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方法文章

高效利用基于有机溶剂的提取与沉淀法从大肠杆菌（E. coli）中纯化弹性蛋白样多肽（ELPs）

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DOI：

10.3791/69465

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2026年1月9日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

本文内容

摘要

本方案描述了一种快速、可重复的基于有机溶剂的提取与沉淀方法，用于从大肠杆菌（Escherichia coli）中纯化弹性蛋白样多肽（ELP），为传统ELP纯化方法提供了一种具有潜在可扩展性的替代方案。

摘要

弹性蛋白样多肽（ELP）是一类通过重复的五肽序列构建而成的工程化生物聚合物，其结构模体模拟了哺乳动物前弹性蛋白中的特征序列。由于具有独特的理化性质，ELP成为多种生物医学应用的理想候选材料，应用范围涵盖药物与基因递送、组织工程以及靶向分子成像等领域。传统的纯化方法自 大肠杆菌 (E. coli）表达可能因包涵体的形成而对弹性蛋白样多肽（ELP）无效。其他方法，例如逆相变循环（inverse transition cycling, ITC），利用ELP的低临界溶解温度（LCST）特性来将其与脂多糖（LPS）等污染物分离，但通常需要多次加热和冷却步骤，耗时较长，且回收率较低，具体效果取决于ELP构建体的序列、浓度和分子量。为应对这些挑战，我们开发了一种基于有机溶剂的萃取-沉淀流程，该方法利用ELP固有的疏水性，实现从样品中快速、稳定且广泛适用的纯化 E. coli 细胞沉淀。该方法利用极性有机溶剂辅助细胞破碎，并在单一步骤中选择性地溶解弹性蛋白样多肽（ELP）。随后的沉淀步骤可有效去除残留的有机溶剂、小分子杂质和内毒素，可在3小时内获得脂多糖（LPS）水平低于1 EU/mL的高纯度ELP。原子力显微镜数据显示，通过该方法纯化的ELP融合蛋白可自组装形成类似反向胶束的结构，并保持融合蛋白的功能。这种快速纯化方法为研究人员提供了一种简便且具有潜在可扩展性的ELP纯化途径，为将ELP及其融合蛋白作为材料学和生物医学应用中的灵活构建单元开辟了新的可能性。

引言

弹性蛋白样多肽（Elastin-like polypeptides, ELPs）是一类由重复的 (VPGXG)n 基序组成的生物聚合物1,2,3,4,5,6,7,8,9。五肽单元中的客体残基 X 可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。通过改变 X 残基，可调节 ELP 构建体的疏水性、热相变行为及功能特性，从而构建模块化的生物相容性材料，这些材料已在多种生物医学应用中得到广泛研究10,11,12。

尽管化学合成可用于制备短肽，但该方法不适用于高分子量的弹性蛋白样多肽（ELP），也不利于保留融合蛋白的功能性13,14。由于这些原因，ELP通常在大肠杆菌（E. coli）中进行重组表达，从而实现序列明确且大量生产。然而，这种方法也存在挑战。ELP在E. coli中表达时，常积聚于致密的包涵体中，因此需要高效的回收策略以提取功能性蛋白15。此外，细菌表达会引入不需要的生物分子，如宿主细胞蛋白、核酸和脂多糖（内毒素），这些杂质必须在纯化过程中与ELP分离。对于我们的ELP融合序列，传统的增溶策略（如使用去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）或Triton X-100，或变性剂尿素）效果有限。根据我们的经验，Triton和尿素无法从沉淀相中有效提取ELP，而SDS虽可实现部分增溶，但会干扰后续的亲和纯化，且难以从疏水性ELP序列中完全去除。

迄今为止，反向相变循环（ITC）仍是ELP最广泛使用的纯化方法。该技术利用ELP的低临界溶解温度（LCST）特性，通过温度和盐浓度梯度选择性地使其沉淀并重新溶解16。然而，对于分子量较低的蛋白质，ITC是一种耗时的多步过程，尤其不适用于包涵体中截留的ELP，需要进行多次ITC循环，而每一步都可能导致蛋白质损失7,16。

为了克服这些限制，我们采用了基于有机溶剂的提取和沉淀工作流程。虽然Yakhnin et al. 于1998年首次报道了一种基于疏水性驱动的分配策略，利用乙醇和盐梯度纯化GFP17, 我们开发的新方法采用有机溶剂混合物直接从 E. coli 细胞7. Sweet 等人. Darji 等人将该方法改进用于 ELP 融合蛋白，表明有机溶剂萃取可实现功能性 ELP 的快速回收，同时保持其结构完整性和生物活性8,9该方法利用超声处理和有机溶剂，在一步操作中裂解细菌细胞并提取弹性蛋白样多肽（ELPs），同时使大部分宿主蛋白和核酸沉淀。通过回收富含ELPs的有机相，随后快速沉淀以将ELPs从溶剂及溶解的杂质中分离，可获得高纯度的ELPs。该方法还可用于从复杂样品中获得高纯度的ELPs。 E. coli 内毒素水平低于1 EU/mL的沉淀物，耗时不足三小时7,8.

迄今为止的研究表明，该方法无需多次反向温度循环（ITC）或溶解步骤，即可纯化不同分子量和等电点的ELP构建体及ELP融合蛋白（图1）。原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）成像显示，通过该方法纯化的ELP融合蛋白可形成类似反向胶束的结构（图2），从而在有机溶剂萃取过程中有助于维持ELP融合结构域的结构与功能。这一简化的操作流程使得ELP的纯化更加快速且可靠，适用于多种生物医学应用7,8。值得注意的是，Aayush 等人报道，通过该方法纯化的ELP构建体保留了表皮生长因子受体结合功能18，这表明该方法不仅能获得高纯度的ELP材料，还能维持融合蛋白结构域的生物活性。

为进一步展示该方法在分离ELP-酶融合蛋白中的实用性，我们描述了一种基于有机溶剂的详细纯化方法，用于纯化ELP-Intein-分支酸变位酶2（ELP-I-Cm2）构建体（图3）。该方法可能适用于其他ELP在药物递送和纳米材料应用中的快速纯化。

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方案

1. 材料准备

  1. 菌株：使用化学感受态的 Escherichia coli BL21(DE3) 作为表达宿主。
    注：选择该菌株是由于其具有高转化效率，并适用于重组蛋白的生产。
  2. 表达质粒：使用编码 ELP-I-Cm2 融合蛋白并带有氨苄青霉素抗性的 pET21(+) 载体9。质粒载体可从 addgene 购买。在内含肽末端的 BsrG I 位点插入 Cm2 基因。
    注：该蛋白的质粒 DNA 序列见于补充文件 1。
  3. 培养基：配制 1200 mL 的优质肉汤（Terrific Broth, TB）培养基
    1. 将 16 g 胰蛋白胨、32 g 酵母提取物、16 g 脯氨酸和 6.8 mL 甘油加入 1100 mL 超纯水中，配制培养基（第一部分）。充分混匀以溶解所有组分，再用超纯水定容至 1200 mL。
    2. 配制磷酸钾缓冲液（第二部分）：将 23.1 g KH2PO4 与 125.4 g K2HPO4 混合，加超纯水定容至 1 L。
    3. 将两部分组分（第一部分和第二部分）分别进行高压灭菌。灭菌后，在无菌条件下将 TB 基础培养基分为四份，每份 300 mL，每份加入 33 mL 磷酸盐缓冲液，混匀即得培养基。
  4. 表达添加剂
    1. IPTG：使用 IPTG 进行诱导，终浓度为 1.2 mM（例如，向 330 mL 培养液中加入 396 µL 的 1 M IPTG）。
    2. 抗生素：加入氨苄青霉素至终浓度为 100 µg/mL，以确保质粒筛选。
  5. 裂解缓冲液（pH 8.5）：配制含 10 mM Tris 碱和 22 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）的裂解缓冲液。根据需要使用 HCl 或 NaOH 将 pH 调至 8.5。
  6. 用于提取的有机溶剂
    1. 使用多种有机溶剂（表 1）从包涵体中提取 ELP-I-Cm2 融合蛋白。分别单独使用或以二元组合（1:1 vol:vol）测试这些溶剂，以评估提取效率和 ELP 纯度。
      注：所用所有溶剂均为 HPLC 级，乙腈为 Optima 级，乙醇为 USP 级，1-丁醇为 99% 纯度。
      警告：上述所有溶剂均具有挥发性和易燃性。操作时必须在化学通风橱内进行，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、腈类手套和护目设备）。许多类型的塑料器皿与有机溶剂不兼容。建议在提取-沉淀实验中使用聚丙烯材质的塑料器皿；若使用其他器皿，应先在无珍贵样品的情况下进行测试，以确认其适用性。溶剂废液的处理应遵循相关机构的危险废物管理规定。

2. 细胞裂解与样品制备（图4A）

  1. 重悬：称取1 g细胞沉淀，加入4 mL新配制的裂解缓冲液重悬。轻轻涡旋，直至沉淀完全分散并与缓冲液充分混匀。
  2. 酶解裂解：加入约5 mg溶菌酶以促进细胞壁消化。将悬液在4 °C孵育1小时，以实现部分酶解，增强细胞裂解效果。
  3. 超声处理：孵育后，进行超声处理以完成细胞裂解并剪切基因组DNA。使用微探头超声仪短时脉冲处理（350 W设备，功率等级3），间隔进行以避免过热（例如，开启5秒/关闭10秒，根据需要重复）。将样品置于冰上超声，持续施加超声能量，直至获得无可见颗粒的均一裂解液，通常需5–8分钟。
    注意：超声完成后，保留100 μL样品（或裂解液）用于ELP表达分析，以监测提取和沉淀步骤前后的纯化进展。
  4. 离心与表达分析。
    1. 将裂解液在20 °C、10,000 g条件下离心10分钟以澄清，随后小心分离上清液（可溶性组分）与沉淀（不溶性/包涵体组分）。
    2. 通过SDS-PAGE分析两组分中的ELP表达：取上清液等分试样（例如，10–20 µL），并将等量沉淀用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl，1 mM EDTA）重悬至相同体积；分别加入4x Laemmli缓冲液至终浓度1x，95 °C加热5分钟，上样等量样品以实现直接比较。
    3. 若目标ELP主要存在于可溶性组分中，则使用澄清后的上清液进行有机溶剂提取。若其主要存在于不溶性组分（包涵体）中，则弃去上清液，继续对沉淀进行包涵体操作流程（洗涤/溶解与提取），即通过有机溶剂提取处理沉淀。
  5. 沉淀洗涤与干燥（仅适用于包涵体形式的ELP）：将离心管倒置，借助重力排尽残留裂解缓冲液。待可见液体流尽（约1–2分钟）后，将沉淀在室温下晾干5–10分钟，确保其无多余水分后再进行有机溶剂提取。

3. 有机萃取（图4B）

注意：每种弹性蛋白样多肽（ELP）均有其特定的溶剂条件以获得高纯度的提取物（例如，图1 中的乙酸性能）。因此，应初步筛选28种有机溶剂及其组合，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析所得分离产物，以确定目标构建体的最佳溶解效率条件。

  1. 溶剂筛选。分别筛选步骤1.6中列出的单一溶剂及其1:1（v/v）二元溶剂混合物。评估其他比例混合物（如1:2、2:1、4:1）以提高该工艺的效率。
    注意：目前尚无合理选择最有效溶剂或组合的指导原则，因此需要开展筛选实验，从以往成功溶解疏水性蛋白聚集体的溶剂中进行选择。最终用于纯化的有机溶剂萃取剂的选择应基于该筛选所得样品的SDS-PAGE分析结果。
  2. 提取步骤
    1. 溶剂添加：向裂解后获得的空气干燥沉淀/上清液中加入4 mL有机溶剂或溶剂混合物。对于混合溶剂，需确保精确的体积比（例如，1:1混合时每种溶剂各加2 mL）。
    2. 涡旋振荡：剧烈涡旋悬浮液1分钟，以确保溶剂与沉淀充分混合并渗透。
    3. 孵育（保留时间）：将悬浮液在20 °C下孵育5分钟，确保胞外蛋白有足够时间聚集并沉淀，而ELP则溶解于有机相中。
    4. 离心：在20 °C下以13,000 × g 离心10分钟，使溶解的蛋白质与残余不溶性杂质分离。
    5. 上清液收集：小心收集上清液，避免扰动沉淀。上清液中含有溶解的ELP，而沉淀中含有宿主细胞蛋白、核酸和脂质。
    6. 体积测定：精确记录回收上清液的体积。应确保上清液中不含任何沉淀颗粒。该测量值对后续沉淀步骤至关重要。

4. 蛋白质沉淀

  1. 反溶剂添加：向有机上清液中加入丙酮或乙腈，添加体积为上清液测量体积的2.33倍。
  2. 孵育：将混合物在20 °C下孵育5–7分钟。
  3. 离心：在20 °C下以10,000 g离心10分钟。
  4. 沉淀物处理：离心后，小心弃去上清液，并将样品在未加盖的条件下置于温和的氮气气流下吹干10–15分钟；或者将未加盖的离心管倒置放在通风橱内的无绒布上，在20 °C下孵育1小时（切勿加热）。

5. 蛋白质沉淀物的处理与重悬

  1. 重悬：沉淀并风干后，将蛋白质沉淀物重悬于50 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中。轻轻吹打数次，确保沉淀完全溶解。
  2. 保存：将重悬后的蛋白质于-20 °C保存，适用于短期至中期使用。避免反复冻融，以维持蛋白质的功能完整性。

6. 通过 SDS-PAGE 进行验证

  1. 样品制备：将纯化的蛋白质与4× SDS-PAGE上样缓冲液按3:1的比例混合，短暂涡旋以确保均匀。
  2. 电泳条件：将样品上样至15% SDS-PAGE凝胶（用于ELP-I-Cm2），在100–120 V电压下电泳，直至示踪染料迁移至凝胶底部。
    注意：凝胶中的交联百分比应根据目标ELP构建体的大小进行调整。
  3. 染色与显影：使用Instant Blue考马斯亮蓝染色液或其他合适的染色剂，在20 °C下染色2小时。用去离子水冲洗脱色，直至背景清晰。通过活性检测实验验证所分离的蛋白质，以确认在有机溶剂萃取-沉淀纯化流程后仍保留了蛋白质活性。

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结果

完成方案的最后阶段后，下一步是通过SDS-PAGE分析和考马斯亮蓝染色来可视化提取-沉淀结果。如果在有机提取之前有裂解步骤，则应能明显看到ELP条带。对于ELP-I-Cm2，该条带出现在100 kDa处（图3A）。

不同有机溶剂组合的筛选显示出可变的提取效率（图3B），每种组合产生的浓度和纯度均不相同。我们根据融合蛋白的纯度和功能检测结果，选择最优的组合用于后续该构建体的大规模ELP纯化中的提取-沉淀步骤。对于ELP-I-Cm2而言，AG（异丙醇：乙腈）和BG（丁醇：乙腈）1:1混合物相比其他组合获得了最高的蛋白回收率（2.2–2.6 g/L）。

为了确定纯化的ELP在有机萃取后是否仍保持功能，应进行融合蛋白活性检测。以ELP-I-Cm2为例，进行了Cm2酶活性检测（图2C）。该检测通过Cm2酶催化分支酸转化为预苯酸，并进一步转化为苯基丙酮酸的过程来...

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讨论

等温滴定量热法（ITC）此前已被用于非色谱法纯化弹性蛋白样多肽（ELP）19；然而，该方法可能耗时较长且产率较低。在上述方法中，我们描述了一种快速纯化ELP-I-Cm2融合蛋白的方法，展示了基于有机溶剂的萃取-沉淀法如何有效用于多种ELP及其融合蛋白的纯化。与ITC相比，该有机溶剂法不仅更快，而且对较短的ELP序列更为有效，而这些序列可能对ITC方法构成挑战。此外，该方法在工业应用中可能比ITC更具可扩展性。该方法在操作流程的每一步均能高效去除杂质，包括核酸、脂多糖（LPS）、代谢物和宿主细胞蛋白。本实验室此前的研究表明，该方法适用于多种ELP构建体，不受序列长度或等电点的影响（图1），使其成为ITC的一种有前景的替代方案7,9,18。与依赖ELP热响应特性并需要多次加热和冷却循环的ITC不同，该方法将纯化过程简化为一步式分配策略，具有高纯度和良...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢普渡大学癌症研究所和美国国立卫生研究院CCSG项目（CA23168）对本工作的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇Bio-Rad161-0710SDS-PAGE 组分
30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺TCIA3218SDS-PAGE 组分
丙酮Fisher ScientificA949有机溶剂
乙腈Fisher ScientificA996有机溶剂
氨苄青霉素Gold Bio- Gold BiotechnologyA-301-25抗生素
APS（过硫酸铵）Bio-Rad1610700SDS-PAGE 组分
丁醇Fisher ScientificL13171有机溶剂
EDTAFisher BioreagentsBP118-500裂解缓冲液组分
乙醇Decon LabsUN1170有机溶剂
乙酸乙酯Fisher ScientificE195有机溶剂
甘油Research Products InternationalG22020-0.5优质肉汤（TB）培养基组分
盐酸Fisher ScientificA144SI-212裂解缓冲液组分
Instant Coomasie 染色液Abcamab119211SDS-PAGE 组分
IPTGGold Bio- Gold Biotechnology12481C25蛋白表达组分
异丙醇Fisher ScientificA451-1有机溶剂
K2HPO4（磷酸氢二钾）Wards' Science470302-246Part 2 缓冲液组分
KH2PO4（磷酸二氢钾）Wards' Science470302-254Part 2 缓冲液组分
L-脯氨酸Research Products InternationalP5200-500.0优质肉汤（TB）培养基组分
溶菌酶Gold Bio- Gold BiotechnologyL-040-1裂解缓冲液组分
甲醇Fisher ScientificA452有机溶剂
天然样品缓冲液Bio-Rad161-0738SDS-PAGE 组分
蛋白分子量标准Gold Bio- Gold BiotechnologyP008-500SDS-PAGE 组分
分离胶缓冲液Bio-Rad1610798SDS-PAGE 组分
十二烷基硫酸钠（SDS）Thermo ScientificJ18220-36SDS-PAGE 组分
氢氧化钠Fisher ScientificS318-500裂解缓冲液组分
浓缩胶缓冲液Bio-Rad1610799SDS-PAGE 组分
TEMEDBio-Rad1610801SDS-PAGE 组分
Tris 碱Fisher BioreagentsBP-152裂解缓冲液组分
胰蛋白胨Research Products InternationalT60065-1000.0优质肉汤（TB）培养基组分
酵母提取物Research Products InternationalY20025-1000.0优质肉汤（TB）培养基组分

参考文献

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