探索噻唑酮衍生物治疗横纹肌肉瘤治疗潜力的网络药理学和 体外 细胞实验研究

摘要

我们提出了一项研究，该研究基于网络药理学和计算化学系统地研究噻唑酮衍生物对横纹肌肉瘤的治疗潜力，并通过 体外 细胞实验进行验证和评估。

摘要

横纹肌肉瘤（RD）是一种起源于横纹肌母细胞的恶性肿瘤，对儿童青少年的健康构成严重威胁。基于噻唑啉酮类衍生物在多种生物活性中的潜力，本研究拟结合网络药理学和 体外 细胞实验，系统探索噻唑啉类衍生物治疗RD的机制。通过网络药理学，整合高通量数据，预测噻唑酮的潜在靶点。此外，使用AutoDock Vina软件计算化合物与靶蛋白分子的结合能，揭示其与RD相关的信号通路。最后，体 外 细胞实验进一步验证了化合物的肿瘤抑制作用。采用网络药理学分析噻唑酮类衍生物治疗RD的靶点，通过组合和去重，最终得到172个靶基因。通过化合物与靶蛋白分子PIK3CD、AKT1、GSK3B、HSP90AB1和ITGB1的对接，筛选出5个低结合能的蛋白质靶点。 体外 细胞培养实验结果表明，一种特异性噻唑酮类衍生物对RD细胞系具有显著的抑制作用，为发现治疗RD的新靶点和有效化合物提供了科学依据。本研究通过网络药理学和 体外 实验相结合，揭示了噻唑酮类衍生物治疗RD的机制，为未来的药物开发和治疗策略提供了新的视角。

引言

横纹肌肉瘤 （RD） 是一种高度侵袭性的儿科软组织肉瘤，对儿科健康构成重大威胁，治疗选择有限。流行病学研究表明，虽然 RD 的发病率相对较低，但其高恶性肿瘤和不良预后带来了巨大的临床挑战。RD 分为四种不同的组织学亚型：胚胎型、肺泡型、梭形细胞/硬化型和多形型，其中胚胎横纹肌肉瘤 （ERMS） 是最常见的形式 ^1,2,3。目前新诊断的低危ERMS患者的治疗策略主要是手术切除局限肿瘤联合化疗药物，包括长春新碱、放线菌素和环磷酰胺。高危患者通常接受包括异环磷酰胺和依托泊苷在内的强化多药化疗方案 ^4,5。虽然结合手术、化疗和放疗的多模式方法已证明在实现局部肿瘤控制和根除微转移方面有效⁵，但仍然存在重大挑战。目前化疗药物的大量毒性特征，包括神经毒性和不可逆的肾脏和膀胱损伤⁶，对儿科和青少年患者构成特殊风险。此外，RD 固有的异质性及其复发倾向凸显了开发更有效和更有针对性的治疗药物的迫切需求⁷。

在此背景下，这里的研究重点是一类具有独特药理特性的噻唑酮类衍生物。噻唑酮类衍生物表现出显着的抗炎、抗氧化和细胞凋亡^{调节活性8}，显示出广泛的生物活性和^{药物开发的}巨大潜力^9,10。Elgubbi等人的分子对接模拟揭示了噻唑酮衍生物与人碳酸酐酶IX（CA IX）等关键靶标的强结合亲和力，这是一种在侵袭性肿瘤中过度表达的缺氧诱导酶，表明了其抗增殖作用的机制¹¹。计算研究阐明了噻唑酮衍生物与癌症相关蛋白之间的分子相互作用。2024 年，El-Helw 等人报道，基于苯并喹啉的噻唑酮衍生物对癌细胞系表现出强大的活性，其中噻唑硫酮和噻唑类似物表现出最高的疗效¹²。机制研究^10,13 表明这些化合物通过双重途径破坏肿瘤细胞活力：（1） 通过抗氧化途径调节诱导氧化应激和 （2） 直接抑制增殖。这些发现强调了噻唑酮类药物的广泛药理学特征，包括抗炎和抗菌特性。值得注意的是，吡格列酮¹⁴ 和曲格列酮¹⁵ 等化合物主要用于治疗 2 型糖尿病¹⁶，而 4-噻唑酮类衍生物对白血病细胞具有抗增殖作用¹⁷（图 1）。这些化合物不仅在临床研究中显示出巨大的治疗前景，而且还特异性靶向多种细胞信号通路，包括抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡和调节细胞周期。噻唑酮类衍生物的抗癌机制涉及多种信号通路，这些信号通路通过调节PI3K/Akt和NF-κB通路等关键通路来有效阻碍肿瘤细胞的生长和存活。此外，噻唑酮类衍生物还表现出对肿瘤微环境的调节作用，包括抑制血管生成和调节免疫反应¹⁸。噻唑酮衍生物的多方面机制作用使其成为开发新型癌症疗法的理想候选者。

在之前的研究中，我们通过铜催化的远端不对称炔丙烷基化反应有效地构建了具有相邻手性中心的噻唑酮衍生物。以炔丙酯和噻唑酮类为底物，在苯基取代吡啶双（恶唑啉）配体存在下，由CuI催化反应。通过优化反应条件，我们实现了这些噻唑酮衍生物的高效合成¹⁹。网络药理学作为一种系统生物学方法，揭示了药物、靶点和疾病途径之间的复杂相互作用，彻底改变了对癌症等复杂疾病疗法的理解和开发²⁰。本研究初步旨在揭示新型噻唑酮类衍生物在治疗RD中的潜在治疗价值。通过整合网络药理学和细胞实验，将鉴定出具有优越活性的化合物，通过协调调控包括PIK3CD和AKT1在内的5个核心靶点，可能发挥多靶点治疗效果，从而影响PI3K-Akt等关键信号通路。分子对接和分子动力学模拟将用于证明化合物和靶蛋白之间的结合特性。此外，还将建立初步的构效关系模型，为后续结构优化提供参考。这项工作不仅为横纹肌肉瘤的药物开发提供了新的候选分子，而且凸显了多学科策略在探索药物多靶点治疗机制方面的积极作用。

方案

所有网络药理学程序均按照网络药理学评价方法指南²¹ 进行。本研究采用的综合网络药理学工作流程如 图2所示。

噻唑酮衍生物的合成
本研究中的噻唑酮衍生物是在我们之前的工作¹⁹ 中通过铜催化的远程不对称炔丙基化反应合成的。该反应以CuI为催化剂，手性Pybox配体（L1）为立体控制核心，在DIPEA碱和甲醇溶剂体系中，在-10 °C下放置48 h，实现炔基酯和噻唑酮之间的高对映选择性偶联。获得的目标产物的收率高达89%，对映体比（er）为97.8：2.2，非对映体比（dr）为17.8：1。有关该系列化合物的合成方法的详细信息，请参阅之前的研究¹⁹.该方法具有广泛的底物适用性，可容纳芳基（邻位、间位、对位取代基）、脂肪链和熔环炔基酯，以及各种取代噻唑啉酮，产率在51%至98%之间。该策略首次在一步法中高效构建了多手性中心噻唑酮类骨架，为手性药物分子的合成提供了一种高度选择性和直接的方法，在药物化学中具有重要的应用潜力。

网络药理预测
噻唑酮类衍生物的靶点预测：使用KingDraw软件生成噻唑酮类衍生物的结构表示，随后通过Open Babel软件将相应的结构文件转换为SMILES ID。为了预测针对 RD 的潜在治疗靶点，我们采用了一种综合计算方法，利用三个不同的靶点预测数据库：SwissTargetPrediction （http://swisstargetprediction.ch/）、TargetNet （http://targetnet.scbdd.com） 和 SuperPred （https://prediction.charite.de）。对于 TargetNet 分析，我们通过选择概率为 0 的基因来实施严格>过滤标准。在SuperPred数据库中，我们应用了更严格的选择参数，仅保留那些模型准确率>90%、概率>60%的基因，确保了高置信度的目标预测。

RD靶点预测：基于GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）和OMIM数据库（https://omim.org/），我们对横纹肌肉瘤进行了搜索。对于来自 GeneCards 数据库的数据，我们以大于 20 的分数过滤结果，以获得与横纹肌肉瘤相关的基因。

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建与分析：噻唑酮类衍生物的潜在靶点与RD相关基因相交。将噻唑酮类衍生物治疗人胚胎横纹肌肉瘤的潜在靶点上传至STRING数据库（https://www.string-db.org/），进行高置信度靶点PPI（蛋白-蛋白相互作用）关系分析。在Cytoscape软件（http://www.cytoscape.org/）中构建PPI网络，并根据度值筛选核心靶点。

复合-疾病-靶点通路网络构建：药物-靶点-通路网络可以清晰地看到化合物和疾病的靶点以及这些靶点所涉及的通路，从而识别RD复合治疗可能的关键靶点和通路。首先，在电子表格中构建网络表和属性表。网络表的内容主要包括化合物与核心靶点的对应关系、核心靶点与所涉途径的对应关系、RD与主途径的对应关系。属性表的内容主要是对网络表中的所有信息进行分类和命名。之后，打开Cytoscape软件，将网表上传到加载位置，设置起点、终点，上传属性表，最后修改图像形状。

综合功能注释和网络药理学分析 - 构建基因本体（GO）富集，京都基因与基因组百科全书（KEGG）：通过DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对核心靶点进行GO和KEGG富集分析。按照P值从小到大的顺序，选取GO中生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）排名前10的项目进行分析，分析KEGG中的前20个项目，基于在线微生物信息平台创建核心靶点的GO和KEGG气泡图。

分子对接：从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）中选取核心靶蛋白，并下载核心靶点的结构文件。最初，使用 PyMol 软件对蛋白质进行脱水，然后分离配体和受体。随后，使用ADFRSuite软件对蛋白质进行氢化，并获得AutoDock分子对接软件的网格盒参数。使用AutoDock Vina软件制备噻唑烷酮衍生物和核心靶蛋白的pdbqt文件。然后对噻唑啉酮类衍生物和核心靶蛋白进行分子对接模拟。最后，使用PyMol软件对分子对接模型进行可视化。

分子动力学模拟：使用 amber99sb-ildn 力场和 TIP3P 水模型将 PDB 文件转换为与 GROMAS 兼容的 GRO 格式：
gmx pdb2gmx -f Pro.pdb -o Pro_temp_H.gro -ff amber99sb-ildn -water tip3p -ignh
添加一个立方周期边界框，距离蛋白质1.2 nm：
gmx editconf -f Pro_temp_H.gro -o Pro_temp_H_box.gro -c -d 1.2 -bt 立方
盒子里装满了 TIP3P 水分子：
GMX 溶剂化物 -cp Pro_temp_H_box.gro -o Pro_temp_H_box_water.gro -p topol.top
通过添加钠离子对系统进行中和：
GMX GROMP -f ions.mdp -c Pro_temp_H_box_water.gro -p topol.top -ions.tpr
GMX 基因 -s ions.tpr -o Pro_temp_H_box_water_ion.gro -p topol.top -中性
执行了能量最小化：
GMX GROMP -f 最小值.mdp -c Pro_temp_H_box_water_ion.gro -p topol.top -o em.tpr
GMX MDRUN -V -deffnm em
NVT平衡进行：
GMX GROMPP -f NVT.MDP -C em.gro -r em.gro -p topol.top -o NVT.TPR
GMX MDRUN -deffnm nvt -v
NPT平衡进行：
GMX GROMPP -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr
GMX MDRUN -deffnm NPT -V
启动生产分子动力学模拟：
GMX GROMPP -f MD.MDP -C NPT.GRO -T NPT.CPT -p topol.top -O md_0_1.tpr
GMX MDRUN -deffnm md_0_1 -v

模拟完成后，使用视觉分子动力学（VMD）和PyMOL分析所得轨迹，并使用g_mmpbsa程序进行蛋白质和小分子配体之间的结合自由能分析。

药物对RD细胞活力的影响评估
RD 细胞（胚胎横纹肌肉瘤细胞;STR Authenticated）在对数生长阶段进行胰蛋白酶消化以产生浓度为 1 x10⁵ 个细胞/mL 的细胞悬液。然后将该悬浮液以 1 x 10^{4 个细胞} /孔（每孔 100 μL）的密度接种到 96 孔板中，并在 37 °C 下与 5% CO₂ 孵育以允许细胞粘附。粘附后，用含有1%FBS的100μL无血清培养基替换培养基，并将细胞饥饿12小时。随后，将培养基换成100 μL含有不同浓度测试化合物的相应培养基。对照孔用含溶剂培养基或正常培养基处理，仅包含相应培养基而没有细胞的空白孔。将板与5%CO₂ 在37°C下孵育24小时（通过初步实验确定持续时间，以观察此类化合物对RD细胞的最大抑制作用。即细胞密度的OD值达到约1.0所需的时间。此后，向每个孔中加入10μL CCK-8溶液，并将板再孵育1-4小时。最后，使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。溶剂处理的细胞作为对照组，空白孔用于基线校正。细胞活力是根据吸光度读数计算的。

存活率% = [（对照组-空白）-（实验组-空白）]/（对照组-空白）x 100%

结果

在这项研究中，13 种噻唑酮类衍生物（化合物 a-m; 图3， 图4）被先前合成，选择¹⁹ 个用于评估其对癌细胞的抑制活性（图5）。在这些化合物中，100μM的化合物m对RD细胞（胚胎横纹肌肉瘤细胞）显示出最高的抑制率（STR认证）²²。涉及不同浓度（5μM、10μM、20μM、50μM、100μM）的后续实验显示，RD细胞的IC50值为53.14μM（图6B）。如 图6A所示，应用10μM的低浓度对RD细胞和HepG2细胞的抑制作用最小，没有观察到显着影响。然而，当将100 μM应用于RD细胞和HepG2细胞时，RD细胞的存活率明显低于HepG2细胞。

该化合物的SMILES表示如下：C1C...

讨论

网络药理学常用于预测和筛选复杂中药成分中潜在的活性分子，阐明中药制剂中多组分、多靶点、多途径作用的协同机制。在这项研究中，我们应用网络药理学方法，通过构建化合物-靶点-通路-疾病网络，系统地研究了我们新合成的噻唑酮类衍生物对抗RD的潜在机制。在这项研究中，我们系统地评估了13种噻唑酮类衍生物对人横纹肌肉瘤RD细胞增殖的抑制作用。我们根据它们的结构特征进行了构效关系（SAR）分析。所有化合物都表现出不同程度的抗增殖活性，其中化合物 m 表现出最有效的抑制作用，将细胞活力降低到对照的 21.7%。当将100 μM应用于RD细胞和HepG2细胞时，RD细胞的存活率显著低于HepG2细胞，表明化合物m即使在高浓度下对HepG2细胞也表现出较弱的抑制作用，同时对RD细胞表现出特异性的抑制作用。

结构分析表明，苯环取代基的性质对生物活性有显著影响。与叔丁基或正戊基等大取代基相比，小烷基（例如乙基）与增强的效力相关，这表明过多的空间块可能会阻碍靶标结合。此外，甲氧基取代的位置起着至关重要的作用：化合物l（邻甲氧基，RPR = 6...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CCK-8 分析套件	碧昂时生物技术有限公司	C0038	一种用于测量细胞存活率和增殖的试剂盒，基于还原水溶性四唑盐以形成有色产物。
清场	苏州安泰航空科技有限公司	西南-CJ-1FD	一个层流气流工作站，为处理细胞培养及其他敏感材料提供无菌环境。
CO2 孵化器	治疗力	HF90	细胞培养采用温度、湿度及CO<亚于>2控制环境，以维持最佳生长条件。
DMEM高血糖	西提瓦	SH30022.01	一种高葡萄糖浓度（4.5 g/L）的细胞培养基，适用于多种细胞类型，包括快速生长的哺乳动物细胞。
FBS	YEASEN	40130ES76	这是一种常见的细胞培养基补充剂，提供细胞增殖所需的生长因子、激素和营养素。
倒置显微镜	奥林巴斯	IX51	一种设计上物镜位于舞台下方的显微镜，可从下方观察瓶子或平板中的细胞培养物。
微板读取器	迪亚泰克	DR-200B	一种用于通过测量吸收、荧光或发光来检测微板样品中的生物、化学或物理事件的仪器。
PBS	进宇生物医药科技有限公司	GNM20012	缓冲液常用于生物研究中清洗细胞、稀释溶液和维持pH稳定。
RD（胚胎横纹肌肉瘤细胞）（STR认证）	上海富恒生物技术有限公司	FH0712	该细胞系通过短串联重复（STR）分析认证，具有明确的遗传背景和清晰的细胞身份，从而确保实验数据的可靠性和可重复性。
RMPI中型改良型（1640年）	西提瓦	SH30809.01	一种最初为人类白细胞开发的广泛使用的细胞培养基，现已应用于多种哺乳动物细胞类型。
胰蛋白酶-EDTA	进宇生物医药科技有限公司	GNM25200	一种溶液，通过消化细胞外蛋白并螯合钙离子，将粘附细胞从培养表面分离。