一种用于广泛不同哺乳动物大脑中定量细胞计数研究的比较方法

摘要

现代神经科学需要探索多种物种之间的差异，包括实验啮齿类动物和人类。然而，在涉及大脑较大的哺乳动物时，技术难题随之而来。该方法针对差异较大的哺乳动物中神经元群体的种间变异进行研究，获得可比较的结果，进而绘制出揭示进化模式的图谱。

摘要

大多数神经生物学研究是在实验啮齿类动物上进行的。尽管哺乳动物大脑之间存在许多相似之处，但也存在重要差异，这些差异在转化研究中可能产生误导。在脑可塑性，特别是神经发生方面，已发现显著的物种间差异。由于进化过程中的权衡，不同的神经发生过程可能占据主导地位，从而在脑结构和哺乳动物之间表现出差异，并改变不同物种（如小鼠与人类）的可塑性潜力。比较差异较大的物种会引发多个问题：当涉及大脑体积较大的物种时，比较研究会遇到技术困难；不同实验室采用异质性的实验方法可能限制结果的可比性；这种异质性可能与哺乳动物神经发育过程的时间进程不同有关，从而为比较增加了额外变量。

为了克服这些局限性，建立了一种研究哺乳动物皮层第II层未成熟神经元群体在物种间差异的方法，所涉哺乳动物在脑容量、大脑沟回结构、社会生态位和年龄方面存在显著差异。尽管存在一些无法完全标准化的变量，本文提出了一种方法，通过减少脑组织采集过程中的异质性，并采用共同的解剖结构作为参考点，以在对应的脑区水平上进行细胞计数。所获得的数据（如细胞密度）可映射到系统发育树上，以揭示进化模式，并可分析其与神经解剖学特征（如脑容量、皮层表面积）之间的协变关系。该方法已显示出不同系统发育类群之间皮层未成熟神经元数量存在显著差异，并揭示了其与脑容量之间的协变关系。该方法还可用于量化同一物种在不同发育阶段的差异，并可推广至其他多种哺乳动物及其他生物学过程，以获得可比较的结果，从而更准确地量化成年脑中不同细胞群体的数量，支持脑可塑性的研究。

引言

神经科学研究在很大程度上依赖近交系小鼠和大鼠，以将研究结果外推至人类。尽管在分子、细胞甚至解剖结构方面存在诸多相似之处，但重要的种间差异仍然存在，这可能对临床前数据的解释产生误导^1,2。尽管需要开展比较研究，但当涉及较大体积的脑组织时（例如，从小鼠平均0.5 g到人类1300 g；图1A），技术与实际操作上的困难往往限制了此类研究的进行。此外，不同实验室采用的实验方法存在异质性，这可能限制结果之间的比较，尤其是定量分析，有时会引发争议。脑结构可塑性研究便是如此，特别是与神经发生过程相关的研究^3,4,5，这一主题对于理解发育期神经可塑性及脑修复机制具有重要意义^6,7。

脑可塑性领域的最新发现强烈表明，在进化过程中，不同类型的神经发生过程在发生频率、速率以及解剖学位置上出现了显著差异⁸。一个例子是，与实验啮齿类动物相比，成年大型哺乳动物中由干细胞驱动的神经发....

方案

所有动物实验均符合相关的国家和机构法规。小鼠组织由意大利奥尔巴萨诺的神经科学研究所Cavalieri Ottolenghi（NICO）提供，经意大利卫生部授权（RRID: MGI:3696370），承蒙Serena Bovetti和Charles River Laboratories惠赠。裸鼹鼠组织由伦敦玛丽女王大学（英国）在依据1986年《动物（科学程序）法案》附表1实施安乐死后立即采集。兔类实验遵循欧洲共同体理事会指令86/609/EU及意大利法律（DL.vo 116/92），并获得意大利卫生部批准（授权号66/99-A）。绵羊和马脑组织在欧盟指令86/609/EEC规定及持续兽医监督下，从商业屠宰场获取。犬脑组织由法国里昂的MarshallBio Laboratories在获得必要授权后提供尸后样本；猫脑组织在主人同意下，于帕多瓦大学常规诊断性尸检过程中获取尸后样本。所有操作均遵循欧盟和意大利法律法规。黑猩猩样本的处理遵循国际医学科学组织理事会（CIOMS）的国际指导原则，并依据美国国立卫生研究院实验动物福利办公室（NIH-OLAW）许可A5761-01进行（各动物种类及实验详情参见补充表1及参考文献^22,25）。

1. 收集脑组织

1. 直接或从其他机构及组织库收集大脑，但仅限使用完整的大脑半球。与相....

结果

在所有被研究物种的大脑皮层中，DCX+细胞始终具有一系列共同特征，表明存在一个高度保守的未分化神经元群体（图4A）。简而言之，这些细胞：（i）在拓扑结构上排列成单层，位于皮层第二层（cortical layer II）；（ii）表现出未成熟神经元在不同发育阶段所描述的形态学亚型，（a）其中以体积较小的单极/双极细胞为主，仅少数细胞具有复杂的树突结构，类似锥体神经元；（b）大多数细胞共表达未成熟标志物PSA-NCAM和DCX，但从不共表达与细胞分裂相关的Ki67抗原；（c）一个亚群的大体积复杂细胞还表达NeuN，表明其已启动成熟过程^22,25。

除了这些共同特征外，当使用本文所述方法对cINs的线密度进行量化时，不同物种间的差异极为显著，在所检测的样本中差异幅度可达一个数量级（图4B）。在哺乳动物中，未成熟细胞群体具有共同特征，而细胞出现频率和数量却.......

讨论

本文所述方法在考虑脑尺寸和神经解剖结构差异显著的多种物种时，可提供可比的定量数据。该方法可用于评估不同哺乳动物全脑中细胞群体的一致性，也可用于追踪单一物种从出生后到衰老各阶段的发育过程。本方法基于以下假设：将涉及相对较多样本数量的脑组织（完整的半脑）和物种，均由同一实验室按照采样与固定的质控标准进行处理，随后采用相同的分析流程进行分析³³（图1和图2）。

该方案中的关键步骤包括那些由于脑大小以及伦理/实际原因而无法完全标准化的变量（例如，在受保护的哺乳动物物种中不允许进行的操作）。最常见的因素是死后间隔时间（PMI）和组织固定，这两者可达到相似（尽管不完全相同）的条件。根据我们的经验，只要将 PMI 控制在 1 小时以内（如绵羊、马）或 15 小时以内（如黑猩猩），并通过浸入法找到合适的固定时间（图 2），即可接受一定程度的变异。在每种情况下，方案是否最优需通过评估组织质量来判断（切片后的整体外观、组织和细胞形态、免.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 甲醛	Sigma-Aldrich	HT501128
2-甲基丁烷	Sigma-Aldrich	320404	异戊烷
3,3′-四盐酸联苯胺水合物	Sigma-Aldrich	D5637
4% 多聚甲醛	Sigma-Aldrich	441244
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9647
柠檬酸	Sigma	C0759
组织学用DPX封片剂	Sigma-Aldrich	06522
乙醇	Merck	1.00983
乙二醇	Sigma-Aldrich	102466
甘油	Sigma-Aldrich	G7893
过氧化氢溶液	Sigma-Aldrich	H1009
Killik - O.C.T. 包埋剂	Bio-optica	05-9801
Mesquite 软件	Mesquite Project	Mesquite 版本 3.81 (build 955)
Neo-mount 封片剂	Sigma-Aldrich	1.09016
磷酸缓冲液 (PB)	na	na	自行配制
磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)	na	na	自行配制
氢氧化钠	Riedel-de Haen	6213
磷酸氢二钠二水合物	Sigma-Aldrich	71645
磷酸二氢钠二水合物	Sigma-Aldrich	71500
蔗糖	Sigma-Aldrich	S9378
甲苯胺蓝	Sigma-Aldrich	89640
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
VECTASTAIN Elite ABC-HRP 试剂盒 过氧化物酶（标准型）	Vector Laboratories	PK-6100
二甲苯	Sigma-Aldrich	247642