一种优化的从猪肠道组织中连续分离隐窝和间充质基质细胞的方法

摘要

本研究提供了一种从猪空肠组织中依次分离肠隐窝和肠间充质基质细胞（iMSCs）的逐步实验方案。该方法可获得适用于建立可重复且具有生理相关性的上皮-基质共培养模型的二维肠类器官单层细胞和iMSCs，用于研究肠道稳态和再生过程中的细胞间相互作用。

摘要

肠上皮与下方的肠道间充质基质细胞（iMSCs）密切相互作用，以调控发育、稳态及再生过程。然而，目前尚缺乏标准化的方法，能够从猪组织中依次分离上皮和基质组分。本实验方案描述了一种优化的分步流程，可从同一段仔猪空肠组织中同时分离隐窝和iMSCs。该方法首先使用基于乙二胺四乙酸/二硫苏糖醇（EDTA/DTT）的解离缓冲液释放隐窝，随后通过胶原酶/分散酶消化细胞外基质以分离iMSCs。该策略可最大限度减少所分离细胞的空间差异。分离获得的隐窝成功实现了体外培养，并在包被胶原水凝胶的培养板上形成典型的二维（2D）扩展型肠类器官单层结构。培养的iMSCs可贴附于培养瓶表面，并通过免疫染色证实其表达血小板源性生长因子受体α（PDGFRα）和分化簇81（CD81）等基质细胞标志物。总体而言，该优化的分离方案可从同一仔猪空肠节段中同时获得上皮细胞和基质细胞，为未来开展涉及猪肠类器官与iMSC共培养系统的研究提供了可重复的基础，有助于阐明调控猪体内上皮-基质相互作用的机制。猪是模拟人类生理功能和推动动物科学发展的具有转化相关性的模型动物。

引言

肠上皮是一种动态组织，通过持续的自我更新和分化来维持肠道稳态，并在黏膜损伤后促进再生^1,2。肠上皮细胞起源于肠干细胞（ISCs），并与多种微环境因素相互作用^3,4,5,6,7,8。上皮下区域主要由固有层和黏膜肌层组成，包含来自不同谱系的多种细胞群体⁹。在这些细胞群体中，肠源性间充质基质细胞（iMSCs），包括成纤维细胞和肌成纤维细胞，可产生营养因子和生长因子，调控ISC的干性、增殖和分化，从而调节上皮稳态与再生^6,7,10,11。

为了研究这些细胞间的相互作用，近期研究....

方案

从位于马里兰大学帕克分校养猪设施中饲养的21日龄仔猪的切除近端空肠中，截取一段5 cm长的肠段。用于处死仔猪的实验程序（编号：R-JUN-22-30）遵循该校机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）批准的动物护理与使用政策指南。在开始分离操作之前，图1展示了本实验方案的流程概要，用于猪肠道隐窝和iMSCs顺序分离的试剂与设备清单见《材料表》。

1. 分离前准备阶段

1. 每5 cm组织片段，在50 mL锥形管中准备30 mL洗涤缓冲液。
2. 根据所采集的组织样本数量调整体积。
   注意：洗涤缓冲液的成分见表1。所有组织处理和细胞分离步骤均在台面上进行。

2. 肠道组织制备阶段

1. 将切除的肠组织放入含有30 mL洗涤缓冲液的50 mL锥形管中。
   注意：切除的组织可在使用前置于冷洗涤缓冲液中保存1小时。
2. 冲洗组织3次× 使用预冷的洗涤缓冲液和21 G注射器去除管腔内容物。
3. 将组织置于无菌的聚苯乙烯泡沫表面，小心去除浆膜....

结果

在上皮细胞解离过程中，乙二胺四乙酸（EDTA）通过螯合钙离子破坏钙依赖性细胞间黏附，而二硫苏糖醇（DTT）可切断黏蛋白糖蛋白中的二硫键，促进黏液溶解。因此，联合使用螯合剂（EDTA）和还原剂（DTT）可在不破坏细胞外基质（ECM）结构的前提下，有效释放隐窝结构^2,32 (图3）。隐窝成功从上皮层释放，且细胞外基质（ECM）破坏极小（图 3B，C）。在肠道上皮细胞培养基中培养时，分离的隐窝会附着于胶原蛋白包被的水凝胶表面，并扩展形成肠类器官单层，每隔一天更换一次培养基（图5A）。胶原蛋白水凝胶为肠道类器官单层结构提供了必要的结构支撑，重现了 体内 结构组织及模拟上皮生长所需的架构。

同时，使用含有胶原酶和分散酶的缓冲液解离肠源性间充质基质细.......

讨论

从同一段猪空肠组织中分离肠隐窝和肠间充质干细胞（iMSCs），为保留组织片段特异性的细胞特征和功能特性提供了一种新颖的方法。这一点至关重要，因为肠道组织具有区域性和空间特异性，此前的猪研究已对此有所证实^2,36,37,38。以往在猪或其他物种中开展的类器官研究，通常依赖于从一个肠段分离隐窝，同时从远端区域或外植体培养中获取成纤维细胞，这种方法存在微环境生态位不匹配或生理特性差异的风险^24,28,33,35。本方法通过精确控制化学、酶解和机械消化过程，针对空肠黏膜解剖结构的各层组织，实现了成功的分步分离

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA	Promega	PR-V4231
1 M HEPES 缓冲液	ThermoFisher	15630080	用于胶原蛋白水凝胶板的制备
1000 µL 移液器吸头	Alkali Scientific FT1000	104027-530
10x PBS	Invitrogen	AM9624	用于胶原蛋白水凝胶板的制备
1 N 氢氧化钠	Thermo	SS266-1	用于胶原蛋白水凝胶板的制备
1x HBSS	ThermoFisher	14025092
1X PBS	Hyclone	SH30256FS
4% 多聚甲醛（PFA）	ThermoFisher	AAJ61899AK
50 mL 圆锥形离心管	ThermoFisher	12-565-271
6 孔板	Fisherbrand	FB012927
7.5% 碳酸氢钠溶液	Corning	MT25035CI	用于胶原蛋白水凝胶板的制备
Advance DMEM/F12	Gibco	12634-010
Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32728	二抗
Alexa Plus 555 - A32732	Invitrogen	A32732	二抗
铝箔	Reynolds	https://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1
ANTI-ANTI	Gibco	15240096
B27	ThermoFisher	12587010
BSA	Fisherbrand	BP1600-100
CD81	Proteinintech	66866-1-ig	一抗
细胞培养级水	Hyclone	SH30529FS	用于胶原蛋白水凝胶板的制备
胶原蛋白 I 型	Corning	356236	用于胶原蛋白水凝胶板的制备
胶原酶 IV	Gibco	17104019
Corning 100 mm 培养皿	Corning	07-202-011
Cryostor 细胞冻存培养基	Stemcell Technologies	7930
细胞冻存管	Fisherbrand	1050026
Dako 抗体稀释液	Dako/Agilent	部件编号：S302283-2	一抗稀释液
Dako 荧光封片介质	Dako/Agilent	部件编号：S302380-2
DAPI	Promocell/VWR	10180-470	DNA 染色
Dispase II	Roche	4942078001
DMEM，高糖	Corning	MT10013CV
DTT	Sigma	646563
EGF	Peprotech	315-09
FBS（热灭活）	Avantor	1300-500H
胃泌素	Anaspec	AS-64149
庆大霉素	MP Biomedicals	ICN1676045
GlutaMax	ThermoFisher	35050061
HEPES	ThermoFisher	15630-080
倒置荧光显微镜	Nikon	ECLIPSE Ti2	荧光成像
倒置相差显微镜	Nikon	Eclipse TS100	用于培养细胞的成像
iScript Advanced cDNA 合成试剂盒	Bio-Rad	1725038	RT-PCR 试剂盒
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725122	qPCR 试剂盒
LWRN 条件培养基	ATCC	CRL-3276	LWRN 培养基根据 ATCC 操作规程在本实验室制备
N-乙酰半胱氨酸	MP Bio	194603
Nanodrop 2000 分光光度计	ThermoFisher	ND 2000
烟酰胺	Sigma	N0636-100G
带条形码的光学 384 孔板	Applied Biosystems	4483285	qPCR 试剂盒
PDGFRα	Abcam	ab230457	一抗
前列腺素 E2（PGE2）	Cayman Chemical	14010
QuantStudio 5	Applied Biosystem	A28570	qPCR 仪器
SB202190	LC Laboratories	S-1700
体视显微镜	Nikon	SMZ745
T75 培养瓶	Fisherbrand	FB012937
吐温 X100	Fisherbrand	PI85111
Trizol 试剂	Invitrogen	15596026
吐温 20，100% 非离子型去污剂	Bio-rad	1706531
Y27632	ApexBio	A3008-200