利用有机溶剂提取和沉淀方法高效纯化大 肠杆 菌中弹性蛋白样多肽（ELPs）

Summary

该方案描述了一种快速且可重复的有机溶剂提取和沉淀方法，用于从 大肠杆菌 中纯化弹性蛋白样多肽（ELP），为传统ELP纯化方法提供了潜在可扩展的替代方案。

Abstract

弹性蛋白样多肽（ELP）是由重复的五肽序列构成的工程生物聚合物，模仿哺乳动物对层蛋白中的基序。它们独特的特性使其成为广泛生物医学应用的理想候选，涵盖药物和基因递送、组织工程及靶向分子成像等领域。传统从 大肠杆 菌（E. coli）表达的纯化方法对ELP可能无效，因为会形成包涵体。其他方法如逆转移循环（ITC）利用ELP较低临界溶液温度（LCST）特性将其与脂多糖（LPS）等污染物分离，但通常需要多次加热和冷却步骤，耗时且根据ELP构造的序列、浓度和分子量不同，回收率可能较低。为应对这些挑战，我们开发了一种基于有机溶剂的萃取-沉淀工作流程，利用ELP固有的疏水性，实现快速、稳健且广泛适用的大 肠杆 菌颗粒纯化。该方法利用极性有机溶剂辅助细胞破坏，并在单步内选择性溶解ELP。随后的沉淀步骤有效去除残留的有机溶剂、低分子杂质和内毒素，3小时内获得高度纯度高的ELP，LPS水平低于1 EU/mL。原子力显微镜数据表明，通过这种纯化方式纯化的ELP融合蛋白可以自组装成反向胶束状结构，从而保留融合蛋白的功能。这种快速纯化方法为研究人员提供了一种简单且具可扩展性的ELP纯化方式，为利用ELP及其融合蛋白作为材料和生物医学应用的灵活构建模块创造了新可能。

Introduction

类弹性蛋白多肽（ELPs）是由重复（VPGXG）n基序1,2,3,4,5,6,7,8,9基序组成的生物聚合物。五肽单元中的客残基X可以是脯氨酸以外的任何氨基酸。X的变异可用于调节ELP构造的疏水性、热转变行为和功能特性，从而创造出模块化的生物相容材料，这些材料已被广泛应用于各种生物医学应用中，10,11,12。

虽然化学合成可用于产生短肽，但不适合高分子量ELP或保持融合蛋白的功能性（^13,14）。基于上述原因，ELPs通常在大肠杆菌中以重组方式表达，从而实现大量序列定义的生产。然而，这种做法也可能带来挑战。在大肠杆菌表达过程中，ELPs常常积累在致密包涵体中，需要高效的回收策略来提取功能性蛋白¹⁵。此外，细菌表达会引入不需要的生物分子，如宿主细胞蛋白、核酸和脂多糖（内毒素），这些在纯化过程中必须从ELP中分离。传统的溶解方法包括洗涤剂（如十二烷基硫酸钠（SDS）或Triton X-100）或尿素等逆调剂，但在我们的ELP融合序列中取得了有限的成功。根据我们的经验，特里同和尿素未能从颗粒相中提取ELP，而SDS则实现了部分溶解，但干扰了下游亲和力纯化，且难以完全从疏水ELP序列中去除。

迄今为止，逆转移循环（ITC）仍是ELP最广泛使用的纯化方法。该技术利用其LCST行为，选择性地沉淀并重新溶解ELP，跨越温度和盐分梯度¹⁶。然而，对于低分子量蛋白，ITC是一个耗时且多步骤的过程，不适合被困在包涵体中的ELP，需要多次ITC循环，可能导致每步^7,16的蛋白质流失。

为克服这些限制，我们采用了基于有机溶剂的提取和沉淀工作流程。虽然Yakhnin等人于1998年首次展示了利用乙醇和盐梯度进行GFP纯化的疏水性驱动分配^策略，但我们开发的新方法则利用有机溶剂混合物直接从大肠杆菌^细胞中提取ELP融合蛋白7。Sweet等人和Darji等人将该方法应用于ELP融合，证明有机溶剂提取能够快速恢复功能性ELPs，同时保持结构完整性和^{生物活性8,9}。该方法利用超声波和有机溶剂在一次作中裂解细菌细胞并提取ELPs，同时沉淀大部分宿主蛋白和核酸。回收富含ELP的有机相，随后快速沉降以分离ELPs与溶剂和可溶杂质，得到高度纯净的ELP。该方法还能在三小时内从内毒素水平低于1 EU/mL的大肠杆菌颗粒中获得纯ELP，7,8。

迄今为止的研究表明，该方法能够纯化不同分子量和等电点的ELP构造体和ELP融合蛋白，无需多次ITC循环或溶解步骤（见图1）。原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）成像表明，以这种方式纯化的ELP融合蛋白会形成反胶束状结构（见图2），从而有助于在有机溶剂萃取过程中保持ELP融合域的结构和功能。这种简化的工作流程使得ELP纯化更快速、更可靠，适用于多样化的生物^{医学应用7,8}。值得注意的是，Aayush等人报告称，通过该方法纯化的ELP构造保留了表皮生长因子受体结合功能¹⁸，表明该方法不仅能产生纯ELP物质，还维持融合蛋白结构域的活性。

为了进一步展示该方法在分离ELP-酶融合中的实用性，我们描述了一种详细的有机溶剂纯化ELP-肠蛋白-弦酸突变酶2（ELP-I-Cm2）构造体的方法（见图3）。该方法可能适用于药物递送和纳米材料应用中的其他ELP的快速纯化。

Protocol

1. 材料准备

1. 细菌株：使用大 肠杆 菌BL21（DE3）化学功能良好的细胞作为表达宿主。
   注：选择它们是因为其高转化效率和适合重组蛋白生产。
2. 表达质粒：使用编码ELP-I-Cm2融合蛋白的pET21（+）载体，氨苄青霉素耐药^性9。从Addgene购买质粒载体。在中间端使用BsrG I位点插入Cm2基因。
   注意：该蛋白的质粒DNA序列见 补充文件1。
3. 培养基：1200毫升培养基的Terrific Broth（TB）培养基制备
   1. 制备培养基（第一部分），加入16克色酮、32克酵母提取物、16克脯氨酸、6.8毫升甘油到1100毫升超纯水。充分混合以溶解所有成分。用超纯水将最终体积调整为1200毫升。
   2. 通过混合23.1克KH₂POO₄ 和125.4克K₂HPO₄，准备磷酸钾缓冲液（第二部分），然后用超纯水将体积调至1升。
   3. 分开用高压灭菌处理（第1和第2部分）。高压菌封存后，将结核菌碱分为四个300毫升分量组组装培养基。在无菌条件下，每个分量中加入33毫升磷酸盐缓冲液。
4. 表达的添加剂
   1. IPTG：在最终浓度1.2 mM下使用IPTG进行诱导（例如，将396微升1M IPTG加入330 mL培养液中）。
   2. 抗生素：将氨苄青霉素加入至最终浓度100 μg/mL，以确保质粒选择。
5. 裂解缓冲液（pH 8.5）：用10 mM三碱和22 mM乙烯二胺四醋酸（EDTA）制备裂解缓冲液。根据需要使用盐酸或氧化钠调整pH至8.5。
6. 用于提取的有机溶剂
   1. 使用多种有机溶剂（见表1）从包涵体中提取ELP-I-Cm2融合蛋白。单独测试这些溶剂，也可以以二元组合（1：1 vol： vol）测试，以评估效率和ELP纯度。
      注意：除乙腈（Optima级）、乙醇（USP级）和1-丁醇（99%纯度）外，所有溶剂均为高效液相色酸级。
      注意：上述所有溶剂均为挥发性和易燃性。它们必须在化学排气柜内使用适当的个人防护装备（实验服、丁腈手套和护目镜）处理。许多类型的塑料制品与有机溶剂不兼容。聚丙烯塑料制皿强烈推荐用于有机溶剂的提取-沉淀实验;否则，应在无贵重样品的情况下对所用塑料制品进行检测，以确保其适合使用。溶剂废物的处置应遵循相关机构危险废物政策中规定的程序。

2. 细胞裂解与制备（图4A）

1. 再悬浮：称1克细胞沉淀，并重新悬浮于4毫升新鲜制备的溶解缓冲液中。轻轻旋转，直到颗粒完全分散并与缓冲液混合。
2. 酶解：加入~5毫克溶菌酶以辅助细胞壁消化。让悬浮液在4°C下孵育1小时。这有助于部分酶促消化，促进细胞裂解。
3. 超声波：培养后，对样本进行超声处理，完成细胞裂解并剪切基因组DNA。使用短时间的微尖探针超声波（350瓦设备，功率等级3），并分段避免过热（例如5秒开机/10秒关机，按需重复）。在冰上对样品进行超声波处理，并施加超声波能量，直到得到无可见颗粒的均匀裂解液，通常持续约5-8分钟。
   注意：超声波处理完成后，保存100微升样品（或裂解液）分量，用于ELP表达分析，以监测提取和沉淀步骤前后的纯化进展。
4. 离心与表达分析。
   1. 在10,000 克 离心，20°C下10分钟澄清裂解液，然后小心分离上清液（可溶性分馏）与沉积物（不溶性/包裹体分率）。
   2. 通过SDS-PAGE评估两组分的ELP表达：取出一小段上清液（如10-20微升），并将等量沉淀物重新悬浮于溶解缓冲液中（50 mM Tris-HCl pH 8.0,150 mM NaCl，1 mM EDTA）至相同体积;用4倍Laemmli缓冲液混合，最终1倍，95°C加热5分钟，并均匀加注以便直接比较。
   3. 如果目标ELP主要为可溶性，则使用澄清的上清液进行有机溶剂萃取。如果主要为不溶性（包涵体），则丢弃上清液，继续包裹体工作流程（清洗/溶解和提取），通过有机溶剂萃取处理沉淀。
5. 颗粒清洗和干燥（仅适用于包裹体中的ELP）：倒置离心管，以便重力辅助引流残留裂解缓冲液。当可见液体排出（~1-2分钟）后，将颗粒置于室温自然风干5-10分钟，确保无多余水分后再进行有机提取。

3. 有机提取（图4B）

注意：每种ELP都有其偏好的高纯度提取溶剂条件（例如 图1中的交流性能）。因此，应对28种有机溶剂及其组合进行初步筛选，并分析PAGE对分离物，以确定目标构造的最佳溶解效率条件。

1. 溶剂筛选。筛选步骤1.6中展示的单个溶剂及其1：1（v/v）二元溶剂混合物。评估额外的混合比例（例如1：2、2：1、4：1），以提升过程的效果。
   注意：目前尚无合理选择最有效溶剂或组合的指导原则，因此需要开展筛选活动，从先前成功溶解疏水性蛋白聚集体的溶剂中进行筛选。最终选择用于纯化的有机溶剂萃取应基于对该筛选所得分离物的SDS-PAP分析。
2. 提取程序
   1. 溶剂添加：在溶解后获得的空气干燥沉淀/上清液中加入4毫升有机溶剂或溶剂混合物。对于混合组合，确保精确的体积比例（例如，1：1组合中每种2毫升）。
   2. 涡旋：剧烈使悬浮液旋转1分钟，确保溶剂充分混合并渗透到沉淀中。
   3. 培养（保留时间）：让悬浮液在20°C下孵育5分钟，确保细胞外蛋白有足够的相互作用时间聚集和沉积，同时ELPs在有机相中溶解。
   4. 离心：在13,000×克 下，20°C离心10分钟，以分离溶解蛋白与残留的不溶性碎屑。
   5. 上清液收集：小心收集上清液，不扰动沉淀。上清液含有溶解的ELP，而沉淀则含有宿主细胞蛋白、核酸和脂质。
   6. 体积测量：精确记录回收的上清液体积。应注意确保上清液中没有任何颗粒颗粒。这一测量对于下游降水步骤至关重要。

4. 蛋白质沉淀

1. 抗溶剂添加：在测得体积的2.33倍处向有机上清液中加入丙酮或乙腈。
2. 孵育：将混合物在20°C下孵育5-7分钟。
3. 离心：在20°C下以10,000 克 离心机离心10分钟。
4. 颗粒处理：离心后，小心丢弃上清液，并将样品晾干，将试管置于温和的氮气流下，未盖盖，10-15分钟;或将未盖离心管倒置在无绒布湿巾上，在排气罩中20°C下孵育1小时（勿加热）。

5. 蛋白颗粒处理与悬浮

1. 再悬浮：沉淀并自然干燥后，将蛋白沉淀重新悬浮于50微升磷酸缓冲盐水（PBS）中。轻轻上下移液器，确保沉淀完全溶解。
2. 储存：将再悬浮蛋白储存在-20°C，用于短期至中期使用。避免反复冻融循环，以保持蛋白质的功能完整性。

6. 通过SDS-PAGE进行验证

1. 样品制备：将纯化蛋白与4×SDS-PAGE加载缓冲液以3：1比例混合，并短暂进行涡旋以保证均匀性。
2. 电泳条件：装入15% SDS-PAGE凝胶中，进行ELP-I-Cm2，并以100-120伏运行，直到追踪染料到达底部。
   注意：凝胶中交联百分比应基于感兴趣的ELP构造体大小
3. 染色与可视化：用即刻蓝色Coomassie染色剂或其他合适的染色剂在20°C下染色2小时。 用去离子水冲洗，直到背景清澈。检测活性检测中分离出的蛋白质，以验证有机溶剂萃取-沉淀纯化流程后活性的保留。

Results

完成实验流程的最后阶段后，下一步是通过SDS-PAGE分析和Coomassie蓝染色对提取-沉淀结果进行可视化。在有机提取前进行裂解步骤时，应明显可见ELP带。在ELP-I-Cm2的情况下，该带出现在100 kDa（见图3A）。

对不同有机溶剂组合的筛选显示提取效率各异（见图3B），每种组合产生的浓度和纯度各异。我们根据融合蛋白的纯度和功能测定选择最佳萃取-沉淀组合，用于后续更大规模的ELP纯化。AG（异丙醇：乙酰腈）和BG（丁醇：乙腈）1：1的混合物在ELP-I-Cm2病例中产生了最高的蛋白质回收率（2.2-2.6 g/L）。

为了确定纯化后的ELP在有机提取后是否仍具功能性，应进行融合蛋白活性分析。以ELP-I-Cm2为例，进行了Cm2酶活性检测（见图2C）。该检测方法测量在Cm2酶存在下，chorismate转化为prephenete，随后转化...

Discussion

ITC此前曾用于ELP¹⁹的非色谱纯化;然而，这可能是一种耗时且产量较低的方法。在上述方法中，我们描述了ELP-I-Cm2融合蛋白的快速纯化方法，展示了有机溶剂基提取-沉淀法如何有效用于多种ELP和ELP融合的纯化。有机溶剂协议不仅比ITC更快，而且对于较短的ELP序列更有效，这些序列可能挑战ITC方法。在工业应用中，它可能比ITC更具可扩展性。该方法在工作流程的每个环节高效去除杂质，包括核酸、LPS、代谢物和宿主细胞蛋白。我们实验室以往的研究表明，该方法适用于多种ELP构造，无论序列长度或等电点如何（见图1），使其成为ITC^7、9、18的有前景替代方案。与高度依赖ELP热响应行为且需要多次加热和冷却循环的ITC不同，该方法将过程简化为单步分区策略，具有高纯度和可重复性。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-巯基乙醇	生物辐射	161-0710	SDS-PAGE 组件
30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺	TCI	A3218	SDS-PAGE 组件
乙酮	费舍尔科学	A949	有机溶剂
乙腈	费舍尔科学	A996	有机溶剂
氨基林	金生物奖——金生物技术奖	A-301-25	抗生素
APS（过硫酸铵）	生物辐射	1610700	SDS-PAGE 组件
丁醇	费舍尔科学	L13171	有机溶剂
EDTA	费舍尔生物试剂	BP118-500	裂解缓冲液组件
乙醇	Decon实验室	UN1170	有机溶剂
乙酸乙酯	费舍尔科学	E195	有机溶剂
甘油	国际研究产品	G22020-0.5	Terrific Broth（TB）介质成分
盐酸	费舍尔科学	A144SI-212	裂解缓冲液组件
即时库马西染色	阿布卡姆	AB119211	SDS-PAGE 组件
IPTG	金生物奖——金生物技术奖	12481C25	蛋白质表达成分
异丙醇	费舍尔科学	A451-1	有机溶剂
K2HPO4（磷酸钾单碱性）	沃德的科学	470302-246	第二部分 缓冲组件
KH2PO4（磷酸二碱基钾）	沃德的科学	470302-254	第二部分 缓冲组件
L-脯氨酸	国际研究产品	P5200-500.0	Terrific Broth（TB）介质成分
溶菌酶	金生物奖——金生物技术奖	L-040-1	裂解缓冲液组件
甲醇	费舍尔科学	A452	有机溶剂
原生样本缓冲液	生物辐射	161-0738	SDS-PAGE 组件
蛋白质阶梯	金生物奖——金生物技术奖	P008-500	SDS-PAGE 组件
分辨凝胶缓冲液	生物辐射	1610798	SDS-PAGE 组件
索迪姆二德基硫酸盐（SDS）	热力科学	J18220-36	SDS-PAGE 组件
氢氧化钠	费舍尔科学	S318-500	裂解缓冲液组件
堆叠凝胶缓冲	生物辐射	1610799	SDS-PAGE 组件
TEMED	生物辐射	1610801	SDS-PAGE 组件
特里斯基地	费舍尔生物试剂	BP-152	裂解缓冲液组件
特氨酸	国际研究产品	T60065-1000.0	Terrific Broth（TB）介质成分
酵母提取物	国际研究产品	Y20025-1000.0	Terrific Broth（TB）介质成分