔板上，培养并扩展为二维（2D）肠状单层。
        注意：请查看 表3中的胶原水凝胶涂层平板制备。最终胶原蛋白1型浓度应为1.0 mg/mL。避免对过密的墓穴或碎屑进行镀层，以防止酵母菌或真菌污染。在洗涤液和培养基中加入抗生素-抗真菌（anti-anti）应提供保护。
    11. 在37°C加湿的5%二氧化碳培养箱中培养前，先在倒相对比显微镜下观察细胞。
    12. 播种后12小时内更换培养基，以去除漂浮的杂质并减少细菌污染。
    13. 使用上皮培养基（表4）培养肠类菌株，并每隔一天更换培养基，直到约第8天，扩展后的二维单层达到≥85%汇合度进行亚培养。
11. 细胞外基质解离阶段
    注意：继续分离过程，使用含有细胞外基质的剩余组织片段（见图3C 和 图4A）。
    注意：虽然上皮解离缓冲液中的EDTA可以抑制胶原酶活性，但前三个洗涤步骤已去除所有EDTA和DTT。因此，胶原酶活性在后续过程中不应受到影响。
    1. 将剩余组织再次切碎为小块，然后分离本有层的iMSCs。
    2. 向组织中加入25毫升细胞外消化缓冲液（见表5），并在静态珠浴中37°C下孵育15-20分钟（见图4B）。
    3. 孵化后用力摇晃。
       注意：上清液会变得浑浊，漂浮组织碎片减少。在倒置显微镜下移液10微升，检查上清液中iMSC的密度。如果观察到的iMSC密度较低，继续在珠浴中孵育15分钟。
    4. 在步骤2.2.3剧烈摇晃后，轻轻将上清液通过100微米的细胞筛过滤到新的锥形管中，以减少杂质。
    5. 在室温下以280× 克 离心分离细胞悬浮液5分钟，沉淀iMSCs。
    6. 抽取上清液，并将iMSCs重新悬浮到间充质培养基中（见 表6中的iMSC培养基）。
    7. 再次以280× 克 离心分离分离，去除解离缓冲液。
    8. 在间充质培养基中抽吸并重新悬浮iMSCs。
    9. 将iMSCs置于T75培养瓶中，每个瓶约5个5个细胞×10个⁵ 细胞。
       注意：确保镀层细胞覆盖烧瓶表面面积约60%，因为间充质细胞需要中等至较高的播种密度以实现最佳生长。
    10. 在电镀后12小时内更换培养基，以去除多余的杂质并防止细菌污染。
    11. 在播种后第2天，用倒置相对比显微镜观察类成纤维细胞。
        注意：间充质培养基应隔天更换一次。iMSC应达到约85%的汇合度，并在第4天准备进行亚培养。

3. 免疫细胞化学测定

1. 在96孔板中用间充质培养基培养约5,000个iMSCs，培养2-3天，直到细胞达到约80%的汇合度。
2. 在室温³¹下，轻轻抽吸培养基，并用100微升1×PBS每孔冲洗两次培养的iMSCs。所有关于免疫染色试剂盒的相关资料均见 材料表。
3. 每孔加入100微升4%对甲醛（PFA）固定培养的iMSCs，并在室温静态台面上培养30分钟。
4. 用100微升0.1% Tween-20/PBS（PBST）洗涤固定培养的iMSC两次，每次5分钟，然后用100微升0.5% Triton X-100/PBS渗透30分钟。
5. 每孔添加100微升5%牛血清白蛋白（BSA）/PBST，以阻断固定细胞上的非特异性结合。
   注意：在室温下放置1小时后，用100微升PBST洗涤两周，每次5分钟。
6. 每个孔槽加入100微升稀释的一级抗体（1：250;即1微升一级抗体溶于250微升抗体稀释剂中），并在4°C下培养细胞过夜。 主要抗体为PDGFRα和CD81。
   注意：仅添加抗体稀释剂，不添加原抗，包含阴性对照井。
7. 第二天，用100微升PBST冲洗一次原抗，每次5分钟。
8. 将二级抗体稀释于1×PBS，使用以下比例：Alexa Fluor Plus 555（1 μL：100 μL）、Alexa Fluor Plus 647（1 μL：100 μL）和DAPI（1 μL：800 μL）。
9. 用稀释的二级抗体在室温下对细胞进行反染1小时。
10. 用1×PBS清洗细胞两遍，每次5分钟。
11. 每孔加入100微升装载介质，覆盖板材，用铝箔包裹，在4°C下保存长达6个月，直到荧光成像。

4. RNA分离与qPCR测定

1. 利用酸性硫氰酸镍-酚-氯仿分离技术，从T75瓶中培养的iMSCs中提取总mRNA。
   注意：使用分光光度计测定RNA浓度和纯度。
2. 将总mRNA逆转录为cDNA，作为定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）测试的模板，以验证选定的Sus scrofa基因引物GAPDH（前向：ATCCTGGGTACACTGAGGAC;反向：AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG），如^{先前研究所述2,28}。

Results

在上皮解离过程中，乙二胺四醋酸（EDTA）螯合钙离子以破坏钙依赖性细胞间粘连，而二硫糖醇（DTT）则切断黏蛋白糖蛋白中的二硫键以促进黏液溶解。因此，螯合化合物（EDTA）和还原剂（DTT）的结合使用，使得隐穴能够有效释放上皮膜，同时不破坏细胞外基质（ECM）结构 ^2,32（见图3）。隐室成功从上皮层释放，ECM干扰极小（见图3B，C）。在肠上皮培养基中培养时，分离的窝体附着并扩展为胶原蛋白包覆水凝胶表面的肠状单层，培养基每隔一天更换一次（见图5A）。胶原水凝胶为肠道小肠单层提供必要的结构支持，重现体内结构组织，并模拟上皮生长所需的结构。

同时，利用含有胶原酶和分散酶的缓冲液解离的肠间质间质细胞（iMSCs）从ECM中释放出来（

Discussion

从同一猪空肠段分离出肠道隐窝和iMSCs，为保存组织片段特异性细胞和功能特性提供了新方法。这很重要，因为肠道组织具有区域性和空间特征，正如之前^猪研究2,36,37,38所示。此前在猪或其他物种中的类器官研究依赖于从某一节段分离出的窝穴和远处区域或生长培养的成纤维细胞，存在风险不匹配或生理上独特的微环境生态位^24,28,33,35。该方法通过精确控制化学、酶和机械消化过程，针对空肠黏膜解剖层，成功实现序列分离^30,39...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5万EDTA	普罗梅加	PR-V4231
1 M HEPES缓冲器	热扑鱼	15630080	用于胶原水凝糖板的制备
1000 uL 吸管头	碱科学FT1000	104027-530
10倍PBS	Invitrogen	AM9624	用于胶原水凝糖板的制备
1N氢氧化钠	热力学	SS266-1	用于胶原水凝糖板的制备
1x HBSS	热扑鱼	14025092
1X PBS	羟基隆	SH30256FS
4%对甲醛（PFA）	热扑鱼	AAJ61899AK
50毫升锥形管	热扑鱼	12-565-271
6孔板	费舍尔布兰德	FB012927
7.5%碳酸氢钠溶液	科宁	MT25035CI	用于胶原水凝糖板的制备
高级DMEM/F12	Gibco	12634-010
Alexa fluor plus 647	Invitrogen	A32728	二级抗体
Alexa加555 - A32732	Invitrogen	A32732	二级抗体
铝箔	雷诺兹	https://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1
反反	吉布科	15240096
B27	热扑鱼	12587010
BSA	费舍尔布兰德	BP1600-100
CD81	蛋白质技术	66866-1-ig	一级抗体
细胞培养级水	羟基隆	SH30529FS	用于胶原水凝糖板的制备
胶原蛋白，1型	科宁	356236	用于胶原水凝糖板的制备
胶原酶IV	吉布科	17104019
康宁100毫米培养皿	科宁	07-202-011
低温电阻电池低温保存介质	干细胞技术	7930
细胞的冷凝膜	费舍尔布兰德	1050026
Dako抗体稀释剂	达科/安捷伦	部件编号：S302283-2	一级抗体稀释剂
Dako荧光安装介质	达科/安捷伦	部件编号：S302380-2
达皮	Promocell/VWR	10180-470	DNA染色
消散二号	罗什	4942078001
DMEM，高血糖	科宁	MT10013CV
数字地面电视	西格玛	646563
EGF	Peprotech	315-09
FBS（夏威夷）	前卫	1300-500H
胃素	阿纳斯佩克	AS-64149
庆大霉素	MP生物医学	ICN1676045
谷氨酸极限	热扑鱼	35050061
天哪	热扑鱼	15630-080
倒置荧光微镜	尼康	ECLIPSE Ti2	荧光成像
倒置相差显微镜	尼康	日蚀TS100	对于培养细胞成像
iScript高级cDNA合成套件	生物辐射	1725038	RT-PCR试剂盒
iTaq 通用 SYBR 绿色超级混音	生物辐射	1725122	qPCR试剂盒
LWRN 条件媒体	空军交通管制委员会	CRL-3276	LWRN媒体根据ATCC程序在内部准备
N-乙酰半氨酸	议员简介	194603
纳米滴2000分光光度计	热扑鱼	ND 2000
烟酰胺	西格玛	N0636-100G
带条形码的光学384孔板	应用生物系统	4483285	qPCR试剂盒
PDGFRα	阿布卡姆	AB230457	一级抗体
前列腺素E2（PGE2）	开曼化工	14010
QuantStudio 5	应用生物系统	A28570	qPCR仪器
SB202190	LC实验室	S-1700
立体显微镜	尼康	SMZ745
T 75 烧瓶	费舍尔布兰德	FB012937
特里顿X100	费舍尔布兰德	PI85111
三唑试剂	Invitrogen	15596026
二十岁以上，100%非离子洗涤剂	生物辐射	1706531
Y27632	ApexBio	A3008-200