EasyFiji：斐济用户友好荧光图像处理的图形界面

Summary

EasyFiji 是斐济（ImageJ）的图形用户界面插件，提供一套精心策划的荧光图像可视化和处理工具，生命科学家们经常使用。

Abstract

斐济（Fiji is Just ImageJ）是一个广泛且可扩展的开源图像处理软件，广泛被生物图像分析社区使用。然而，对于非计算生命科学家来说，手动作斐济的众多功能需要学习并作一个层层叠叠的菜单系统。此外，某些命令的默认行为并不适合荧光图像的显示和处理。为了提高处理荧光显微镜图像的生命科学家效率，我们开发了EasyFiji，一款为斐济精心设计的图形用户界面（GUI）插件。每个EasyFiji命令都通过工具提示增强的按钮和滑块执行，并且始终具备特定通道的执行，以满足荧光图像的需求。改变像素强度的命令也可单击不可执行，以实现更交互的处理，并可自动录制并保存为文本以便记录。图像信息面板显示了对图像解读至关重要的设置。还提供了新的图像渲染和漂白校正功能。该插件可在GitHub免费获取，并作为斐济更新网站发布。该协议概述了使用 EasyFiji 接口进行荧光显微镜图像可视化和处理的步骤。

Introduction

斐济（斐济仅为ImageJ）是一个广泛且可扩展的开源图像处理软件包，被生物图像^{分析社区广泛}采用，^1,2。斐济庞大的通用算法代码库，加上宏语言和插件接口，计算分析师可以轻松利用，为几乎所有图像处理或分析问题提供解决方案。然而，对于计算经验较少的生命科学用户来说，FIJI >1100条命令分布在深度层叠的下拉菜单系统中，可能极其复杂，难以有效导航和有效利用。为了简化斐济的人工使用，已经采取了多种方法。斐济的搜索栏是菜单导航的替代方案，提供优质的帮助文档，但前提是用户必须知道所需算法的名称。斐济的工具栏按钮可以定制，以快速访问用户自定义命令，但这一过程需要编写宏代码并提前判断哪些命令最有用。ActionBar插件提供了一个独立的图形用户界面（GUI）窗口，配有可自定义和组织的按钮数组，但同样需要编码和经验^{才能有效填充}按钮。这些解决方案都无法满足缺乏图像处理经验的生命科学家的需求。

除了用户界面问题外，许多从事荧光显微镜图像研究的生命科学家还需要针对通道的显示和处理程序。然而，一些常用的斐济命令默认不具备通道感知功能。例如，用户可能希望以同样显著的方式将伪彩色通道一起渲染，或专门突出通道间强度相近的区域，或者在同时显示荧光的同时保持形态信号的灰度对比度。在这些应用场景中，斐济的RGB复合渲染技术在感知层面遮蔽了所需信息。在处理多通道图像时，本地斐济图像滤镜（即 Process |过滤器），要么只处理活跃的二维位平面，要么处理图像窗口中的所有位平面（即由类 ImageStack 定义的“栈”）。第一种行为在给定通道的z维或t维上无法处理，而第二种行为几乎总是不正确，因为每个通道包含独特的染色图案和信噪比，需要使用通道特定的处理参数。斐济土著漂白剂纠正指令（图片 |调整 |漂白校正）在多通道荧光图像上应用时作用不正确，因为它们同样是在整个ImageStack中进行纠正，通道数据是交错的，而不是在每个通道内的z维或t维度上单独校正。

为了解决处理荧光显微镜图像的生命科学家的这些问题，我们开发了EasyFiji，一款精心策划和引导的斐济图形用户界面插件。EasyFiji 是一套精心策划的主题组织命令，支持通道感知的渲染和处理。四个表格面板—— 显示、 进程、 保存和 图片信息，每个面板包含与主题相关的工具提示增强按钮和滑块集合，用于执行命令。其他便利功能包括用于交互处理的撤销功能、一个简单的纯文本动作记录器，可以自动保存像素修改动作和图像，以及格式化的获取设置显示，这些对图像解读很重要。EasyFiji还提供了新的图像渲染和漂白校正工具。EasyFiji不支持定量图像分析或批量处理功能，因为这些程序应在专业生物图像分析师的协助下进行。虽然 EasyFiji 设计简洁，但所有斐济本地命令始终可通过斐济本地菜单系统使用。我们相信，EasyFiji面向受众的设计⁴ 将提升Fiji在生命科学家中的使用率。本文介绍EasyFiji在荧光显微镜图像中的设计、实现及应用。该插件通过斐济更新网站（https://imagej.github.io/list-of-update-sites/ 和 https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin）安装非常方便，开源代码也可以通过GitHub下载;该插件和源代码均免费提供（https://github.com/stjude/EasyFiji）。

Protocol

该协议描述了如何安装和使用 EasyFiji。

1. 安装EasyFiji......

1. 下载适用于该作系统的最新版本斐济（>1.54g），并将其安装在用户可读写的文件夹中（详见 材料表 中的斐济下载链接）。
2. 启动斐济并导航至 帮助 |更新...... 在菜单栏里。
3. 在 更新窗口 中，点击 管理更新网站。从列表中选择 EasyFiji ，点击 “应用并关闭”。EasyFiji将自动安装，斐济将随着EasyFiji的后续版本自动更新。
4. 重启斐济。在斐济插件菜单中选择EasyFiji。
   注意：EasyFiji 与许多较旧版本的斐济完全兼容，主要兼容 ImageJ。详细的兼容性和依赖信息可在EasyFiji GitHub维基页面（https://github.com/stjude/EasyFiji）和EasyFiji ImageJ.net 维基页面（https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start）中找到。反馈可通过GitHub页面或 Image.sc 论坛（https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617）的EasyFiji帖子提供（详见 材料表 链接）。

2. 使用 EasyFiji 显示面板

注意：如 图1A所示， 显示 面板支持使用色片按钮、直观的对比度调节控制以及新的感知校准多通道图像渲染选项进行荧光通道伪着色。还包含了斐济本地的3D/4D图像投影和重新切割命令。 表1 记录了EasyFiji指挥部与斐济本土指挥部之间的对应关系。

1. 设置频道的颜色或可见性（显示 面板， 频道颜色 部分）。
   1. 使用图片窗口的频道滑块选择目标频道。
   2. 按下 颜色色样按钮 即可分配新的颜色查找表（LUT）。
   3. 按下 黑色色样按钮 即可关闭频道的显示。
   4. 按下 AllChs按钮 ，可以同时显示所有频道。
   5. 点击 EachCh按钮 ，通过在图片窗口中滚动通道滑块，按顺序显示每个通道。
2. 设置图像内部或图像之间的通道对比度（显示 面板， 通道对比 度部分）。
   1. 要更改频道的显示范围（对比度），请使用图片窗口底部的频道滑块选择该频道。
   2. 移动显示 增益滑块 ，指定图像像素强度（右侧显示的数值）作为屏幕上最亮的值显示。
      注意：我们使用“显示增益”一词来描述这一动作，因为它使通道变得线性亮度，类似于图像采集过程中检测器增益的变化。
   3. 按下显示 增益重置按钮 ，将通道的最大像素强度（根据位深确定）显示为屏幕上最亮的值。
   4. 移动显示 偏移滑块 ，指定图像像素强度（右侧显示的数值）作为屏幕上最暗的值显示。
      注意：我们使用“显示偏移”一词来描述此动作，因为它会设置图像的黑位，类似于图像采集过程中检测器设置偏移的效果。
   5. 按下显示 偏移重置按钮 ，将图像像素强度从零设置为屏幕上最暗的值。
   6. 按下 AutoCh按钮 即可自动调整显示增益和偏移。
   7. 按下 自动全功能按钮 即可自动调整所有通道的显示增益和偏移。
   8. 按下 “传播”按钮 ，将显示增益和偏移设置从活动图像传输到所有包含相同通道数的其他打开图像。
3. 创建多通道显示（显示 面板， 通道视图 部分）。
   1. 要将两个荧光通道合成为彩色图像，使用 带FF的前缀 按钮（荧光与荧光）。要将荧光通道和形态灰阶通道合成彩色图像，使用 FG前缀 按钮（带灰度的荧光）。渲染图会在一个新的图像窗口中创建。
      注意：在创建任何通道视图之前，首先调整每个通道的显示增益和偏移，使目标信号覆盖显示的动态范围（第2.2节），然后在处理标签页（第3.2.3节）使用应用增益和偏移按钮进行这些增益和偏移。如果不调整和应用增益和偏移，渲染效果将不理想。
   2. 按下 FFColoc按钮 ，两个荧光通道生成颜色渲染，在两个通道强度相近（25%以内）时，将黄色像素高亮。
      注意：不同通道强度不同的像素以灰度渲染。黄色像素暗示基于相关性的共定位5，当每个通道上的目标信号覆盖显示动态范围时。
      注意：FFColoc 渲染仅供数据探索或示例用途。它不能替代专家协助下严格量化共局域化的方法。
   3. 按下 FFMerge按钮 ，可以从两个荧光通道中生成色彩渲染，每个通道的信号感知度都相同。
      注意：在每个像素处，亮度根据强度较高的信号设定，而色相则是通道间强度比值的函数（遵循Taylor等人6的^概念）。另见讨论部分。
   4. 按下 FGMerge按钮 ，可以生成荧光通道和灰阶通道的色彩渲染，其中荧光通道的着色保留，灰阶通道的对比度依然保留。
      注意：灰度通道通常是一种非荧光模态，包含形态信息，如DIC、相位差或电子显微镜。
   5. 按下 蒙太奇按钮 ，将频道拆分为单独图像，自动在屏幕上平铺，并同步其可视化。
   6. 按下 SyncWins按钮 ，可以同步同一类型的多张图片的可视化。
4. 创建3Dz或T堆栈的二维视图（显示 面板， 堆栈视图 部分）。
   注意：每个渲染图都会显示在一个新的图像窗口中。
   1. 按下 MIP按钮 即可创建最大强度投影。
      注意：生成的二维图像中每个位置的强度对应于三维图像中^三维中 最强像素的强度。此过程可能会加剧噪声，因此在创建MIP前平滑堆栈（见 处理 标签页）非常有用。
   2. 按下 SIP按钮 即可创建和强度预测。
      注意：生成的二维图像中每个位置的强度对应于三维图像中^三维各 强度的总和。该过程保持了总强度，使图像噪声比任何单片更低。
   3. 按下 正交按钮 即可创建正交切片查看器，它会交互式地渲染三维堆栈中在当前光标位置相交的三个正交平面（例如xy、xz、yz）。
   4. 按下 Kymo按钮 即可创建Kymograph。
      注意：顶形图是一种二维图像，其中垂直轴（y轴）对应堆栈的三维空间（通常是t-），水平轴（x轴）对应用户在输入堆栈上绘制的线条上的位置。当^第三维是 时间时，则使用顶图来展示或量化运动。
      该按钮依赖于Fiji自带的KymographBuilder插件7，但如果使用ImageJ，必须单独下载。
5. 设置杂项选项（显示 面板）。
   1. 按下 Dup按钮 ，在斐济内复制活跃的图片窗口。新的图像窗口将出现。
      注意：使用斐济的矩 形ROI 工具在图片上绘制一个矩形兴趣区域（ROI）， Dup按钮 会裁剪到ROI边界。指定通道、z和/或t-范围，以重塑复制图像的维度。
   2. 按下 ToClip按钮 ，将 当前屏幕上显示 的活跃图片复制到系统剪贴板。要将图片粘贴到其他应用程序（准备幻灯片或编辑照片），请让另一个应用程序开启，然后选择粘贴（Windows按Ctrl+V，Mac按Cmd+V）。
   3. 按下 |--um--|按钮 ，在图像上显示比例条作为叠加。切换 |--um--|按钮 以移除比例条。

3. 使用 EasyFiji 流程面板

注意：如 图1B所示， Process 面板 中的通道功能 部分提供了基于滑块的图像处理命令和工具提示，可用于增强图像显示。 撤销最后按钮 支持交互式处理。图像尺寸可以通过 修改尺寸 按钮进行更改。 动作表 用于记录作为纯文本处理命令，这些命令可以更改图像像素强度值。日志可以自动保存，同时使用相同标题的图片（参见 保存 面板）。

1. 修改图像的空间特征（过程 面板， 修改通道特征 部分）。
   注意：所有命令仅适用于当前的通道，结果会自动显示在原始图片窗口中。不会创建新的图像窗口。
   1. 移动 平滑滑块 以应用高斯模糊，从而减少像素间正态分布的变异（~射击噪声和读噪）。
      1. 对于~奈奎斯特采样图像（70-150 nm xy像素尺寸），从1.0到2.0之间的滑块值开始。
      2. 对于给定的像素大小，随着图像信噪比（SNR）降低，滑块值也随之增加。
      3. 给定信噪比，随着像素大小减小，滑块值增加。
      4. 对于图像堆栈，应用三维平滑，其中z半径自动设置为xy半径的三分之一，适用于奈奎斯特采样数据。
         注意：滑块值对应于以像素为单位测量的高斯核的标准差。
   2. 移动 降噪滑块 以应用中位数滤镜，从而消除极端异常值（相机热像素或PMT热电子发射）。
      注意：滑块值对应于盒核的半径（像素单位）。0.5到1.0之间的数值是个不错的起点。
   3. 移动 锐化滑块 以应用2D非锐化遮罩，从而减少模糊或朦胧，如光线失焦引起的。锐化也会加重噪点。
      注意：滑块值对应于定义模糊尺度的高斯核标准差（以像素单位）。对于~奈奎斯特采样图像（70-150 nm xy像素尺寸），滑块值在2.0到4.0之间是很好的起点。权重参数固定在0.6。
2. 改变图像像素强度（流程 小组， 修改通道强度 部分）。
   注意：所有命令仅适用于当前通道，结果会自动显示在图片窗口中。不会创建新的图像窗口。
   1. 移动 Sub.Bkgd.滑块 以应用“滚动球”算法，从而去除背景（即空间上渐进的强度变化）。
      注意：滑块值是滚动球的半径（像素单位），因此值越大，减去的背景总数越少。数值取决于图像内容，但通常应比要保存特征的像素大小大≥2倍。10到20之间的数值通常是个不错的起点。
   2. 移动 伽马滑块 以增强对较弱信号与较亮信号混合的可视化效果，例如在与大型结构混合时，可能需要强调细微结构。
      注意：归一化后，每个像素的值被提升为由滑块值给出的幂（指数）。数值取决于图片内容，但0.6到0.8之间的数值通常是个不错的起点。
      注意：已应用伽马的图像不能用于强度量化。
   3. 按下 “应用增益和偏移：ToCh”按钮 或 ToAll按钮 ，将图像显示范围（由显示面板中的增益和偏移滑块指定）映射到图像位深所提供的全部强度范围内。
      注意：这一过程也称为应用查找表（LUT）。在创建显示面板的通道视图之前，必须以这种方式应用显示增益和偏移。
   4. 使用 强度校正按钮 来校正三维图像中z维或t维的伪影强度变化，例如可能由光漂白、像差或光散射引起的。
      注意：该动作仅应用于活跃通道。可以对同一数据集顺序应用局部和全局修正。有关底层方法的进一步解释，请参见结果部分。
   5. 按下 全局按钮 可校正整个z维或t维中逐渐发生的信号强度损失，同时保留大部分生物驱动的强度变化。有两个选择：
      1. 按下 GlobalL按钮 可纠正初始切片可能为暗或黑的z堆栈，从第一帧到最后一帧的总强度损失为轻微（<50%）。该算法将强度损失建模为线性趋势，然后对每个切片施加修正因子，使拟合线的斜率变为零。
      2. 按下 GlobalP按钮 即可修正前一帧最亮且从第一帧到最后一帧的总亮度损失显著（50%-95%）的时间序列。该算法将强度损失建模为^二阶多 项式趋势，然后对每个切片施加修正因子，使拟合曲线变换为斜率为零的直线。
   6. 按下 本地按钮 可纠正局部且突兀的信号强度变化，同时保持渐进变化。
      注意：这些变化可能是由于更大Z堆栈中少数平面的漂白或激发功率波动（闪烁）引起的。该算法将生物学相关的强度变化建模为四阶多项式，然后应用修正因子以确保每帧的中位强度等于拟合曲线的值。
   7. 按下 均衡按钮 ，使每帧的中位信号强度相等，类似于斐济的“简单比例”漂白剂校正方法。
      注意：当所有其他方法都失效时，均衡化可能用于可视化，但它会抹去生物学上相关的中位强度变化，因此不能与强度量化配合使用。
3. 更改图像的维度（过程 面板， 修改尺寸 部分）。
   注意：这些命令适用于图片窗口中的所有通道，无法通过 撤销 按钮反转。
   1. 按下 旋转 按钮即可旋转图像，例如将胚胎或组织的解剖轴与页面或屏幕对齐所需的作。
   2. 点击 裁剪按钮 以缩小图片的xy尺寸。寻找自动选择的 矩形投资回报率 工具，并观察提示，在图片上绘制用于裁剪的投资回报率。
   3. 按下 子集按钮 ，从输入图像非xy维度的子集创建新的图像栈。
      注意：这用于移除通道和/或截断 z 或 t 中的切片。
4. 记录对图像应用的处理命令（进程面板，记录动作部分）。
   注意：动作记录器的目的是自动将动作记录为纯文本，然后保存与应用动作的图像，这些动作会改变像素强度值。日志方便用户无需手动做笔记或解读斐济宏记录记录。不改变像素强度的命令不会被记录。
   1. 按下 Rec按钮 开始命令录音。
      注意：录音机录制时按钮面显示“开启”。执行的命令和相关参数会显示在动作表中。被“撤销”的命令会从表中移除。
   2. 按下 Clr按钮 即可清除行动表。
   3. 点击 保存按钮 ，将动作表保存为文本文件。如果对多张图片应用的动作已被记录，保存文本文件时，这些动作将按图片标题分组。
      注意：或者，您也可以使用 保存 面板（见下方第4节）保存图片。勾选 “保存动作 ”框，所有应用到图片的作都会自动保存为文本文件，使用图片的名称和文件路径。

4. 使用 EasyFiji 保存面板

注意：如 图1C所示，保存面板旨在帮助非专家选择适合其预期场景的图片文件格式。当勾选“ 保存动作”复选框 时，作表中列出的所有应用到图像的处理作会自动与图片一起保存，使用相同的文件名和路径，但扩展名为*.txt。如果多个图像被打开并并行处理，所有对所有图像执行的作都会显示在动作表中。然而，只有对被保存图片应用的作会随该图片一起保存。保存的文本文件会出现在文件系统中，但在斐济无法打开。如有需要，可以通过将文件图标拖到斐济工具栏中打开文本文件。

1. 保存图片（保存 面板， 保存方法 部分）。
   1. 按下 原始数据按钮 ，将图像保存为*.tif文件，保留精确的像素值、通道结构和部分元数据。当目标是进一步量化或分析图像时，可以使用此选项。
   2. 点击 “保存为演示”按钮 ，将图片保存为当前显示的格式，使用jpeg压缩，以便发送邮件或在幻灯片演示中使用。
      注意：此选项绝不应用于计算数据或进行定量分析。
   3. 移动 质量等级滑块 以设置jpeg压缩级别。
      注意：较大的数值对应于更好的像素强度和特征保留（以及更大的文件大小），但并非所有特征都被保留。
   4. 点击 “保存为图形”按钮 ，将图片保存为当前显示的png格式，兼容其他图形程序（如Photoshop、Illustrator、Publisher或GIMP）。图片会按 屏幕上显示的方式保存，但频道和元数据不会被保存。
      注意：此选项绝不应用于量化。
   5. 点击 “另存为电影”按钮 ，将图像堆栈保存为一个移动格式的电影，按顺序播放切片（z或t）。
      注意：在基于Windows的作系统上播放mov文件需要开源的VLC媒体播放器。

5. 使用 EasyFiji 图片信息面板

注意：如 图1D所示， 图片信息 面板显示了供应商特定的纯文本采购设置，这些设置对图像解读至关重要。请参见 表2 ，列出目前支持的共聚焦图像格式类型。

1. 点击 频道信息 按钮加载 采集 设置。
2. 请参阅通道信息部分，了解通道特定的采集设置，包括百分比激光功率、激光波长、发射带通、增益和针孔大小。
3. 请参阅系统配置部分，了解图像范围的设置，包括 system 名称、目标、扫描模式、停留时间和体素大小。

Results

多通道荧光图像的伪彩色渲染可用于展示信号之间的空间或强度关系;然而，斐济原生仅提供一种RGB复合渲染技术，这在感知层面上固有地混淆了色彩和亮度。为说明这一问题， 图2 使用了N-Myc和RNA聚合酶II（RNAPolII）的双通道图像。 在图2A中，每个通道以灰度单独显示，因此没有（可能干扰的）色信息。 在图2B中，这些通道以斐济RGB复合渲染的形式一起显示，使用了所有可能的主色和/或次色组合。如图所示，不同颜色的渲染在感知层面传达的信息差异很大（下文量化）。因此，斐济RGB复合渲染中感知到的信息会任意依赖于分配给哪些通道的颜色。科学渲染应设计以有效传达具体信息。

生命科学家可能希望通过多通道渲染来评估两个信号之间的整体（空间和强度）关系，其中每个信号的感知度均等，与所用颜色无关。EasyFiji的 FFMerge按钮 <...

Discussion

Fiji 是一款开源的图像处理与分析软件，在图像分析师中非常受欢迎。然而，其复杂的菜单界面以及在荧光图像显示和处理方面有时不直观的行为，对非计算生命科学家来说是个挑战。EasyFiji为生命科学家提供了一套精心策划的主题组织和工具提示增强的按钮和滑块，这些按钮和滑块在处理荧光图像时始终表现出特定频道的行为。所有处理命令均不可执行，实现交互性，且可自动录制并随图像保存为纯文本以便记录。尼康和蔡司点扫描共焦点镜的采集设置对图像解读至关重要。作为斐济插件，EasyFiji的简洁性从未成为限制，因为所有斐济指令始终可以通过斐济本地菜单系统访问。除了简化的用户界面外，EasyFiji还提供了多种专门设计的多通道渲染技术，以及用于强韧漂白（衰变）校正的新方法。EasyFiji 有意避免提供定量分析功能或批量处理，因为定量图像分析应仅在生物图像分析师的协助下进行。

尽管生命科学家可能出于各种原因将多个荧光通道组合到彩色图像中，但斐济原生主要提供多通道RGB复合渲染技术。在该技术中，每个像素的显示颜色和亮度通过加总分配给每个通道的...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasyFiji GitHub 网站	开源		https://github.com/stjude/EasyFiji
EasyFiji Image.sc 论坛	开源		https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617
EasyFiji ImageJ.net 网站	开源		https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start
斐济软件	开源		https://imagej.net/software/fiji/downloads
VLC媒体播放器	开源		https://www.videolan.org/vlc/