一种针对不同哺乳动物大脑中定量细胞计数研究的比较方法

摘要

现代神经科学需要探索许多物种之间的差异，包括实验室啮齿动物和人类。然而，当涉及大脑庞大的哺乳动物时，技术难题也会出现。该方法涵盖了多种不同哺乳动物中神经元群体的跨物种变异，得出了可比的结果，用于揭示进化模式。

摘要

大多数神经生物学研究是在实验室啮齿动物身上进行的。尽管哺乳动物大脑有许多相似之处，但也存在重要的差异，这些差异在翻译时可能具有误导性。在大脑可塑性方面，尤其是神经发生方面，发现了显著的跨物种差异。由于进化权衡，不同的神经发生过程可能普遍存在，这些过程在大脑结构和哺乳动物间表现出变异，并改变了不同物种（如小鼠和人类）的可塑性潜力。比较差异较大的物种会带来多重问题：当涉及大型大脑时，比较研究会遇到技术难题;不同实验室采用异质实验方法可能会限制结果的比较;异质性可能与哺乳动物神经发育过程的不同时间周期有关，从而增加了比较变量。

为解决这些局限性，建立了一种方法，研究哺乳动物中在脑容量、回脑、社会生态位和年龄等方面差异较大的第二层皮层未成熟神经元群体的跨物种变异。尽管存在一些无法完全标准化的变量，但提出了一种结合减少大脑采集异质性和建立共同解剖结构作为对应脑层细胞计数参考点的方法。获得的数据（例如细胞密度）可以映射到系统发育树上，揭示进化模式，并分析其与神经解剖特征（如大脑大小、皮层表面积）的协变性。该方法显示，不同系统发育组间皮层未成熟神经元数量存在显著差异，并发现了与大脑大小的共变。该方法还可用于量化同一物种不同发育阶段的差异，并可推广至其他多样哺乳动物和生物过程，绘制可比结果，从而更准确地量化成年大脑不同细胞群体，支持可塑性。

引言

神经科学研究主要利用近交小鼠和大鼠将结果转化为人类。尽管分子、细胞甚至解剖学上有许多相似之处，但重要的物种间差异也存在，这可能对^{临床前数据}的解读产生误^导。虽然需要比较研究，但当涉及大型大脑时，技术和实际作上存在困难（例如，小鼠的平均重量从0.5克到人类的1300克;图1A）。此外，不同实验室采用异质实验方法，尤其是定量分析，可能限制结果比较，有时引发争议。这就是大脑结构可塑性的情况，特别关注神经发生过程^3,4,5，这一主题对理解发育性神经可塑性和脑修复具有重要意义 ^6,7。

脑可塑性领域的最新发现强烈表明，在进化过程中，不同类型神经发生过程的发生、速率和解剖位置存在显著^差异。例如，成年大脑哺乳动物中干细胞驱动的神经发生明显减少，相较于实验室啮齿动物^5,9,10，这可能与大脑区域和功能因适应生态压力而变化有关，^7,8以及不同的神经发育时间周期^11,12.小鼠和人类的神经发生速率差异显著，因此引发了翻译¹³的问题。

另一方面，一种新型的“无分裂神经发生”表现为神经元在成熟停止时被阻断（即未成熟或休眠神经元14,15,16,17,18,19），被假设从小脑向大脑物种增加 ^20,21.有趣的是，不依赖干细胞的未成熟神经元群体寄主于大脑皮层（回脑细胞物种中高阶认知的部位^22,23），远离主要与嗅觉和空间导航相关的典型神经发生位点，后者在光滑脑物种中仍极为重要 ^7,8.这些跨脑结构和哺乳动物物种的差异超越了单纯的比较兴趣，因为它们可以通过转移小鼠和人类可塑性潜力来实现翻译。因此，必须以“可比方式”评估这些差异在多大程度上代表了不同哺乳动物间的系统发育变异，特别针对实验室啮齿动物和灵长类动物。

最近建立的一种方法，用于研究哺乳动物中在脑容量、脑回和社会生态位^22、24、25上差异较大的第二层皮层未成熟神经元（cIN）种群的物种间变异。该方法基于三个原则：i）考虑多种（多样的）哺乳动物物种并行处理，采用相同程序;ii）减少在不同大脑中无法完全标准化的变量（如固定程序、死后间隔、年龄），并通过使用研究细胞群体中广泛共享的特征作为内部正对照，解决免疫细胞化学中抗体的物种特异性;iii）建立对应的解剖结构作为对不同物种对应大脑水平进行细胞计数的参考点（图1B和图2）。通过计数与已知标记双皮质（DCX 15,17,26）识别的细胞所得数据（如细胞密度）可以映射到系统发育树上，揭示进化模式，并分析与不同参数（如脑容量、回脑回和皮层表面积）的协方差。

图1：处理截然不同的哺乳动物大脑，用于评估皮层外套膜中cIN的分布和数量。（A）不同物种和目类的哺乳动物在脑容量和脑回及皮层扩展程度上差异很大。脑图标以BioRender许可复制。（B）代表性甲苯胺蓝色染色冠状切片，取自大小和皮层外套延伸的大脑。使用组织染色的序列切片（冷冻切口，冠状切口，厚40微米）用于识别每种动物的主要神经解剖结构（见图3）;请注意大脑大小和皮层周长的显著差异。面板A中的动物图标经La Rosa等人许可复制。请点击此处查看该图的放大版本。

最后，由于所有可塑过程通常随着年龄增加而逐渐减少，^27、28岁，比较神经可塑性中的另一个问题是评估这种减少的不同时间周期，这可能与哺乳动物不同神经发育过程的时间周期有关 12,29,30.事实上，快速成熟（小鼠）与慢熟（灵长类）物种的存在，也是导致最常见的模型系统——实验室小鼠——在生物医学科学挑战中受限的另一个原因。这里描述的方法也有助于考虑不同物种生命周期中不同年龄的细胞群体，然后比较不同物种间的趋势。小脑和大脑哺乳动物之间发现了cIN密度的系统发育变异，以及其在不同年龄段的持续性差异（^22,28）。

方案

所有动物作均符合相关国家和机构法规。小鼠组织由意大利奥尔巴萨诺的Cavalieri Ottolenghi神经科学研究所（NICO）获得，获得意大利卫生部授权（RRID： MGI：3696370），并由Serena Bovetti和Charles River实验室提供。根据1986年《动物（科学程序）法案》附表1，在安乐死后立即采集了裸露的鼹鼠组织。兔子实验遵循欧洲共同体理事会指令86/609/EU及意大利法律（DL.vo 116/92），并获得意大利卫生部批准（授权66/99-A）。羊脑和马脑尸检是在商业屠宰场根据指令86/609/EEC进行的，并在持续兽医监督下取得。狗脑由MarshallBio实验室（法国里昂）在尸检时提供，并附带所需授权;猫脑在帕多瓦大学例行诊断尸检中，获得主人同意，尸后采集。所有程序均遵循欧盟和意大利法律。黑猩猩样本的处理遵循国际医学科学组织理事会（CIOMS）国际指导原则及美国国立卫生研究院实验动物福利办公室（NIH-OLAW）许可A5761-01（有关各动物物种和实验的详细信息，详见补充表1和参考文献^22,25）。

1. 收集大脑

1. 可以直接采集大脑，也可以从其他机构和组织库收集，但只考虑整个半球。与机构建立最佳的提取动物大脑程序，旨在降低半球损伤，并确保取出后死后间隔（PMI，见下文注释）及快速浸泡于固定液中。
   注意：根据目标抗体的敏感性，需注意PMI。鉴于双可确（DCX）对降解的高度敏感性，采集PMI范围为0-1小时的样本（除黑猩猩外，PMI可达14小时，但这并未改变染色质量， 见补充表1）。
2. 鉴于动物寿命的高度变异性，应预先确定将收集的不同哺乳动物年龄组，以获得可比数据。
   1. 为设计本研究并设定可比年龄组，分析两个动物历史与多样性数据库的信息：AnAge，一个精心策划的动物衰老和生活史数据库，以及Animal Diversity Web，一个关于动物自然历史、分布、分类和保护生物学的在线数据库。
   2. 将动物寿命分为四个阶段（一个青春期前阶段，三个青春期后阶段，即“成年”），起始于美国兽医医学会（AVMA）对犬只生命阶段的分类，³¹岁，将生命分为六个阶段：幼犬、幼犬、成犬、成熟、老年和老年。
   3. 通过将老年和老年阶段以及成年和成熟阶段压缩，应用以下术语：青春期前期、年轻成人期、中年期和²²岁老年期。

2. 脑组织固定与处理

注意：固定程序可能因脑容量和某些动物物种的伦理问题而异（大多数大脑较大的灵长类动物或马无法灌注，必须在提取后浸入固定液中固定）。

1. 让大脑完全浸泡在固定液中（建议4%对甲醛或10%福尔马林）。
   注意：固定时间因大脑大小而异（例如，犬脑为3周;马脑为3个月， 补充表1）。避免固定液浸泡时间过短或过长，以保持目标抗原的完整性。
2. 用尺子（用于直切）和刺刀将脑部半球切成等切片（厚度1-1.5厘米）。
3. 将脑片浸入0.1米的磷酸盐缓冲液（PB）（28.49克磷酸钠和7.8克磷酸钠单碱基溶解于蒸馏水中，pH值7.4），并在摇床上轻微搅拌24小时。如有需要（见下文注释），丢弃溶液，第二天用新的PB 0.1 M、pH 7.4替换。
   注意：PB 0.1 M的洗涤量和次数因脑容量不同而异（例如，小鼠脑30分钟，马脑3天）。确保大脑完全浸入PB 0.1 M，且福尔马林、血液和组织废物不再存在以停止冲洗。
4. 通过将切片浸泡在浓度逐渐增加的蔗糖溶液中（10%、20%、最高30%）、PB 0.1 M、pH 7.4，冷冻保护，并在摇杯上轻微搅拌。
   注意：蔗糖溶液的体积因大脑大小而异。确保大脑完全浸入蔗糖溶液中，并且在进入更高浓度的蔗糖前，必须完全下沉。

3. 全半球低温容器切割

1. 使用弯曲镊子去除脑膜切片，以避免切割时出现问题。
2. 将切片放入填充最佳切割温度（OCT）化合物的嵌入模具中。如果切片无法填满嵌入模具，切下一块比大脑切片稍大的方形防腐剂，并在切片中心加入OCT介质，然后将切片放在OCT上。
3. 将切片浸泡在300毫升液氮冷却异戊烷中，温度为-50°C，直到OCT培养基完全变白。脑片可长期保存至-80°C，直到切片。
4. 切片前，将脑切片保持在-20°C至少5小时，使组织慢慢均匀地达到与低温容器相同的温度。
5. 使用低温恒温器将切片切成40微米厚的连续日冕切片，保持室内温度范围为-20°C至-25°C。
6. 收集游离切片于12孔板中，并储存在低温保护液（150毫升甘油、150毫升乙二醇、150毫升蒸馏水和50毫升F缓冲液（1.682克磷酸盐单碱性二水合物和0.385克氢氧化钠溶解于蒸馏水中，pH值7.4）中保存（大脑需1毫升/孔，或更大以完全覆盖切片）在-20°C下染色。
   注意：整个半球切片的大小取决于大脑大小。较大的大脑（如黑猩猩、马）需要被分成两个相等的块（背侧和腹侧），才能在低温容器中处理。在这种情况下，可以收集两个6孔板中的自由浮动段。另一种方法是使用滑动切片机切开大脑大脑物种的半球，这样可以切出更大尺寸的块。

图2：处理不同大脑的过程，采用相同程序并处理无法标准化的变量。 在上述方法中，所有可标准化的程序均以相同方式进行（一般固定、在整个半球切割相同厚度的连续冠状切片、一般免疫细胞化学程序、细胞计数）。用BioRender（https://app.biorender.com/）制作的图形。 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 组织学染色

1. 选择连续冠状切片（12个中选1个）。要获得该间距，可以从12孔板中选取同一孔的所有段。利用它们获得整个半球的完整表现，并作为参考，在不同研究物种中选择不同可比大脑水平的冠状切片（见第5节）。将它们安装在1%明胶化的载玻片上。让它们干燥几个小时。
2. 准备以下溶液（150毫升/溶液）：乙醇50%、70%、96%、100%、二醇和甲苯胺蓝。
3. 染色方案：将载玻片置于逐渐增加的乙醇浓度（50%-100%）中，每套50%-70%1分钟，96%-100%2分钟，然后转移到木醇溶液中1分钟。
4. 将载玻片反向放置：木醇溶液1分钟，然后降低乙醇溶液浓度（100%-50%），100%-96%各2分钟，70%-50%各1分钟。
5. 将载玻片放入150毫升蒸馏水_2O（2分钟）中。
6. 将玻片放入甲苯胺蓝染色液中（5-10分钟）。这一步后，染色部分呈现深蓝色。
   注意：组织学染色溶液中保存的时间切片可能因物种而异。检测目标物种的脑部切片，以制定最佳染色方案。
7. 将载玻片用150毫升蒸馏水_2O冲洗1分钟。
8. 进行分离步骤，将载玻片置于逐渐增加浓度的乙醇（70%-100%）中，70%浓度下1分钟，96%-100%时各2分钟，然后转移到木醇溶液中，浸泡1分30秒。在这些步骤中，区块颜色会从深蓝色转变为天蓝色。
9. 确保最后一次木醇步骤后，使用安装介质保持湿润（如果干了，用木醇溶液冲洗5秒）。然后让滑套晾干几天。

5. 脑水平选择与免疫组化染色

1. 以第4节中获得的组织学染色切片为参考，根据具体神经解剖特征确定脑部水平：1级（L1）——从侧脑室前开口到L2;第二层（L2）——从内囊前端起始至L3;第3层（L3）——从杏仁核前端起始点到L4;第4级（L4）——从侧室后闭到相当于L2的延伸（同样数量的40微米厚度序列切片; 图3）。
   注意：上述神经解剖参考文献旨在比较大小和回脑的大脑皮层。根据所关注的大脑区域，所用的解剖特征可能会有所变化。
2. 从每个脑层中选择三个均匀间距的冠状切片。
   注意：接下来步骤中使用的每种缓冲液体积因大脑大小而异（例如，小鼠切片为0.5毫升/孔，马切片为1.5毫升/孔）。确保每个缓冲器完全覆盖了浮动区。
3. 在PBS 0.01 M、pH 7.4中洗涤三次，每次5分钟。
4. 在内源性过氧化物酶阻断液中孵育切片（0.6% H₂O_2,1% Triton X-100,0.01 M PBS，pH 7.4;20分钟）或使用柠檬酸（10 mM 柠檬酸，蒸馏水中补充0.05% Tween 20，pH 6.0），在90°C下进行抗原回收，浸泡5分钟。
   注意：根据固定程序/时间及目标抗原，可能需要抗原取回以获得最佳染色效果（缓冲液、温度、pH值和培养时间可能因目标抗原而异）。
5. 再次以PBS 0.01 M、pH 7.4进行洗涤切片（3次5分钟洗涤）。
6. 在阻断溶液中培养切片（1-5%牛血清白蛋白（BSA），正常血清，1-1.5% Triton X-100，浸泡在0.01 M PBS，pH值7.4;RT下90分钟）。
7. 用初级抗体溶液（1-5% BSA，2-3% 正常血清，1-1.5% Triton X-100,1.5% 原抗，0.01 M PBS，pH 7.4;48小时，4°C 轻微搅拌）。
   注意：针对目标抗原的抗体在不同脑区和不同物种中使用时，染色质量可能有所不同²⁶。需要比较不同制造商的一组抗体，以选择最适合用于研究不同物种的抗体（以减少样本间的变异性）。
8. 重复步骤5.3中描述的洗涤步骤。
9. 用二级生物素化抗体溶液（1-5% BSA，2-3% 正常血清，1-1.5% Triton X-100,2级生物素化抗体，0.01 M PBS，pH 7.4;RT 2小时）培养切片。
   注意：avidin-biotin-过氧化物酶复合物法用于Neurolucida细胞计数（见第6节），因为它能提供致密且持久的沉淀，从而在计数时能够穿透切片厚度进行聚焦。免疫荧光和共聚焦分析也可用于进行双重或三重免疫染色，以进一步表征细胞（详见参考文献22,25,32）。
10. 使用现有试剂盒制备avidin-biotin-过氧化物酶复合物。
    注意：使用前至少1小时制备avidin-biotin过氧化物酶复合溶液，浓度为Tris-HCl 0.05 M，pH 7.5（提供稳定pH以形成复合物），以便复合物形成。
11. 在PBS 0.01 M、pH 7.4中两次洗涤（2次5分钟洗涤），一次在Tris-HCl 0.05 M、pH 7.5（5分钟）中进行洗涤切片。
    注意：由于avidin-biotin-过氧化物酶复合物与Tris-HCl 0.05M溶液中，用Tris-HCl 0.05M冲洗有助于组织适应该溶液。
12. 在avidin-biotin-过氧化物酶复合物中孵育切片（RT下1小时）。
13. 洗涤切面为三盐酸0.05米，pH值7.5（3次5分钟洗涤）。
14. 在通风罩下，将切片浸泡在3,3'-二氨苯二胺（DAB）染色溶液中（H₂O_2，DAB在Tris-HCl 0.05 M，pH 7.5）中，直到获得最佳染色效果。在此过程中，各部分颜色从透明转变为棕色/酒红色。
    注意：获得最佳染色时间因分析物种而异（例如，DCX切片需2-5分钟，马切片需20-30分钟）。每两分钟检查一次染色区域，避免过度染色。
15. 洗涤切面在PBS 0.01 M，pH值7.4（3次5分钟洗涤）。
16. 将切片装在滑片上，干了之后用装载介质覆盖盖片，让滑套晾干几天。

图3：建立神经解剖脑水平，用于研究DCX+未成熟神经元在大脑皮层中的分布和数量。 四个对应的神经解剖结构（侧脑室前起始[L1];内囊前起始[L2];杏仁核前起始[L3]）;侧脑室后闭[L4];用红色圆圈表示）被认为能在所有考虑的哺乳动物中建立四个对应的前后“脑级”，以“可比”方式研究大脑皮层中的cIN数值。（A）给出实验室啮齿动物（小鼠，左）和灵长类动物（黑猩猩，右）的例子。每个脑层的三个冠状切片（共12个切片;红色箭头）用于每个冠状切片II层周长的细胞计数（注：所有切区均包含新皮层，但只有部分部分包含古皮层）。该方法旨在使分析能够在大小差异较大的大脑中对应的神经解剖层级进行。（B）举例说明在组织学染色的截面中识别第一级（L1），该切片具有很大差异。用BioRender创建的大脑和动物图标。 请点击此处查看该图的放大版本。

6. 细胞计数

1. 在工作站上打开Neurolucida软件，将载玻片放入显微镜下，目标物用于细胞计数。
   注意：对于DCX+细胞计数，使用了20x的物镜。
2. 在低倍率（例如4倍）下，使用软件中“描图”菜单中的Freehand轮廓线工具绘制皮层II的轮廓，以获得长度周长（包括古皮层和新皮层）。
3. 在屏幕左侧的 标记工具栏中选择用于单元计数的首选符号。在本次分析中，根据不同形态（对应不同的成熟状态：1型，体体较小，呈双极形状，体形为2，体形范围3-9微米;2型体体较大，树突状复杂，体形范围9-18微米）进行差异计数。
   注意：在本次分析中，标记 工具栏中每个感兴趣区域可选择两种不同的符号/单元类型。将体细胞直径划分为不同范围对于细致分类细胞至关重要，因为细胞形态可能处于中间成熟状态。为避免过度计数，剖面上方切割的单元被排除在分析之外。
4. 收集三个不同区域的系统发育分析数据：古皮层、新皮层和大脑皮层（后者是通过添加古皮层和新皮层数据获得的）。
5. 在电子表格文件中收集皮层两周长（毫米），该图可在软件的 等高线测量 工具栏中显示。
6. 在同一电子表格上，收集1型和2型细胞的数量（可在 标记工具栏中显示）以及每个脑区和脑层级（3个区段/层级，共12个切区/标本）的细胞总数（通过1型和2型细胞相加得）。
7. 利用这些数据，在每个区域的每个切片中，获得线性单元密度（细胞数/毫米）以及类型1和类型2单元的百分比（类型1/类型2单元数除以总单元数，再乘以100）。
8. 计算12个切片/样本的中位数函数（使用电子表格中的 中位 数函数），以图形化表示线性单元密度。使用中位数作为中心指标，因为每组样本较少（每组4只动物），且部分群体表现出不对称分布（中位数受极端值影响较小）。
9. 计算每个标本中1型和2型细胞的百分比（使用上述公式），然后利用电子表格中的 平均 函数计算四个样本/物种之间的百分比平均值。随后，利用线性细胞密度进行系统发育分析（见第7节），并利用每个冠状切片中计数的总细胞数估算未成熟神经元/半球的总数。
10. 使用Neurolucida软件上的 Freehand 轮廓工具，在体形直径上画一条垂直于主轴的线。通过此步骤，计算每个物种中至少100个随机选择的DCX阳性（DCX+）两种类型的细胞直径长度（每个脑区25个细胞），以获得1型和2型细胞的体细胞直径范围。

7. 系统发育分析：系统发育树生成

1. 在记事本中用学名列出分析过的物种，然后上传到网站 https://timetree.org/。
   注意：科学名称可通过以下网站查询：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy
2. 点击“to Newick file ”按钮导出获得的树状文件。

8. 系统发育分析：计数系统发育树中的数据整合

1. 在数据表的单独列中列出所有分析物种及其对应的数据（此处为：整个皮层DCX+细胞密度、新皮层DCX+细胞密度和古皮层DCX+细胞密度）。如果每个物种有多个个体，计算所选参数的中位密度平均值。
2. 下载Mesquite项目软件（https://www.mesquiteproject.org/ 年），将系统发育树与计数数据合并。
   注意：该软件要求电脑上已有Java。
3. 点击 “打开文件”打开 Timetree之前保存的 Newick 文件。然后，选择 简单的Newick/Phylip树文件 选项。把文件当作文本处理，保存为“.nex”。
4. 在新打开的页面中，选择“ 分类单元与树” ，然后选择 “新三个窗口”，然后选择 “源头树”。在弹出窗口中，选择 “存储树”，然后按 确定。将显示一个名为 “导入树” 的新标签页。
5. 在 显示 部分对系统发育树进行图形化修改（例如字体、大小、枝条长度与长度成比例）。
6. 在Mesquite上添加一个新标签页，选择 添加 ，然后选择 “新字符矩阵 ”，然后选择字符数量（本研究中，数字=3，对应三个DCX+单元密度）。把字符当作 连续数据来处理。
   注意：特征代表与系统发育树相关的数据。
7. 将将与系统发育树相关的数据复制到新创建的标签页（第6.4部分）并保存。
8. 在导入树 标签页中，选择 分析：树和 追踪字符历史 以执行 简约祖先状态 分析。
9. 存档为PDF。

9. 系统发育分析：脑容量与DCX+细胞密度的相关性

1. 在之前创建的数据表中，添加每个物种的脑容量列。
2. 计算DCX+细胞密度和大脑大小的自然对数。
3. 启动首选统计软件包（https://www.statskingdom.com/linear-regression-calculator.html）并执行简单的线性回归
4. 下载结果文件，并将残差保存为数据表中的新列。
   注意：残差表示数据点偏离回归线的程度。
5. 在数据表中，选择残差栏和包含物种名称的栏。然后，进入 插入 点，选择直方图以图形方式显示残差。

10. 系统发育分析：新皮层扩展与新皮层DCX+细胞密度相关

1. 在之前创建的数据表中，添加一列包含每个物种的新皮层II表面积数据，并计算自然对数。
2. 在统计软件中，使用对数新皮层II表面积作为X变量，对数新皮层DCX+细胞密度作为Y变量，进行简单线性回归。
3. 下载获得的文件，并将残差保存到数据表的新列，在那里可以像步骤9.5那样制作残差图。

结果

所有研究物种大脑皮层中的DCX+细胞一致共享一系列特征，表明存在一个保存良好的未分化神经元群体（见图4A）。简而言之，它们：（i）在皮层II上被地形排列成单层;（ii）展示未成熟神经元不同成熟阶段描述的形态亚型，（a）大量存在小型单极/双极细胞，少数细胞具有类似锥体神经元的复杂树突，（b）大多数共表达未成熟标记PSA-NCAM和DCX，但从未共表达与细胞分裂相关的Ki67抗原， 以及（c）一群大型复杂细胞也表达NeuN，表明它们已开始成熟^22,25。

除了这些共同特征外，当用此处描述的方法量化cINs的线性密度时，样本中物种间差异显著，达到数量级（见图4B）。哺乳动物中未成熟细胞群体存在共同特征，而不同物种间细胞的出现和数量存在显著差异，强烈支持哺乳动物大脑皮层中保留了保存良好的潜在可塑细胞群体的结论，且新皮层在系统发育祖先和

讨论

这里描述的方法在考虑大脑大小和神经解剖结构差异很大的物种时，提供了可比的定量数据。它可用于评估不同哺乳动物大脑中细胞群体的一致性，并跟踪单一物种在出生后到衰老的后续阶段的发展。它假设会涉及较多的大脑（整个半球）和物种，由同一实验室按照采样和固定的质量标准进行处理，然后采用相同的程序进行分析（见图1和图2）。

协议中的关键步骤包括那些由于脑容量及伦理/实际原因（例如受保护哺乳动物物种不允许的程序）无法完全标准化的变量。最常见的是死后间隔（PMI）和组织固定，这些条件可能相似（但不完全相同）。根据我们的经验，这两种情况都有可接受的变异，比如将PMI控制在1小时以内（如羊、马）或15小时（黑猩猩），并通过浸泡找到合适的固定时间（见图2）。在每种情况下，方案是否最优都通过评估组织质量（切片后切片的整体外观、组织和细胞形态、免疫细胞化学染色）来决定。在之前的一...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 福马林	西格玛-奥尔德里奇	HT501128
2-甲基丁烷	西格玛-奥尔德里奇	320404	异戊烷
3,3′-二氨基苯二胺四盐酸水合物	西格玛-奥尔德里奇	D5637
4% 对甲醛	西格玛-奥尔德里奇	441244
牛血清白蛋白	西格玛-奥尔德里奇	A9647
柠檬酸及nbsp;	西格玛	C0759
组织学用DPX装体	西格玛-奥尔德里奇	06522
乙醇	默克	1.00983
乙二醇	西格玛-奥尔德里奇	102466
甘油	西格玛-奥尔德里奇	G7893
过氧化氢溶液	西格玛-奥尔德里奇	H1009
基利克 - O.C.T. 复合体	生物光学	05-9801
Mesquite软件	豆科灌木项目	Mesquite 版本 3.81（构建 955）
新安装	西格玛-奥尔德里奇	1.09016
磷酸盐缓冲（PB）	不	不	定制
磷酸盐缓冲盐水（PBS）	不	不	定制
氢氧化钠	里德尔-德·哈恩	6213
磷酸二干糖二水合钠	西格玛-奥尔德里奇	71645
磷酸钠单碱性二水合物	西格玛-奥尔德里奇	71500
蔗糖	西格玛-奥尔德里奇	S9378
甲苯胺蓝	西格玛-奥尔德里奇	89640
特里顿 X-100	西格玛-奥尔德里奇	T8787
二十岁以上	西格玛-奥尔德里奇	P9416
VECTASTAIN Elite ABC-HRP 套装 过氧化物酶（标准版）	向量实验室	PK-6100
Xylol	西格玛-奥尔德里奇	247642