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方法文章

胎儿及新生小鼠卵巢的全组织免疫染色

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DOI：

10.3791/69455

⸱

2026年4月28日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University

本文内容

摘要

本方案描述了一种对发育中的小鼠卵巢进行整体免疫标记的方法，该方法也可应用于其他小型组织。

摘要

卵巢储备由女性可用于生殖的卵母细胞组成，这些卵母细胞存在于原始卵泡中，每个原始卵泡包含一个卵母细胞，周围环绕着多个颗粒细胞。卵母细胞起源于原始生殖细胞，这些细胞在性腺外形成，并在胚胎发育过程中迁移至正在发育的卵巢。一旦到达卵巢，它们便转化为卵原细胞，并通过有丝分裂进行增殖，但胞质分裂不完全，从而形成由相互连接的细胞组成的生殖细胞囊泡。在囊泡中，这些细胞进入减数分裂并转变为卵母细胞。在小鼠中，出生前两天，这些囊泡开始解体，每个卵母细胞被包裹形成一个原始卵泡。在此过程中，仅部分卵母细胞存活下来，其余的则经历凋亡。目前对囊泡解体和原始卵泡形成的调控机制尚不完全清楚，鉴定参与该过程的分子对于理解这一发育事件至关重要。通过对发育中小鼠卵巢进行整体免疫染色，可利用卵母细胞和体细胞标记物来确定潜在调控分子的定位，并评估基因突变或其他分子改变对原始卵泡形成的影响。卵巢从小鼠胎儿或新生小鼠中取出后，用甲醛固定并进行封闭处理。随后将卵巢与目标蛋白的特异性一抗孵育，再与偶联荧光标记的二抗孵育以检测一抗。最后将卵巢封片，并通过共聚焦显微镜观察。该方法可同时检测多个目标蛋白，也可应用于其他小型组织，如小鼠胎儿睾丸。

引言

整体免疫染色结合共聚焦成像是一种无需切片即可分析小组织中蛋白质表达和细胞形态的有力方法1。该方法首先获取组织样本，进行固定和封闭处理，然后用针对目标蛋白的一抗孵育。一抗可直接偶联荧光染料，也可通过偶联荧光染料的二抗进行间接标记，后者可识别一抗。随后，组织用荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育，以显示细胞核。此步骤对于成像时提供空间定位至关重要。最后，将组织封片并利用共聚焦显微镜观察。另一种用于研究组织形态的技术是将组织包埋于石蜡中，切片后使用苏木精和伊红等染料或抗体进行标记。此外，也可制备冷冻切片并进行免疫染色。然而，这两种技术均涉及切片过程，会导致三维结构信息的丢失。尽管连续切片可在一定程度上弥补该缺陷，但分析过程繁琐，需观察大量切片。因此，整体免疫染色法具有优势，因其可保留组织的三维结构，并可通过光学切片进行可视化观察。

原始生殖细胞（PGCs）发育为卵母细胞以及卵母细胞组装形成原始卵泡，是雌性生育能力的关键环节。PGCs 在胚胎外形成，必须在胚胎发育过程中迁移至卵巢。当 PGCs 到达卵巢后，从大约小鼠胚胎发育第 10.5 天（E 10.5）开始，这些细胞被称为卵原细胞2。卵原细胞进行有丝分裂，但胞质分裂不完全，从而形成相互连接的细胞簇，称为生殖细胞囊（germ cell cysts）3。从 E 13.5 开始，卵原细胞进入减数分裂，转变为卵母细胞，并进展至减数第一次分裂前期的双线期。随着卵母细胞的发育，生殖细胞囊逐渐解体，使每个卵母细胞被一层颗粒细胞包裹，形成包含处于双线期停滞状态卵母细胞的原始卵泡4。在囊结构解体的同时，大量卵母细胞发生丢失，这一过程被认为在原始卵泡形成期间对质量控制具有重要意义。原始卵泡中处于双线期停滞的卵母细胞数量构成了可用于生殖的卵巢储备，直接关系到生育能力。若卵泡形成过程受到干扰，则可能导致卵巢储备减少，从而限制雌性生殖寿命。

采用整体免疫染色法鉴定并分析胚胎期、胎儿期及新生期卵母细胞发育过程中蛋白质的表达。所检测的分子包括 MSY2、SYCP3、ESR1、ESR2、CYP19A1、3βHSD、KIT 和 STAT35,6,7,8,9。该技术还被广泛用于揭示原始卵泡形成的调控机制。将胎儿或新生期卵巢进行体外培养，并暴露于信号分子或抑制剂中。培养卵巢中的卵母细胞可发生类似于体内（in vivo）的原始卵泡形成过程10。卵巢培养已成功用于研究此阶段卵巢发育过程中的类固醇激素6,10,11、KIT8 和 PI3K 信号通路12。培养结束后，使用针对 DEAD-box 解旋酶 4（DDX4，亦称小鼠 vasa 同源蛋白 MVH）的抗体进行整体免疫染色，该蛋白表达于卵母细胞的细胞质中。随后通过共聚焦显微镜观察卵巢，以评估原始卵泡的形成情况。

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方案

所有使用小鼠的实验程序均经过雪城大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的审查和批准。以下方案用于标记出生后第1至第5天的新生小鼠卵巢（示意图见图1）。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 卵巢的收获与固定

  1. 根据美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》以及IACUC批准的动物实验方案，处死新生C57BL/6小鼠。在1×磷酸盐缓冲液（PBS）中解剖卵巢。
    注意：本实验中，新生小鼠的处死方法为断头法，该方法已获本单位IACUC动物实验方案批准。C57BL/6小鼠品系的雄性和雌性新生鼠可通过肛门生殖孔之间是否存在一小块深色斑点进行区分，雄性具有该特征。解剖卵巢时，先在胃部位置剪开，取出肠管；然后沿中线向尾部做纵向切口打开腹腔，并做两个横向切口。在双侧肾脏下方找到卵巢，分别分离每个卵巢，并清除周围多余组织。
  2. 将卵巢直接放入含有600 μL 5.3%多聚甲醛（PFA；使用1×PBS稀释EM级16% PFA至5.3%）的微量离心管中，在室温（RT）下固定。将样本置于摇床上，于4 °C过夜（O/N）孵育。
    ​警告：多聚甲醛具有毒性，应在通风橱或通风良好的区域操作。操作时需佩戴手套、护目镜及防护服，避免皮肤和眼睛接触。废弃物应作为危险废物处理。
  3. 去除固定液，用1 mL含0.1% Triton X-100的1×PBS（PT）快速洗涤卵巢两次，再在摇床上用1 mL PT溶液于室温孵育至少30分钟。随后在摇床上用1 mL PT + 5% BSA（封闭液）于室温封闭至少30分钟，或置于4 °C保存最多2周。

2. 与一抗和二抗孵育

  1. 将一抗用 500 μl PT + 5% BSA 稀释后，在 4 °C 条件下于旋转仪上孵育过夜。在旋转仪上用 1 mL PT + 1% BSA 洗涤三次，每次 30 分钟，室温进行。
    注意：一抗的稀释比例取决于具体抗体。本实验中所示代表性数据使用 DDX4 抗体，稀释比例为 1:200。只要两种一抗来自不同物种，并且一种二抗不会识别另一种二抗的宿主物种，则可同时使用针对两种不同蛋白的一抗（例如，避免同时使用山羊抗小鼠 Alexa 488 和驴抗山羊 Alexa 568）。
  2. 在卵巢与一抗孵育的同时，将稀释后的二抗与少量胚胎粉混合，加入 500 μL PT + 5% BSA 中，在 4 °C 条件下于旋转仪上避光（用铝箔包裹）孵育过夜，以减少二抗的非特异性结合。将二抗溶液在 6000 × g 离心 30 秒，使残余粉末沉降至管底。转移二抗至样品管时，注意不要吸取底部沉淀物。
    ​注意：二抗稀释比例取决于抗体种类。本实验中所示代表性数据使用山羊抗兔 Alexa 488 二抗，稀释比例为 1:200。
  3. 使用预吸附的荧光标记二抗（步骤 2.2 制备）在室温下于旋转仪上孵育 2–4 小时，此后全程避光（用铝箔包裹）。在旋转仪上用 1 mL PT + 1% BSA 洗涤三次，每次 30 分钟，室温进行。

3. 使用 DAPI 标记细胞核并将卵巢固定在载玻片上

  1. 在室温下用 PBS 中 1:1000 稀释的 DAPI 孵育 90 分钟。用 1 mL 1× PBS 洗涤一次。
  2. 使用宽口 200 μL 移液器吸头将卵巢转移至显微镜载玻片上。用针头/注射器吸除多余的 PBS。在卵巢上加入 3 滴封片介质。
  3. 轻轻将盖玻片覆盖在卵巢上，确保封片介质扩散至盖玻片边缘。用指甲油密封盖玻片边缘，待指甲油干燥后，于 -20 °C 保存。

4. 胚胎粉末的制备

  1. 将约 E 12.5–E 14.5 的小鼠胚胎在最小体积的冰上预冷的 1× PBS 中进行匀浆。加入 4 倍体积的冰上预冷丙酮，混匀后在冰上孵育 30 分钟。
    ​注意：丙酮易燃，且对眼睛和皮肤有刺激性。应在通风橱或通风良好的区域中使用。佩戴手套、护目用具和防护服，以避免接触皮肤和眼睛。按危险废物处置。
  2. 在 10,000 ×g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，然后用冰上预冷的丙酮洗涤沉淀物，并再次离心。
  3. 将沉淀物铺展在滤纸上，放入塑料托盘中，在化学通风橱内过夜干燥。研磨成细粉，彻底风干后，于 -20 °C 保存。

5. 通过共聚焦显微镜分析蛋白质表达

  1. 标记目标蛋白后，通过共聚焦显微镜观察其表达。在检测蛋白表达时，我们通常使用 3–4 只动物（6–8 个卵巢），并对每个卵巢采集多张图像。
    ​注意：代表性结果部分描述的图像在转盘共聚焦显微镜或共聚焦激光扫描显微镜上获得。所用参数在代表性结果部分中说明，具体参数将根据所使用的显微镜型号而有所不同。

利用共聚焦显微镜分析原始卵泡的形成与发育

  1. 对卵巢进行标记以识别细胞质卵母细胞标志物（如 DDX4）后，针对每个卵巢，随机分配两个区域或“核心”用于观察。 
    注：每个核心包含 4 个主要光学切片，每个切片大小为 212 × 212 μm，切片之间深度间隔为 15–20 μm。这 4 个光学切片涵盖卵巢皮质和髓质区域，以确保评估卵巢的所有区域。每个卵巢将有 2 个核心，共 4 个光学切片，总计 8 个切片（见 图 2）。
  2. 在获取用于分析的主要光学切片图像后，以该主切片为中心，向上采集 5 张、向下采集 5 张 Z 轴层扫图像，每张图像间隔 1 μm。针对每个主切片，统计该切片中卵母细胞的总数。
  3. 然后，针对主切片中的每一个卵母细胞，通过检查主切片及其上下层的图像堆栈，判断其是否与其他卵母细胞相关联，以确定主切片中的卵母细胞是否与焦平面之上或之下的卵母细胞存在关联。最后，对每一个卵母细胞，确定其所处的卵泡发育阶段（原始卵泡、初级卵泡或次级卵泡）。
    ​注：建议至少分析 4 只动物（8 个卵巢），以获得具有统计学意义的数据。

7. 使用碘化丙啶作为替代性细胞核标记物

  1. 完成步骤 2.3 后，在含有 0.1 mg/mL RNase A 的溶液中孵育 30 分钟（将 10 μL 的 10 mg/mL RNase A 加入 1 mL PT + 1% BSA 中）。去除 RNase A 溶液，加入 10 μg/mL 碘化丙啶（将 10 μL 的 1 mg/mL 碘化丙啶加入 1 mL PT + 1% BSA 中），在室温下于旋转摇床孵育 20 分钟。从此步骤开始，用铝箔包裹离心管。
    注意：碘化丙啶具有毒性和致突变性。应在通风橱或通风良好的区域操作。佩戴手套、护目镜和防护服，避免接触皮肤和眼睛。废弃物应作为危险废物处理。
    备注：Toto-3 也可用作细胞核标记物。
  2. 去除碘化丙啶溶液，用 1 mL PT + 1% BSA 洗涤 30 分钟。跳过步骤 3.1（DAPI 染色）。

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结果

此处所示为采用上述免疫染色方法获得的典型结果。图中 图3, 图4, 图5, 和 图6 使用40倍油镜（NA 1.3），在转盘共聚焦显微镜上采集图像，曝光时间为100–250 ms，激光功率为0.01%–0.1%。在 图3，用针对 DDX4 的抗体对新生小鼠卵巢进行标记，DDX4 是小鼠卵母细胞胞质中表达的一种蛋白质，同时使用核标记物碘化丙啶进行染色。图中显示的是出生后第 1 天（PND 1）小鼠卵巢的共聚焦切片图像 图3A–C 少数卵母细胞位于原始卵泡中，但大多数仍处于生殖细胞囊中。相比之下， 图 3D–F 显示的是出生后第...

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讨论

本报告描述了一种对完整卵巢进行荧光标记以检测目的蛋白的方法。该方法已被广泛用于确定原始卵泡形成过程中蛋白的表达情况，同时也用于表征不同条件下卵泡形成过程中的变化4,5,6,7,8,9,10,11。与组织切片方法相比，该方法的优势在于能够保持组织的三维结构1。

实验步骤中包含细胞核标记环节，因为在显微镜下观察组织时，该步骤可提供空间定位信息16。此处使用DAPI...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

成像工作在雪城大学的布拉特成像中心完成。图7中的图像由蔡司LSM980配备Airyscan2系统获得，该设备由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目S10 OD026946-01A1支持。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R03 HD102016和R21 HD112756（资助给MEP）的支持。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗人VASA抗体（山羊来源）R&DAF2030
抗DDX4/MVH抗体（兔来源）Abcamab13840
抗GCNA1/TRA98抗体（大鼠来源）Abcamab82527
牛血清白蛋白（BSA）FisherBP-1600
盖玻片 22 x 22 #1.5Warner Instruments64-0721
DAPI（粉末）Sigma AldrichD-9542用dH₂O配制5 mg/mL溶液
解剖显微镜
驴抗山羊Alexa 568InvitrogenA11057
驴抗小鼠Alexa 488InvitrogenA21202
驴抗兔Alexa 568InvitrogenA10042
驴抗兔Alexa 647InvitrogenA31573
驴抗大鼠Alexa 488InvitrogenA21208
无水乙醇（200 proof）Pharmco111000200
精细剪刀 - 锐利型Fine Science Tools14060-09用于精细操作，摘除卵巢并修剪多余组织
镊子（Dumont 5号）Electron Microscopy Science72705-01 (0209-5-PO)
山羊抗兔Alexa 488InvitrogenA11008
微量离心管 1.5 mLThermo Scientific3451PK
显微镜载玻片Fisherbrand12-550-123
旋转混合器LabNetS0500
16% 多聚甲醛Electron Microscopy Science15710
培养皿 100 x 15 mmBioplast Manufacturing940-10774
1X 磷酸盐缓冲液（PBS）(Fisher) S271-1;          (Sigma) P9541-500G; (Fisher) BP332-500; (Fisher) P285-500800 mL 超纯水 H₂O               80 g NaCl                     2.0 g KCl                         14.4 g Na₂HPO₄          2.4 g KH₂PO₄          用HCl调节pH至7.4，定容至1 L；使用时从10X稀释至1X
针持Fine Science Tools26016-12用于夹持弯成轻微弧形的直针
带滤芯吸头OneTip(10 μL) 1121-3810;              (20 μL) 1120-1810;          (200 μL) 1120-8810;     (1000 μL XL) 1122-1830
普通吸头OneTIp(10 μL) 1111-3800;          (200 μL) 1111-1800;     (1250 μL) 1112-1820
移液器 0.2-2, 2-20, 20-200, 100-1000Gilson(0.1-2 μL) F144054M;    (2-20 μL) F144056M;   (20-200 μL) F144058M;    (100-1000 μL) F144059M
碘化丙啶，1 mg/mL 溶于 dH₂OInvitrogenP3566
RNase A 粉末Sigma AldrichRG513-50mg用0.1 M 醋酸钠（pH 5.2）配制成10 mg/mL溶液。100 oC加热15分钟。冷却至室温后，加入0.1体积的1 M Tris-Cl（pH 7.4）调节pH
直针将直针弯成弧形，用于切除卵巢多余组织
曲拉通X-100Thermo ScientificX100-100ML
结核菌素注射器 28G x 1/2Tyco/Healthcare Kendall Monoject1180128012
抗荧淬灭封片剂（Vectashield）Vector LaboratoriesH-1900
瓦格纳剪刀Fine Science Tools14068-12用于断头及较大切割操作
宽口移液吸头 20 μLLabCon1026-965-008-9

参考文献

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