网络药理学与 体外 探索噻唑酮衍生物在横纹肌肉瘤中治疗潜力的细胞实验研究

摘要

我们开展了一项研究，基于网络药理学与计算化学系统地探讨噻唑酮衍生物对横纹肌肉瘤的治疗潜力，并通过实验验证与评估其效果 体外 细胞实验

摘要

横纹肌肉瘤（RD）是一种起源于横纹肌母细胞的恶性肿瘤，对儿童和青少年的健康构成严重威胁。基于噻唑酮类衍生物在多种生物活性中的潜力，本研究拟结合网络药理学与体外细胞实验，系统探讨噻唑酮类衍生物在治疗RD中的作用机制。通过网络药理学方法整合高通量数据，预测噻唑酮类化合物的潜在作用靶点；并利用AutoDock Vina软件计算化合物与靶蛋白分子之间的结合能，揭示其与RD相关的信号通路。最后，通过体外细胞实验进一步验证该类化合物的抑瘤作用。采用网络药理学分析噻唑酮类衍生物在治疗RD中的作用靶点，经整合与去重后最终获得172个靶基因。通过化合物与靶蛋白分子对接，筛选出结合能较低的5个蛋白靶点：PIK3CD、AKT1、GSK3B、HSP90AB1和ITGB1。体外细胞培养实验结果表明，某一特定噻唑酮类衍生物对RD细胞系具有显著抑制作用，为发现治疗RD的新靶点和有效化合物提供了科学依据。本研究通过结合网络药理学与体外实验，揭示了噻唑酮类衍生物在治疗RD中的作用机制，为未来药物研发和治疗策略提供了新的视角。

引言

横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma，RD）是一种高度侵袭性的儿童软组织肉瘤，对儿童健康构成重大威胁，目前治疗手段有限。流行病学研究表明，尽管RD发病率相对较低，但其高度恶性及不良预后给临床治疗带来巨大挑战。RD可分为四种不同的组织学亚型：胚胎型、腺泡型、梭形细胞/硬化型和多形型，其中胚胎型横纹肌肉瘤（embryonal rhabdomyosarcoma，ERMS）最为常见^1,2,3。对于新诊断的低危ERMS患者，当前的治疗策略主要采用手术切除局部肿瘤并联合化疗药物，包括长春新碱、放线菌素D和环磷酰胺。高危患者通常接受强化的多药联合化疗方案，加入异环磷酰胺和依托泊苷^4,5。尽管手术、化疗和放疗相结合的多模式治疗在实现局部肿瘤控制和清除微转移灶方面已显示出一定疗效⁵，但仍面临诸多挑战。现有化疗药物具有显著的毒性，包括神经毒性以及不可逆的肾脏和膀胱损伤⁶，对儿童和青少年患者尤其构成风险。此外，RD固有的异质性及其易复发的特性，凸显了开发更有效且靶向性强的治疗药物的迫切需求⁷。

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方案

所有网络药理学操作均按照《网络药理学评价方法指南》²¹进行。本研究采用的综合网络药理学工作流程如图2所示。

噻唑酮衍生物的合成
本研究中所用的噻唑酮衍生物已在我们先前的工作中通过铜催化的远程不对称炔丙基化反应合成¹⁹。该反应以CuI为催化剂，手性Pybox配体（L1）作为立体控制核心，在DIPEA碱和甲醇溶剂体系中于-10 °C反应48小时，实现了炔丙基酯与噻唑酮之间的高对映选择性偶联。目标产物的收率最高可达89%，对映体比（er）为97.8:2.2，非对映体比（dr）为17.8:1。有关该系列化合物合成方法的详细信息，请参见先前的研究¹⁹。该方法表现出广泛的底物适用性，可兼容芳基（邻位、间位、对位取代基）、脂肪链以及稠环炔丙基酯，同时也适用于多种取代的噻唑酮，收率范围为51%至98%。该策略首次通过一步反应高效构建了含多个手性中心的噻唑酮骨架，为合成具有重要潜在应用价值的手性药物分子提供了一种高选择性且简便直接的方法。

网络药理学预测
噻唑酮衍生物的靶点预测：使用 KingDraw 软件生成噻唑酮衍生物的结构式，并通过 Open....

结果

在本研究中，13 种噻唑酮衍生物（化合物 a-m；图 3、图 4）此前已合成¹⁹，并被选用于评估其对癌细胞的抑制活性（图 5）。在这些化合物中，化合物 m 在 100 µM 浓度下对 RD 细胞（胚胎性横纹肌肉瘤细胞）（STR 鉴定）²²表现出最高的抑制率。后续实验通过不同浓度（5 µM、10 µM、20 µM、50 µM、100 µM）处理，测得其对 RD 细胞的 IC50 值为 53.14 µM（图 6B）。如 图 6A 所示，在 10 µM 低浓度下，RD 细胞和 HepG2 细胞的抑制作用均较弱，未观察到显著效应。然而，当浓度为 100 µM 时，RD 细胞的存活率显著低于 HepG2 细胞。

讨论

网络药理学常用于预测和筛选复杂中药成分中的潜在活性分子，并阐明中药复方中多组分、多靶点、多通路协同作用的机制。本研究采用网络药理学方法，通过构建化合物-靶点-通路-疾病网络，系统探讨了我们新合成的噻唑酮衍生物抗横纹肌肉瘤RD细胞的潜在作用机制。在本研究中，我们系统评估了13种噻唑酮衍生物对人横纹肌肉瘤RD细胞增殖的抑制作用，并基于其结构特征进行了构效关系（SAR）分析。所有化合物均表现出不同程度的抗增殖活性，其中化合物m的抑制作用最强，可使细胞活力降至对照组的21.7%。当以100 µM浓度作用于RD细胞和HepG2细胞时，RD细胞的存活率显著低于HepG2细胞，表明化合物m即使在高浓度下对HepG2细胞的抑制作用也较弱，而对RD细胞具有特异性抑制作用。

结构分析表明，苯环取代基的性质对生物活性具有显著影响。与叔丁基或正戊基等大体积取代基相比，乙基等小烷基与更高的活性相关，表明过大的空间位阻可能阻碍与靶标的结合。此外，甲氧基取代的位置起着关键作用：邻位甲氧基化合物 l（RPR = 66.7%）的活性显著高于其对位取代的对应物 a（RPR = 95.0%），提示局部电子效应或构象偏好.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CCK-8 检测试剂盒	Beyotime Biotechnology Co., Ltd.	C0038	一种基于水溶性四唑盐还原生成有色产物来测定细胞活力和增殖的试剂盒。
超净工作台	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd	SW-CJ-1FD	一种提供层流空气的工作站，用于在无菌环境中操作细胞培养物及其他敏感材料。
CO2 培养箱	Heal Force	HF90	一种可控制温度、湿度和 CO2 浓度的环境设备，用于细胞培养以维持最佳生长条件。
DMEM 高糖培养基	cytiva	SH30022.01	一种高葡萄糖浓度（4.5 g/L）的细胞培养基，适用于多种细胞类型，包括快速增殖的哺乳动物细胞。
胎牛血清（FBS）	YEASEN	40130ES76	细胞培养基中常用的添加剂，提供细胞增殖所必需的生长因子、激素和营养成分。
倒置显微镜	OLYMPUS	IX51	一种物镜位于载物台下方的显微镜，可从底部观察培养瓶或培养板中的细胞培养情况。
酶标仪	Diatek	DR-200Bs	一种通过检测吸光度、荧光或发光信号来分析微孔板样品中生物、化学或物理事件的仪器。
磷酸盐缓冲液（PBS）	浙江金诺生物医学科技有限公司	GNM20012	一种常用于生物学研究的缓冲溶液，用于洗涤细胞、稀释溶液以及维持 pH 稳定性。
RD（胚胎性横纹肌肉瘤细胞）（STR 鉴定）	上海复祥生物科技有限公司	FH0712	该细胞系已通过短串联重复序列（STR）分析进行鉴定，具有明确的遗传背景和细胞身份，从而确保实验数据的可靠性和可重复性。
RMPI 1640 改良培养基	cytiva	SH30809.01	一种最初为人类白细胞细胞开发的广泛使用的细胞培养基，现已被应用于多种哺乳动物细胞类型。
胰蛋白酶-EDTA 溶液	浙江金诺生物医学科技有限公司	GNM25200	一种通过消化细胞外蛋白并螯合钙离子来使贴壁细胞从培养表面脱离的溶液。